引用本文： 申宁, 席晓云, 李飞, 吕超亮, 张普晟. 瑞香素联合IGF-1对大鼠脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(6): 743-749. doi: 10.7507/1002-1892.201812063 复制
由于创伤、骨关节炎、感染等原因导致的关节软骨损伤在骨科临床常见。关节软骨的组织学特性决定了其自身修复能力有限，损伤后如不治疗，缺损可能继续增大，导致软骨合成、分解代谢障碍，最终引起关节软骨功能丧失[1]。软骨组织工程学的发展为治疗关节软骨损伤提供了新的契机，应用组织工程软骨修复软骨缺损成为近年热门研究方向。
脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的成体干细胞，具有多向分化潜能[2]。近年的软骨组织工程研究显示，ADSCs 具有很强的成软骨能力，且能保持稳定的软骨细胞表型[3-4]。IGF-1 是促进软骨细胞发育的重要生长因子之一，在细胞分裂增殖及细胞外基质的分泌过程中起重要作用[5]，能够有效诱导 ADSCs 成软骨分化[6]。瑞香素（dephnetin，DAP）又名祖师麻甲素，化学名 7，8-二羟基香豆素，是香豆素类化合物的代表性单体成分，是金边瑞香中的主要提取物[7]，临床上可用于关节退行性疾病的治疗。但目前关于 DAP 对 ADSCs 成软骨分化影响的研究较少，我们设想 DAP 对 ADSCs 成软骨分化有促进作用，以期为临床治疗软骨损伤提供新的思路。我们以大鼠 ADSCs 作为种子细胞，联合应用 IGF-1 基因转染技术和 DAP 处理，观察二者联合对于大鼠 ADSCs 成软骨分化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，体质量 200～250 g，由山东省实验动物中心提供。动物实验经济宁医学院实验动物伦理委员会批准，实验动物使用许可证批准号：SYXK（鲁）20180002。
DMEM 培养基、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、FBS、PCR 引物（Thermo Fisher 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化工，日本）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；IGF-1、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖（Aggrecan）抗体（Abcam 公司，英国）；过表达 IGF-1 的重组慢病毒（上海吉玛制药技术有限公司），且慢病毒均带有绿色荧光标记；DAP 标准品（北京索莱宝科技有限公司）；CD29、CD34、CD45及CD105 抗体（eBioscience 公司，美国）；即用型 SABC-POD（兔 IgG）试剂盒、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。CO2 细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；倒置荧光显微镜（南京江南永新光学有限公司）；酶联免疫检测仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 大鼠 ADSCs 分离与培养
取 5 只 SD 大鼠，腹腔注射过量水合氯醛麻醉致死，75% 乙醇浸泡 5 min 后，无菌条件下取出腹股沟脂肪组织。用含 1% 青链霉素双抗的 PBS 冲洗 3 次，仔细剥离去除脂肪组织上的血管。将脂肪组织剪碎后转移至 10 mL 离心管中，加入 5 倍体积的 0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，37℃ 恒温水浴消化 90 min。消化完成后，加入等量含 10%FBS 的 DMEM 培养基终止消化，过 200 目细胞筛去除大块组织；以离心半径 15 cm、1 500 r/min 离心 10 min，去除上清。加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞并计数，按 2×105个/孔密度接种至 6 孔板，于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。48 h 后首次换液，PBS 冲洗 2 次以去除未贴壁细胞，之后每 2 天换液 1 次。待细胞生长融合至 80%～90% 时，进行传代培养。倒置荧光显微镜观察细胞形态变化；取第 3 代 ADSCs 进行流式鉴定细胞表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105 表达。
1.3 实验分组及方法
1.3.1 IGF-1 基因转染
