【摘 要】 目的 探討應(yīng)用TGF-β1 和IGF-1 基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 后，目的基因分泌情況及向軟骨細(xì)胞的分化效果，
為構(gòu)建新型的組織工程軟骨種子細(xì)胞提供思路。 方法 6 周齡健康雄性Wistar 大鼠2 只，體重約150 g。擴(kuò)增、提取質(zhì)
粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1，酶切、電泳鑒定并測序。采用密度梯度離心法和貼壁分離法，分離、純化Wistar 大鼠BMSCs，倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代BMSCs 形態(tài)學(xué)改變，免疫熒光法檢測細(xì)胞表面標(biāo)志。將TGF-β1 和IGF-1 基
因單獨或共轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs，按轉(zhuǎn)染情況分為5 組：未轉(zhuǎn)染組（A 組）、轉(zhuǎn)染空載體組（B 組）、轉(zhuǎn)染TGF-β1 組（C 組）、轉(zhuǎn)染IGF-1 組（D 組）、TGF-β1 與 IGF-1 共轉(zhuǎn)染組（E 組）。對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行篩選，MTT 法測定篩選后細(xì)胞的增殖活性，RTPCR和Western blot 法檢測篩選后細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果 電泳顯示IGF-1 和TGF-β1 兩目的基因條帶，基因測序與Gene-Bank cDNA序列相符。大鼠BMSCs 原代細(xì)胞接種24 h 后可見少量貼壁突起細(xì)胞，4、5 d 開始形成典型的BMSCs 簇狀增生，9、10 d 細(xì)胞生長即可達(dá)80% ～ 90% 融合；傳代后細(xì)胞形態(tài)較均一。免疫熒光法檢測BMSCs 的CD29、CD44 呈陽性反應(yīng)，CD34、CD45 呈陰性反應(yīng)。轉(zhuǎn)染24 h 后有少量細(xì)胞死亡，篩選3 周后細(xì)胞克隆形成，至第4 周細(xì)胞可傳代，多數(shù)細(xì)胞變成多邊形，部分細(xì)胞邊界不清，呈圓形，核偏位，核周顆粒明顯。MTT 法測定A、B、C、D、E 組細(xì)胞在490 nm 波長處的吸光度（A ）值，分別為0.432 ± 0.038、0.428 ± 0.041、0.664 ± 0.086、0.655 ± 0.045 和0.833 ± 0.103。A、B 組與C、D、E 組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01），但A、B 組以及C、D、E 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。RT-PCR 和Western blot 檢測目的基因和蛋白的表達(dá)量，TGF-β1 表達(dá)以C 組最多，分別為0.925 0 ± 0.022 0、124.341 7 ± 2.982 0，E 組次之，分別為0.771 7 ±0.012 0、101.766 7 ± 1.241 0（P lt; 0.01）；IGF-1 表達(dá)以E 組最多，分別為1.020 0 ± 0.026 0、128.171 7 ± 9.152 0, D 組次之，分別為0.465 0 ± 0.042 0、111.045 0 ± 6.248 0（P lt; 0.01）；II 型膠原表達(dá)以E 組最多，分別為0.980 0 ± 0.034 0、120.355 0 ±12.550 0，C 組次之，分別為0.720 0 ± 0.026 0、72.246 7 ± 7.364 0（P lt; 0.01）。 結(jié)論 通過TGF-β1 和IGF-1 基因共同轉(zhuǎn)染BMSCs 修復(fù)軟骨缺損是一個較有前景的發(fā)展方向，對組織工程軟骨應(yīng)用于臨床具有重要意義。
引用本文： 付勤,于冬冬,王勇,付永慧,宮樹一. TGF-β1和 IGF-1共同轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的實驗研究. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2008, 22(2): 157-162. doi: 復(fù)制