【摘 要】 目的 為更好地將成肌細(xì)胞應(yīng)用于組織工程構(gòu)建，探討IGF-1 對(duì)原代人胚骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖與分化的作用與機(jī)制。 方法 通過核素3H-TdR 摻入法測(cè)定不同濃度IGF-1（1、2、4、8、16 和32 ng/mL）作用下成肌細(xì)胞的每分鐘射線脈沖數(shù)（count per minute，CPM）值，根據(jù)濃度-CPM 值量效曲線確定IGF-1 促增殖的適宜濃度。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入該濃度的IGF-1 用于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞僅接受生長(zhǎng)培養(yǎng)基。分別觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組生長(zhǎng)曲線，比較兩組細(xì)胞增殖周期的變化。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)及核素?fù)饺敕y(cè)定適宜濃度IGF-1 作用下，成肌細(xì)胞增殖周期的變化。另選取不同濃度IGF-1（0、5、10、15、20、25、30 ng/mL）作用于成肌細(xì)胞，觀察4 d 后成肌細(xì)胞融合率，通過融合率-IGF-1濃度- 量效曲線確定IGF-1 促進(jìn)成肌細(xì)胞融合的最佳濃度，并將其用于實(shí)驗(yàn)組，而未接受該濃度IGF-1 的成肌細(xì)胞作為對(duì)照組，分別測(cè)定兩組細(xì)胞融合率與磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）含量并進(jìn)行比較。 結(jié)果 5 ng/mL 的IGF-1 為促成肌細(xì)胞增殖最佳濃度。對(duì)照組成肌細(xì)胞倍增時(shí)間為96 h；實(shí)驗(yàn)組成肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線左移，倍增時(shí)間縮短為60 h。對(duì)照組DNA G1、S 期與G2M 期各亞周期所占時(shí)間分別是70.03、25.01 與0.96 h，實(shí)驗(yàn)組為22.66、16.47 與20.87 h。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成肌細(xì)胞CPM 峰值出現(xiàn)的時(shí)間分別是48 h 與96 h，與生長(zhǎng)曲線流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定結(jié)果一致。IGF-1 促進(jìn)分化研究顯示20 ng/mL IGF-1 為促成肌細(xì)胞分化最佳濃度。實(shí)驗(yàn)組成肌細(xì)胞融合率較對(duì)照組提高30%，CK 合成量提高2 000 mU/mL。 結(jié)論 IGF-1 對(duì)成肌細(xì)胞的增殖與分化均具有促進(jìn)作用，是通過減少 G1 期成肌細(xì)胞數(shù)量，增加S 期與G2M 期細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。20 ng/mL IGF-1 能明顯增加成肌細(xì)胞融合率CK 合成。
【摘 要】 目的 探討應(yīng)用TGF-β1 和IGF-1 基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 后，目的基因分泌情況及向軟骨細(xì)胞的分化效果，為構(gòu)建新型的組織工程軟骨種子細(xì)胞提供思路。 方法 6 周齡健康雄性Wistar 大鼠2 只，體重約150 g。擴(kuò)增、提取質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1，酶切、電泳鑒定并測(cè)序。采用密度梯度離心法和貼壁分離法，分離、純化Wistar 大鼠BMSCs，倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代BMSCs 形態(tài)學(xué)改變，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志。將TGF-β1 和IGF-1 基因單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs，按轉(zhuǎn)染情況分為5 組：未轉(zhuǎn)染組（A 組）、轉(zhuǎn)染空載體組（B 組）、轉(zhuǎn)染TGF-β1 組（C 組）、轉(zhuǎn)染IGF-1 組（D 組）、TGF-β1 與 IGF-1 共轉(zhuǎn)染組（E 組）。對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行篩選，MTT 法測(cè)定篩選后細(xì)胞的增殖活性，RTPCR和Western blot 法檢測(cè)篩選后細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果 電泳顯示IGF-1 和TGF-β1 兩目的基因條帶，基因測(cè)序與Gene-Bank cDNA序列相符。大鼠BMSCs 原代細(xì)胞接種24 h 后可見少量貼壁突起細(xì)胞，4、5 d 開始形成典型的BMSCs 簇狀增生，9、10 d 細(xì)胞生長(zhǎng)即可達(dá)80% ～ 90% 融合；傳代后細(xì)胞形態(tài)較均一。免疫熒光法檢測(cè)BMSCs 的CD29、CD44 呈陽(yáng)性反應(yīng)，CD34、CD45 呈陰性反應(yīng)。轉(zhuǎn)染24 h 后有少量細(xì)胞死亡，篩選3 周后細(xì)胞克隆形成，至第4 周細(xì)胞可傳代，多數(shù)細(xì)胞變成多邊形，部分細(xì)胞邊界不清，呈圓形，核偏位，核周顆粒明顯。MTT 法測(cè)定A、B、C、D、E 組細(xì)胞在490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A ）值，分別為0.432 ± 0.038、0.428 ± 0.041、0.664 ± 0.086、0.655 ± 0.045 和0.833 ± 0.103。