取状态良好的第 3 代 ADSCs，以 3×105个/孔密度铺于 6 孔板，37℃、5%CO2 细胞培养箱培养过夜，待细胞生长至 80% 汇合度时进行转染。从超低温冰箱取出携带 IGF-1 基因的慢病毒原液，冰浴溶化后用含 10%FBS 的 DMEM 准确稀释；吸弃原孔板中的培养基，加入 1 mL 已稀释的病毒液，轻轻晃匀。37℃、5%CO2 细胞培养箱孵育 6 h 后，更换新鲜培养液。48 h 后倒置荧光显微镜下观察荧光表达及细胞生长情况；并取适量转染后细胞，采用 Western blot 检测 IGF-1 蛋白表达，以未转染的 ADSCs 作为对照组；其余细胞及时换液。
Western blot 检测方法：收集细胞，用 RIPA 裂解液冰上裂解细胞 30 min 后，于 4℃ 以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 10 min，取上清；加适量上样缓冲液，沸水中煮 5 min 制备蛋白样品；经 12%SDS-PAGE 100 V 恒压电泳，250 mA 恒流湿转膜 90 min，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；5% 脱脂牛奶封闭 1 h 后，分别加入 IGF-1（1∶200）或 β-actin（1∶2 000）抗体，4℃ 孵育过夜；TBST 洗 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000），室温下孵育 1 h，TBST 洗 4 次后行 ECL 显色发光。采用 Image J 软件进行灰度值分析，以目标蛋白与 β-actin 的灰度值比值作为蛋白相对表达量。
1.3.2 实验分组
取未转染的 ADSCs（对照组）和 IGF-1 基因转染 48 h 的 ADSCs（实验组），采用 0.25% 胰蛋白酶消化，调整细胞密度为 2.5×105个/mL，接种于 96 孔板，每孔 100 μL，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱过夜。细胞完全贴壁后，吸弃培养基，换成含不同浓度 DAP（0、30、60、90 μg/mL）的 10%FBS DMEM 培养基继续培养。每组每个浓度设 5 个复孔。
1.4 观测指标
1.4.1 CCK-8 法检测细胞增殖活性
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 72 h 后细胞，于培养结束前 1 h 每孔分别加入 CCK-8 试剂 10 μL，37℃、5%CO2 细胞培养箱培养 1 h，酶联免疫检测仪检测 450 nm 处吸光度（A）值。
1.4.2 实时荧光定量 PCR 检测基因表达
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 14 d 的细胞，抽提总 RNA，逆转录为 cDNA。使用 Primer Premier 5.0 软件设计目的基因的检测引物，委托 Thermo Fisher 公司合成。引物序列：Ⅱ型胶原上游 5′-GCTCCCAGAACATCACCTACCA-3′，下游 5′-ACAGTCTTGCCCCACTTACCG-3′；Aggrecan 上游 5′-AGGTCGTGGTGAAAGGTGTTGTG-3′，下游 5′-TGGTGGAAGCCATCCTCGTAG-3′。采用 20 μL 反应体系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后 ddH2O 补足体积，混匀后上机检测。反应条件：95℃ 预变性 10 min，95℃ 变性 15 s，58℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，40 个循环。以 β-actin 为内参，采用 2−ΔΔCt法计算成软骨相关基因Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量。
1.4.3 Western blot 检测蛋白表达
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 14 d 的细胞，0.25% 胰蛋白酶消化后收集细胞，参照 1.3.1 方法行 Western blot 检测 Ⅱ型胶原（1∶200）和 Aggrecan（1∶500）蛋白表达。
1.4.4 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 14 d 的细胞爬片，4% 多聚甲醛固定细胞。每组取一半玻片浸泡于甲苯胺蓝染色液中 5 min 后，蒸馏水冲洗、干燥封片，光镜下观察。另一半玻片用 5% 牛血清白蛋白于 37℃ 封闭 1 h，加入兔抗Ⅱ型胶原抗体，湿盒 37℃ 孵育 2 h，PBS 冲洗后加生物素化山羊抗兔 IgG 二抗，湿盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 SABC 试剂湿盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 DAB 显色剂显色 10 min，苏木素复染，蒸馏水冲洗后封片，倒置荧光显微镜观察。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各浓度组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞转染前后观察
分离出的 ADSCs 接种于细胞培养皿，24 h 时多数细胞贴壁；换液后，48～72 h 大部分贴壁细胞伸展；7 d 左右可见细胞生长达 80% 融合度，细胞呈纺锤形或长梭形，排列有序，漩涡状生长。流式细胞仪检测细胞表面抗原示，CD29、CD105 阳性率分别为 97.4% 和 95.3%，CD34、CD45 阳性率分别为 1.8% 和 1.2%。IGF-1 基因转染 48 h 后，倒置荧光显微镜观察，ADSCs 荧光阳性细胞比达 90% 以上。Western blot检测显示，转染后细胞 IGF-1 蛋白相对表达量为 0.513±0.007，明显高于未转染细胞的 0.154±0.009，差异有统计学意义（t=31.490，P=0.001）。见图 1~3。
图1
大鼠 ADSCs 形态学观察（倒置荧光显微镜×200）
a. 转染前培养 7 d；b. IGF-1 基因转染 48 h
Figure1. Morphological observation of rat ADSCs (Inverted fluorescence microscope×200)a. Cultured for 7 days before transfection; b. Transfection of IGF-1 gene for 48 hours
图2
流式细胞仪检测大鼠 ADSCs 表面抗原表达
a. CD29；b. CD34；c. CD105；d. CD45
Figure2. Detection of ADSCs surface antigen expressions by flow cytometrya. CD29; b. CD34; c. CD105; d. CD45
图3
Western blot 检测转染前后 ADSCs 的 IGF-1 蛋白表达
1：转染前 2：转染后
Figure3. Detection of IGF-1 protein expression of ADSCs before and after transfections by Western blot1: Before transfection 2: After transfection
2.2 CCK-8 法检测细胞增殖活性
随 DAP 作用浓度增加，对照组和实验组细胞 A 值均逐渐增加，各浓度组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）；相同 DAP 浓度下，实验组细胞 A 值显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
CCK-8 法检测不同浓度 DAP 对 ADSCs 增殖的影响（n=5，
）
Table1.
Effects of different concentrations of DAPs on ADSCs proliferation detected by CCK-8 assay (n=5, 
)
2.3 实时荧光定量 PCR 检测基因表达
随 DAP 作用浓度增加，对照组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量无明显变化，各浓度组间差异无统计学意义（P>0.05）；实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量逐渐增加，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组显著高于 0 μg/mL DAP 浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。相同 DAP 浓度下，实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
实时荧光定量 PCR 检测对照组和实验组各浓度 DAP 作用下基因表达
a. Ⅱ型胶原；b. Aggrecan
Figure4. Gene expressions in control group and experimental group detected by real-time fluorescence quantitative PCR at different concentrations of DAPsa. Collagen type Ⅱ; b. Aggrecan
2.4 Western blot 检测蛋白表达