A、B 組與C、D、E 組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01），但A、B 組以及C、D、E 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)目的基因和蛋白的表達(dá)量，TGF-β1 表達(dá)以C 組最多，分別為0.925 0 ± 0.022 0、124.341 7 ± 2.982 0，E 組次之，分別為0.771 7 ±0.012 0、101.766 7 ± 1.241 0（P lt; 0.01）；IGF-1 表達(dá)以E 組最多，分別為1.020 0 ± 0.026 0、128.171 7 ± 9.152 0, D 組次之，分別為0.465 0 ± 0.042 0、111.045 0 ± 6.248 0（P lt; 0.01）；II 型膠原表達(dá)以E 組最多，分別為0.980 0 ± 0.034 0、120.355 0 ±12.550 0，C 組次之，分別為0.720 0 ± 0.026 0、72.246 7 ± 7.364 0（P lt; 0.01）。 結(jié)論 通過TGF-β1 和IGF-1 基因共同轉(zhuǎn)染BMSCs 修復(fù)軟骨缺損是一個(gè)較有前景的發(fā)展方向，對(duì)組織工程軟骨應(yīng)用于臨床具有重要意義。
目的探討體外轉(zhuǎn)染人IGF-1（human IGF-1，hIGF-1）基因腺病毒載體（Ad-hIGF-1）對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的兔椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響。 方法取8只健康成年家兔（雌雄不限，體重2.0～2.5 kg）椎間盤髓核，以Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞。取第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期髓核細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為3組。空白組：以含10%PBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；TNF-α組：在空白組培養(yǎng)基中加入100 ng/mL TNF-α；Ad-hIGF-1組：在TNF-α組培養(yǎng)基中加入感染復(fù)數(shù)為50的Ad-hIGF-1。熒光顯微鏡下觀察Ad-hIGF-1組病毒轉(zhuǎn)染情況。各組培養(yǎng)48 h后，行RT-PCR及Western blot檢測(cè)hIGF-1 mRNA和蛋白表達(dá)，TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果熒光顯微鏡下觀察示，Ad-hIGF-1組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR及Western blot檢測(cè)示，Ad-hIGF-1組可見hIGF-1 mRNA及蛋白表達(dá)條帶，而空白組和TNF-α組均未見。TUNEL法檢測(cè)示，TNF-α組、Ad-hIGF-1組及空白組細(xì)胞凋亡率分別為34.24% ± 4.60%、6.59% ± 1.03%、0.40% ± 0.15%；流式細(xì)胞儀檢測(cè)示，TNF-α組、Ad-hIGF-1組、空白組早期凋亡率分別為22.16% ± 2.69%、5.03% ± 0.96%、0.49% ± 0.05%，晚期凋亡率分別為13.96% ± 4.86%、10.68% ± 3.42%、0.29% ± 0.06%；以上檢測(cè)指標(biāo)TNF-α組均顯著高于空白組、Ad-hIGF-1組（P lt; 0.05），Ad-hIGF-1組高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論hIGF-1基因?qū)NF-α體外誘導(dǎo)的兔髓核細(xì)胞凋亡有抑制作用。
目的 探討靜水壓聯(lián)合IGF-1對(duì)體外單層培養(yǎng)的山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞絲狀肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）的影響，分析靜水壓、IGF-1與F-actin的關(guān)系變化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為改變的影響。 方法取4只1月齡山羊雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)盤，采用酶消化法分離培養(yǎng)顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，以Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色鑒定。取第2、3代細(xì)胞根據(jù)干預(yù)方法不同分為4組：A組以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為對(duì)照；B組以強(qiáng)度0.2 MPa、頻率1 Hz的靜水壓作用3 h；C組以含10 ng/mL IGF-1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；D組采用靜水壓與IGF-1聯(lián)合培養(yǎng)，方法同B、C組。于干預(yù)后24、72 h行免疫熒光染色觀察F-actin變化，測(cè)定單個(gè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。 結(jié)果經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)染色鑒定，所培養(yǎng)細(xì)胞為顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞。干預(yù)24 h時(shí)A、C組細(xì)胞熒光染色強(qiáng)，保持了細(xì)胞正常形態(tài)，且分布清晰；B組F-actin排列紊亂；D組F-actin變細(xì)，排列混亂。72 h時(shí)A、C組F-actin排列整齊；B組F-actin排列紊亂、模糊不清，部分F-actin斷裂，形成偽足；D組F-actin變細(xì)，排列紊亂、斷裂。隨時(shí)間延長(zhǎng)，A、B、D組熒光強(qiáng)度均呈增強(qiáng)趨勢(shì)，兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；C組兩時(shí)間點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.284，P=0.781）。干預(yù)24 h，C組熒光強(qiáng)度最高，B組最低，與A、D組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。72 h時(shí)，B、D組熒光強(qiáng)度顯著低于A、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；B、D組間及A、C組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論靜水壓可以引起山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞F-actin發(fā)生斷裂及重排，IGF-1上調(diào)F-actin的表達(dá)；靜水壓聯(lián)合IGF-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的F-actin斷裂、重排可能引起細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。
目的 探討殼聚糖（chitosan，CS）介導(dǎo)IGF-1 基因（igf-1）局部轉(zhuǎn)染對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的作用。 方 法 3 月齡健康雄性大耳白家兔12 只，體重2.0 ～ 2.5 kg，隨機(jī)分為對(duì)照組和干預(yù)組（n=6）。其中對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)為正常對(duì)照組，右側(cè)為生理鹽水對(duì)照組；干預(yù)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)為CS 干預(yù)組，右側(cè)為CS/igf-1 干預(yù)組。后3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別制備兔膝關(guān)節(jié)外側(cè)髁軟骨缺損模型，正常對(duì)照組不制備。CS/igf-1 干預(yù)組于術(shù)后當(dāng)日關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射CS/igf-1 復(fù)合物0.5 mL，每周2 次，共4 周；CS 干預(yù)組注射等體積CS 溶液；正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組注射等體積生理鹽水。術(shù)后28 d，取關(guān)節(jié)軟骨組織，分別行組織學(xué)觀察和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖基因表達(dá)。 結(jié)果 HE染色及甲苯胺藍(lán)染色示，CS/igf-1 干預(yù)組及CS 干預(yù)組損傷部位均有明顯軟骨性修復(fù)，前者明顯優(yōu)于后者，同時(shí)均可見纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；生理鹽水對(duì)照組僅見大量纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯軟骨性修復(fù)。正常對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組、CS 干預(yù)組、CS/igf-1 干預(yù)組Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖基因相對(duì)含量均依次增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 CS/igf-1 復(fù)合物可增加軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖基因的表達(dá)，促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)。
目的探討可磷酸化短肽（phosphorylatable short peptide，pSP）偶聯(lián)殼聚糖（chitosan，CS）（pSP-CS），攜載IGF-1和IL-1受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）基因，局部轉(zhuǎn)染促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的作用。 方法構(gòu)建pBudCE4.1-IL-1Ra、pBudCE4.1-IGF-1及pBudCE4.1-IL-1Ra+IGF-1質(zhì)粒，以pSP偶聯(lián)CS形成pSP-CS，將以上重組質(zhì)粒分別與其復(fù)合形成pSP-CS/質(zhì)粒DNA（pDNA）復(fù)合物。取3月齡健康雄性新西蘭大耳白兔30只，體重2.0～2.5 kg，雙側(cè)后肢隨機(jī)分為5組（n=12）。假手術(shù)組（A組）僅暴露股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面，pSP-CS/pBudCE4.1干預(yù)組（B組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干預(yù)組（C組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干預(yù)組（D組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra+IGF-1干預(yù)組（E組）制備膝關(guān)節(jié)外側(cè)髁軟骨缺損模型。