随 DAP 作用浓度增加，对照组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量无明显变化，各浓度组间差异无统计学意义（P>0.05）；实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量逐渐增加，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组显著高于 0 μg/mL DAP 浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。相同 DAP 浓度下，实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
Western blot 检测对照组和实验组各浓度 DAP 作用下蛋白表达
a. 电泳图 1：对照组+0 μg/mL DAP 2：对照组+30 μg/mL DAP 3：对照组+60 μg/mL DAP 4：对照组+90 μg/mL DAP 5：实验组+0 μg/mL DAP 6：实验组+30 μg/mL DAP 7：实验组+60 μg/mL DAP 8：实验组+90 μg/mL DAP；b. Ⅱ型胶原蛋白相对表达量；c. Aggrecan 蛋白相对表达量
Figure5. Protein expressions in control group and experimental group detected by Western blot at different concentrations of DAPsa. Electrophoresis map 1: Control group+0 μg/mL DAP 2: Control group+30 μg/mL DAP 3: Control group+60 μg/mL DAP 4: Control group+90 μg/mL DAP 5: Experimental group+0 μg/mL DAP 6: Experimental group+30 μg/mL DAP 7: Experimental group+60 μg/mL DAP 8: Experimental group+90 μg/mL DAP; b. Relative protein expression of collagen type Ⅱ; c. Relative protein expression of Aggrecan
2.5 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
甲苯胺蓝染色示细胞质及细胞膜均呈蓝色，随 DAP 作用浓度增加，对照组和实验组细胞内着色均无明显差异；但相同 DAP 浓度下，实验组比对照组细胞着色略深。见图 6。
图6
对照组和实验组各浓度 DAP 作用下甲苯胺蓝染色观察（×200）
从左至右依次为 0、30、60、90 μg/mL DAP 浓度组 a. 对照组；b. 实验组
Figure6. Toluidine blue staining observation in control group and experimental group with different concentrations of DAPs (×200)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，随 DAP 作用浓度增加，对照组细胞的细胞质内棕黄色着色无明显差异；实验组细胞的细胞质内棕黄色着色逐渐加深，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组明显深于 0 μg/mL DAP 浓度组。相同 DAP 浓度下，实验组比对照组细胞着色明显加深。见图 7。
图7
对照组和实验组各浓度 DAP 作用下Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（倒置荧光显微镜×100）
从左至右依次为 0、30、60、90 μg/mL DAP 浓度组 a. 对照组；b. 实验组
Figure7. Immunohistochemical staining observation of collagen type Ⅱ in control group and experimental group treated with different concentrations of DAPs (Inverted fluorescence microscope×100)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
3 讨论
近年来，生物材料学与细胞学研究的不断深入促进了组织工程技术的发展。软骨组织工程技术在被提出和建立至今二十多年的时间里，得到了迅猛发展[8]。由于自体软骨细胞供区有限、细胞培养增殖困难、体外传代培养容易去分化等诸多问题，限制了自体细胞在软骨修复中的应用[9]。ADSCs 来源于发育早期的中胚层和外胚层，可从全身多处部位提取，来源丰富，与其他来源干细胞相比还具有增殖快、数量众多、免疫原性低、不易造成损伤等优点[10]。脂肪组织也具有向软骨分化的能力[11]，在软骨组织工程中的应用前景广阔[12]。在软骨组织工程构建中，生长因子发挥了重要作用，其中 IGF-1 被认为是调节软骨形成和代谢最关键的细胞因子。Messai 等[13]报道在软骨形成过程中，IGF-1 的作用主要是在转录水平调节 DNA、Aggrecan 和Ⅱ型胶原的分泌率；有研究证实，IGF-1 不仅能促进软骨细胞的Ⅱ型胶原和 Aggrecan 的分泌，而且会同时抑制 Aggrecan 降解[14]。研究显示，应用基因转染技术，显著提高了 IGF-1 和 BMP-2 的生物学效能，促进 ADSCs 增殖和成软骨分化[15]。
DAP 为典型的香豆素衍生物，来源广泛，药用价值大。研究显示，香豆素类化合物均具有良好的抗肿瘤活性[16-17]。DAP 具有抗炎、镇痛、抗菌、镇静催眠、强心及抗血栓形成等多种作用[18]；同时 DAP 的毒副作用较低，在体内代谢较快，用药安全性较高[19]；目前临床上主要用于治疗心脏病、脉管炎以及关节退行性疾病[20]。有研究表明，香豆素类化合物蛇床子素能够促进小鼠成骨细胞成骨，提高骨密度[21]。在成软骨分化方面的研究显示，DAP 能够协同 TGF-β1 诱导大鼠 ADSCs 成软骨分化[22]。
目前实验室常规使用的促进干细胞分化增殖的诱导剂是各种细胞因子，而这些细胞因子的提取及分离价格昂贵，而且人体的内环境很难靠细胞因子来模拟。本研究我们采用天然药物 DAP 联合 IGF-1 基因转染大鼠 ADSCs，观察二者协同作用对种子细胞成软骨分化的影响。结果显示单独使用 DAP 对细胞的Ⅱ型胶原和 Aggrecan 的表达水平无明显影响，说明 DAP 单独使用缺乏诱导 ADSCs 成软骨分化的作用能力。DAP 与 IGF-1 联合作用后，实验组Ⅱ型胶原、Aggrecan 的 mRNA 和蛋白表达水平均比对照组细胞明显增强，而且随着 DAP 浓度的增加而增强，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组显著高于 0 μg/mL DAP 浓度组。这些软骨特异性标志物的表达，说明 ADSCs 经 DAP 和 IGF-1 联合诱导，发生了成软骨分化，二者联合呈明显协同作用，但具体机制有待深入研究。
综上述，通过基因转染技术可使大鼠 ADSCs 稳定表达 IGF-1，联合应用天然药物 DAP 处理，能够明显提高 IGF-1 的生物学效能，促进 ADSCs 成软骨分化，为构建经济且有效的治疗软骨损伤和退变的组织工程软骨提供了新思路。对于如何在生理范围内达到最佳效果及远期效果均需要进一步实验证实。
由于创伤、骨关节炎、感染等原因导致的关节软骨损伤在骨科临床常见。关节软骨的组织学特性决定了其自身修复能力有限，损伤后如不治疗，缺损可能继续增大，导致软骨合成、分解代谢障碍，最终引起关节软骨功能丧失[1]。软骨组织工程学的发展为治疗关节软骨损伤提供了新的契机，应用组织工程软骨修复软骨缺损成为近年热门研究方向。
脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的成体干细胞，具有多向分化潜能[2]。近年的软骨组织工程研究显示，ADSCs 具有很强的成软骨能力，且能保持稳定的软骨细胞表型[3-4]。IGF-1 是促进软骨细胞发育的重要生长因子之一，在细胞分裂增殖及细胞外基质的分泌过程中起重要作用[5]，能够有效诱导 ADSCs 成软骨分化[6]。瑞香素（dephnetin，DAP）又名祖师麻甲素，化学名 7，8-二羟基香豆素，是香豆素类化合物的代表性单体成分，是金边瑞香中的主要提取物[7]，临床上可用于关节退行性疾病的治疗。但目前关于 DAP 对 ADSCs 成软骨分化影响的研究较少，我们设想 DAP 对 ADSCs 成软骨分化有促进作用，以期为临床治疗软骨损伤提供新的思路。我们以大鼠 ADSCs 作为种子细胞，联合应用 IGF-1 基因转染技术和 DAP 处理，观察二者联合对于大鼠 ADSCs 成软骨分化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，体质量 200～250 g，由山东省实验动物中心提供。动物实验经济宁医学院实验动物伦理委员会批准，实验动物使用许可证批准号：SYXK（鲁）20180002。
DMEM 培养基、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、FBS、PCR 引物（Thermo Fisher 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化工，日本）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；IGF-1、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖（Aggrecan）抗体（Abcam 公司，英国）；过表达 IGF-1 的重组慢病毒（上海吉玛制药技术有限公司），且慢病毒均带有绿色荧光标记；DAP 标准品（北京索莱宝科技有限公司）；CD29、CD34、CD45及CD105 抗体（eBioscience 公司，美国）；即用型 SABC-POD（兔 IgG）试剂盒、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。CO2 细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；倒置荧光显微镜（南京江南永新光学有限公司）；酶联免疫检测仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 大鼠 ADSCs 分离与培养