術(shù)后1周，各干預(yù)組給予對(duì)應(yīng)pSP-CS/pDNA復(fù)合物，共7周；A組注射等量生理鹽水。術(shù)后觀察動(dòng)物一般情況，8周時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取關(guān)節(jié)腔灌洗液ELISA分析IL-1Ra及IGF-1含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)缺損區(qū)軟骨組織聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）、MMP抑制劑1（MMP inhibitor 1，TIMP-1）mRNA表達(dá)；阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫（alcian blue-periodic acid/schiff，ABPAS）染色及Aggrecan免疫組織化學(xué)染色鑒定損傷區(qū)新生細(xì)胞的軟骨細(xì)胞表型，分析Aggrecan染色吸光度（A）值。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后無感染及死亡。各干預(yù)組關(guān)節(jié)腔灌洗液中檢測(cè)到大量外源蛋白IGF-1和IL-1Ra，其中D、E組IGF-1含量以及C、E組IL-1Ra含量顯著高于A組（P＜0.05）。E組Aggrecan和TIMP-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，MMP-3 mRNA表達(dá)下調(diào)，明顯優(yōu)于C、D組（P＜0.05）。C、D、E組缺損處出現(xiàn)不同程度軟骨性修復(fù)，AB-PAS染色及Aggrecan免疫組織化學(xué)染色均為陽(yáng)性，且E組作用明顯優(yōu)于C、D組（P＜0.05）；B組缺損處僅被大量纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯軟骨性修復(fù)。 結(jié)論pSP-CS是一種較理想的基因載體，可攜載治療基因有效進(jìn)入兔關(guān)節(jié)軟骨組織；IL-1Ra與IGF-1協(xié)同作用明顯促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)。
目的探討微骨折技術(shù)聯(lián)合IGF-1治療兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的療效。 方法4～6月齡新西蘭大白兔24只，體重2.5～3.5 kg，雌雄不限，隨機(jī)分為4組（n=6）：微骨折技術(shù)聯(lián)合重組人IGF-1（recombinant human IGF-1，rhIGF-1）組（A組）、微骨折技術(shù)對(duì)照組（B組）、rhIGF-1 對(duì)照組（C組）和空白對(duì)照組（D組）。各組于大白兔雙后肢髕股關(guān)節(jié)股骨側(cè)關(guān)節(jié)面中心制備8 mm×6 mm全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，A、B組同時(shí)行微骨折術(shù)。術(shù)后A、C組每側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 mL rhIGF-1（0.01 μg/μL），每周3次，連續(xù)4周；B、D組對(duì)應(yīng)注射等量生理鹽水。術(shù)后觀察各組動(dòng)物一般情況，于4、12、24 周處死取材，行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察，按照Wakitani 等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行組織學(xué)評(píng)分；24 周時(shí)采用改良羥脯氨酸（hydroxyproline，HPR）法測(cè)定各組修復(fù)組織和正常兔后肢髕股關(guān)節(jié)軟骨的膠原含量，同時(shí)A、B組行透射電鏡和掃描電鏡觀察。 結(jié)果各組動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。大體觀察示，隨時(shí)間延長(zhǎng)，A組缺損區(qū)域逐漸修復(fù)，24周時(shí)修復(fù)組織與鄰近正常軟骨無區(qū)別；B組修復(fù)組織較平整，與正常軟骨界線模糊；C、D組修復(fù)組織不平整，與鄰近正常軟骨界線仍清晰。組織學(xué)染色顯示與大體觀察一致，A組24周時(shí)修復(fù)組織與正常軟骨細(xì)胞無明顯區(qū)別；B組見較多的橢圓形類軟骨細(xì)胞，基質(zhì)染色較淺；C、D組見少許小梭形纖維細(xì)胞。術(shù)后4、12、24周參照Wakitani等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，A組明顯優(yōu)于其余各組（P＜0.05）。電鏡觀察示，術(shù)后24周A組修復(fù)組織表面光滑，可見軟骨陷窩，軟骨細(xì)胞位于陷窩內(nèi)，含有糖原顆粒，周圍可見膠原纖維，明顯優(yōu)于B組。膠原含量檢測(cè)結(jié)果顯示，A組修復(fù)組織的膠原含量明顯高于其他組（P＜0.05），但仍低于正常軟骨組織（P＜0.05）。 結(jié)論微骨折技術(shù)聯(lián)合IGF-1治療兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損以透明軟骨形式修復(fù)。