取 5 只 SD 大鼠，腹腔注射过量水合氯醛麻醉致死，75% 乙醇浸泡 5 min 后，无菌条件下取出腹股沟脂肪组织。用含 1% 青链霉素双抗的 PBS 冲洗 3 次，仔细剥离去除脂肪组织上的血管。将脂肪组织剪碎后转移至 10 mL 离心管中，加入 5 倍体积的 0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，37℃ 恒温水浴消化 90 min。消化完成后，加入等量含 10%FBS 的 DMEM 培养基终止消化，过 200 目细胞筛去除大块组织；以离心半径 15 cm、1 500 r/min 离心 10 min，去除上清。加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞并计数，按 2×105个/孔密度接种至 6 孔板，于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。48 h 后首次换液，PBS 冲洗 2 次以去除未贴壁细胞，之后每 2 天换液 1 次。待细胞生长融合至 80%～90% 时，进行传代培养。倒置荧光显微镜观察细胞形态变化；取第 3 代 ADSCs 进行流式鉴定细胞表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105 表达。
1.3 实验分组及方法
1.3.1 IGF-1 基因转染
取状态良好的第 3 代 ADSCs，以 3×105个/孔密度铺于 6 孔板，37℃、5%CO2 细胞培养箱培养过夜，待细胞生长至 80% 汇合度时进行转染。从超低温冰箱取出携带 IGF-1 基因的慢病毒原液，冰浴溶化后用含 10%FBS 的 DMEM 准确稀释；吸弃原孔板中的培养基，加入 1 mL 已稀释的病毒液，轻轻晃匀。37℃、5%CO2 细胞培养箱孵育 6 h 后，更换新鲜培养液。48 h 后倒置荧光显微镜下观察荧光表达及细胞生长情况；并取适量转染后细胞，采用 Western blot 检测 IGF-1 蛋白表达，以未转染的 ADSCs 作为对照组；其余细胞及时换液。
Western blot 检测方法：收集细胞，用 RIPA 裂解液冰上裂解细胞 30 min 后，于 4℃ 以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 10 min，取上清；加适量上样缓冲液，沸水中煮 5 min 制备蛋白样品；经 12%SDS-PAGE 100 V 恒压电泳，250 mA 恒流湿转膜 90 min，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；5% 脱脂牛奶封闭 1 h 后，分别加入 IGF-1（1∶200）或 β-actin（1∶2 000）抗体，4℃ 孵育过夜；TBST 洗 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000），室温下孵育 1 h，TBST 洗 4 次后行 ECL 显色发光。采用 Image J 软件进行灰度值分析，以目标蛋白与 β-actin 的灰度值比值作为蛋白相对表达量。
1.3.2 实验分组
取未转染的 ADSCs（对照组）和 IGF-1 基因转染 48 h 的 ADSCs（实验组），采用 0.25% 胰蛋白酶消化，调整细胞密度为 2.5×105个/mL，接种于 96 孔板，每孔 100 μL，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱过夜。细胞完全贴壁后，吸弃培养基，换成含不同浓度 DAP（0、30、60、90 μg/mL）的 10%FBS DMEM 培养基继续培养。每组每个浓度设 5 个复孔。
1.4 观测指标
1.4.1 CCK-8 法检测细胞增殖活性
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 72 h 后细胞，于培养结束前 1 h 每孔分别加入 CCK-8 试剂 10 μL，37℃、5%CO2 细胞培养箱培养 1 h，酶联免疫检测仪检测 450 nm 处吸光度（A）值。
1.4.2 实时荧光定量 PCR 检测基因表达
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 14 d 的细胞，抽提总 RNA，逆转录为 cDNA。使用 Primer Premier 5.0 软件设计目的基因的检测引物，委托 Thermo Fisher 公司合成。引物序列：Ⅱ型胶原上游 5′-GCTCCCAGAACATCACCTACCA-3′，下游 5′-ACAGTCTTGCCCCACTTACCG-3′；Aggrecan 上游 5′-AGGTCGTGGTGAAAGGTGTTGTG-3′，下游 5′-TGGTGGAAGCCATCCTCGTAG-3′。采用 20 μL 反应体系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后 ddH2O 补足体积，混匀后上机检测。反应条件：95℃ 预变性 10 min，95℃ 变性 15 s，58℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，40 个循环。以 β-actin 为内参，采用 2−ΔΔCt法计算成软骨相关基因Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量。
1.4.3 Western blot 检测蛋白表达
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 14 d 的细胞，0.25% 胰蛋白酶消化后收集细胞，参照 1.3.1 方法行 Western blot 检测 Ⅱ型胶原（1∶200）和 Aggrecan（1∶500）蛋白表达。
1.4.4 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
取对照组和实验组不同浓度 DAP 培养 14 d 的细胞爬片，4% 多聚甲醛固定细胞。每组取一半玻片浸泡于甲苯胺蓝染色液中 5 min 后，蒸馏水冲洗、干燥封片，光镜下观察。另一半玻片用 5% 牛血清白蛋白于 37℃ 封闭 1 h，加入兔抗Ⅱ型胶原抗体，湿盒 37℃ 孵育 2 h，PBS 冲洗后加生物素化山羊抗兔 IgG 二抗，湿盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 SABC 试剂湿盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 DAB 显色剂显色 10 min，苏木素复染，蒸馏水冲洗后封片，倒置荧光显微镜观察。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各浓度组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞转染前后观察
分离出的 ADSCs 接种于细胞培养皿，24 h 时多数细胞贴壁；换液后，48～72 h 大部分贴壁细胞伸展；7 d 左右可见细胞生长达 80% 融合度，细胞呈纺锤形或长梭形，排列有序，漩涡状生长。流式细胞仪检测细胞表面抗原示，CD29、CD105 阳性率分别为 97.4% 和 95.3%，CD34、CD45 阳性率分别为 1.8% 和 1.2%。IGF-1 基因转染 48 h 后，倒置荧光显微镜观察，ADSCs 荧光阳性细胞比达 90% 以上。Western blot检测显示，转染后细胞 IGF-1 蛋白相对表达量为 0.513±0.007，明显高于未转染细胞的 0.154±0.009，差异有统计学意义（t=31.490，P=0.001）。见图 1~3。
图1
大鼠 ADSCs 形态学观察（倒置荧光显微镜×200）
a. 转染前培养 7 d；b. IGF-1 基因转染 48 h
Figure1. Morphological observation of rat ADSCs (Inverted fluorescence microscope×200)a. Cultured for 7 days before transfection; b. Transfection of IGF-1 gene for 48 hours
图2
流式细胞仪检测大鼠 ADSCs 表面抗原表达
a. CD29；b. CD34；c. CD105；d. CD45
Figure2. Detection of ADSCs surface antigen expressions by flow cytometrya. CD29; b. CD34; c. CD105; d. CD45
图3
Western blot 检测转染前后 ADSCs 的 IGF-1 蛋白表达
1：转染前 2：转染后
Figure3. Detection of IGF-1 protein expression of ADSCs before and after transfections by Western blot1: Before transfection 2: After transfection
2.2 CCK-8 法检测细胞增殖活性
随 DAP 作用浓度增加，对照组和实验组细胞 A 值均逐渐增加，各浓度组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）；相同 DAP 浓度下，实验组细胞 A 值显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
CCK-8 法检测不同浓度 DAP 对 ADSCs 增殖的影响（n=5，）
Table1.