目的通過慢病毒介導(dǎo)環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2, COX-2）-siRNA、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）-siRNA、IGF-1基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染BMSCs，將其注射至食蟹猴骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）模型關(guān)節(jié)腔，探討對(duì)OA相關(guān)炎性因子及關(guān)節(jié)軟骨的影響。 方法取髖關(guān)節(jié)OA患者自愿捐贈(zèng)骨髓組織，分離培養(yǎng)BMSCs。采用基因重組技術(shù)構(gòu)建COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1過表達(dá)基因的慢病毒載體，以最佳感染復(fù)數(shù)40轉(zhuǎn)染第3代BMSCs（病毒組），以空慢病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)作為對(duì)照（空病毒組），以正常BMSCs作為正常對(duì)照組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并行細(xì)胞計(jì)數(shù)；取轉(zhuǎn)染培養(yǎng)1周細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表達(dá)。取健康3歲食蟹猴9只，按照Hulth造模法于右膝制備OA模型后，隨機(jī)分為3組（n=3）。模型制備術(shù)后6周，病毒組及空病毒組右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射對(duì)應(yīng)的1 mL BMSCs（約1×107個(gè)），空白對(duì)照組注射1 mL生理鹽水。以左膝作為正常對(duì)照組。注射后觀察動(dòng)物一般情況；1、4、6周取雙膝關(guān)節(jié)液，ELISA檢測(cè)前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1濃度；6周時(shí)MRI及大體觀察檢查膝關(guān)節(jié)軟骨改變，并取材行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色觀察，以及RT-PCR檢測(cè)COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表達(dá)。 結(jié)果轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)曲線無明顯差異。RT-RCR檢測(cè)，與空病毒組、正常對(duì)照組比較，病毒組COX-2、Aggrecanase-1表達(dá)明顯降低，IGF-1表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。細(xì)胞注射后各組動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。注射后1、4、6周，病毒組PGE2、Aggrecanase-1、IL-1濃度明顯低于空病毒組、空白對(duì)照組，但I(xiàn)GF-1濃度明顯增高（P＜0.05）；但3組以上指標(biāo)濃度均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。MRI檢查示，與正常對(duì)照組比較，病毒組、空病毒組及空白對(duì)照組關(guān)節(jié)面均出現(xiàn)異常高密度影，但病毒組區(qū)域最小。大體觀察及組織學(xué)觀察見，病毒組、空病毒組及空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨符合早期OA改變，但病毒組修復(fù)程度優(yōu)于空病毒組及空白對(duì)照組，根據(jù)改良Pineda評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)評(píng)分亦較低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色示，病毒組細(xì)胞質(zhì)染色較空病毒組及空白對(duì)照組深，偶爾可見棕黃色顆粒，軟骨細(xì)胞較多。RT-PCR檢測(cè)，與空病毒和空白對(duì)照組相比，病毒組COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表達(dá)明顯降低，IGF-1 mRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.05）。 結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的多基因轉(zhuǎn)染BMSCs可以有效抑制食蟹猴早期OA模型膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)COX-2和Aggrecanse-1的表達(dá)，增強(qiáng)IGF-1的表達(dá)，降低膝關(guān)節(jié)內(nèi)炎性因子濃度，有效保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。
目的初步研究瑞香素（dephnetin，DAP）聯(lián)合 IGF-1 基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）成軟骨分化的影響。方法采用酶消化法分離培養(yǎng)大鼠 ADSCs。取第 3 代 ADSCs 以 IGF-1 基因轉(zhuǎn)染作為實(shí)驗(yàn)組，未轉(zhuǎn)染的 ADSCs 作為對(duì)照組。兩組細(xì)胞分別用不同濃度 DAP（0、30、60、90 μg/mL）處理，培養(yǎng) 72 h 后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；培養(yǎng) 14 d 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測(cè)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA 和蛋白表達(dá)，并行甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察。結(jié)果CCK-8 法檢測(cè)示，隨 DAP 作用濃度增加，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度（A）值均逐漸增加（P<0.05）；相同 DAP 濃度下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A值顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測(cè)示，隨 DAP 作用濃度增加，對(duì)照組細(xì)胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，各濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組（P<0.05）。相同 DAP 濃度下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。甲苯胺藍(lán)染色示，隨 DAP 作用濃度增加，對(duì)照組內(nèi)和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)細(xì)胞著色無明顯差異；相同 DAP 濃度下，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞著色略深。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色示，隨 DAP 作用濃度增加，對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色無明顯差異；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色逐漸加深，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組明顯深于 0 μg/mL DAP 濃度組。相同 DAP 濃度下，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞著色明顯加深。結(jié)論DAP 對(duì)大鼠 ADSCs 增殖有一定促進(jìn)作用；單獨(dú)使用 DAP 誘導(dǎo)大鼠 ADSCs 向軟骨細(xì)胞分化作用極微弱，但 DAP 聯(lián)合 IGF-1 基因轉(zhuǎn)染有明顯協(xié)同作用，促進(jìn) ADSCs 成軟骨分化。
目的觀察比較人正常和退變髓核的細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)差異，并研究 IFG-1 和 PDGF 對(duì)人退變髓核的修復(fù)作用。方法取患者自愿捐贈(zèng)的人退變及正常髓核組織，一部分制作成組織切片，進(jìn)行 HE 染色觀察髓核退變前后形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)染色觀察Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、B 淋巴細(xì)胞瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X（Bcl-2 associate X，Bax）蛋白表達(dá)；另一部分髓核組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot 檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。然后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分為 4 組，A 組為退變髓核細(xì)胞；B、C、D 組分別用 IGF-1 基因慢病毒顆粒、PDGF 基因慢病毒顆粒和攜帶 IGF-1、PDGF 雙基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染退變髓核細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 21 d，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞 IGF-1 和 PDGF 陽(yáng)性率，免疫組織化學(xué)染色和 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果HE 染色示，正常組中央髓核組織可見大量脊索細(xì)胞和少量類軟骨細(xì)胞；而退變組髓核細(xì)胞明顯減少，且髓核組織內(nèi)可見大量纖維軟骨組織。免疫組織化學(xué)染色示，退變組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著高于正常組，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot 檢測(cè)示，退變組Ⅱ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常組（t=65.493，P=0.000）?；蜣D(zhuǎn)染后 21 d，與 A 組比較，B、C、D 組細(xì)胞活性增加，形態(tài)變得較為規(guī)則。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示 B、D 組 IGF-1 陽(yáng)性率較 A 組明顯增高，C、D 組PDGF 陽(yáng)性率較 A 組明顯增高（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色觀察示，A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色情況依次為（±）、（+）、（+）、（++）。Western blot 檢測(cè)示，A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論IGF-1 與 PDGF 均能逆轉(zhuǎn)椎間盤髓核細(xì)胞的退變且二者具有協(xié)同作用，為其今后應(yīng)用于臨床治療椎間盤退變性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。