Effects of different concentrations of DAPs on ADSCs proliferation detected by CCK-8 assay (n=5, )
2.3 实时荧光定量 PCR 检测基因表达
随 DAP 作用浓度增加，对照组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量无明显变化，各浓度组间差异无统计学意义（P>0.05）；实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量逐渐增加，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组显著高于 0 μg/mL DAP 浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。相同 DAP 浓度下，实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan mRNA 相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
实时荧光定量 PCR 检测对照组和实验组各浓度 DAP 作用下基因表达
a. Ⅱ型胶原；b. Aggrecan
Figure4. Gene expressions in control group and experimental group detected by real-time fluorescence quantitative PCR at different concentrations of DAPsa. Collagen type Ⅱ; b. Aggrecan
2.4 Western blot 检测蛋白表达
随 DAP 作用浓度增加，对照组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量无明显变化，各浓度组间差异无统计学意义（P>0.05）；实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量逐渐增加，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组显著高于 0 μg/mL DAP 浓度组，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。相同 DAP 浓度下，实验组细胞Ⅱ型胶原和 Aggrecan 蛋白相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
Western blot 检测对照组和实验组各浓度 DAP 作用下蛋白表达
a. 电泳图 1：对照组+0 μg/mL DAP 2：对照组+30 μg/mL DAP 3：对照组+60 μg/mL DAP 4：对照组+90 μg/mL DAP 5：实验组+0 μg/mL DAP 6：实验组+30 μg/mL DAP 7：实验组+60 μg/mL DAP 8：实验组+90 μg/mL DAP；b. Ⅱ型胶原蛋白相对表达量；c. Aggrecan 蛋白相对表达量
Figure5. Protein expressions in control group and experimental group detected by Western blot at different concentrations of DAPsa. Electrophoresis map 1: Control group+0 μg/mL DAP 2: Control group+30 μg/mL DAP 3: Control group+60 μg/mL DAP 4: Control group+90 μg/mL DAP 5: Experimental group+0 μg/mL DAP 6: Experimental group+30 μg/mL DAP 7: Experimental group+60 μg/mL DAP 8: Experimental group+90 μg/mL DAP; b. Relative protein expression of collagen type Ⅱ; c. Relative protein expression of Aggrecan
2.5 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色
甲苯胺蓝染色示细胞质及细胞膜均呈蓝色，随 DAP 作用浓度增加，对照组和实验组细胞内着色均无明显差异；但相同 DAP 浓度下，实验组比对照组细胞着色略深。见图 6。
图6
对照组和实验组各浓度 DAP 作用下甲苯胺蓝染色观察（×200）
从左至右依次为 0、30、60、90 μg/mL DAP 浓度组 a. 对照组；b. 实验组
Figure6. Toluidine blue staining observation in control group and experimental group with different concentrations of DAPs (×200)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，随 DAP 作用浓度增加，对照组细胞的细胞质内棕黄色着色无明显差异；实验组细胞的细胞质内棕黄色着色逐渐加深，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组明显深于 0 μg/mL DAP 浓度组。相同 DAP 浓度下，实验组比对照组细胞着色明显加深。见图 7。
图7
对照组和实验组各浓度 DAP 作用下Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察（倒置荧光显微镜×100）
从左至右依次为 0、30、60、90 μg/mL DAP 浓度组 a. 对照组；b. 实验组
Figure7. Immunohistochemical staining observation of collagen type Ⅱ in control group and experimental group treated with different concentrations of DAPs (Inverted fluorescence microscope×100)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
3 讨论
近年来，生物材料学与细胞学研究的不断深入促进了组织工程技术的发展。软骨组织工程技术在被提出和建立至今二十多年的时间里，得到了迅猛发展[8]。由于自体软骨细胞供区有限、细胞培养增殖困难、体外传代培养容易去分化等诸多问题，限制了自体细胞在软骨修复中的应用[9]。ADSCs 来源于发育早期的中胚层和外胚层，可从全身多处部位提取，来源丰富，与其他来源干细胞相比还具有增殖快、数量众多、免疫原性低、不易造成损伤等优点[10]。脂肪组织也具有向软骨分化的能力[11]，在软骨组织工程中的应用前景广阔[12]。在软骨组织工程构建中，生长因子发挥了重要作用，其中 IGF-1 被认为是调节软骨形成和代谢最关键的细胞因子。Messai 等[13]报道在软骨形成过程中，IGF-1 的作用主要是在转录水平调节 DNA、Aggrecan 和Ⅱ型胶原的分泌率；有研究证实，IGF-1 不仅能促进软骨细胞的Ⅱ型胶原和 Aggrecan 的分泌，而且会同时抑制 Aggrecan 降解[14]。研究显示，应用基因转染技术，显著提高了 IGF-1 和 BMP-2 的生物学效能，促进 ADSCs 增殖和成软骨分化[15]。
DAP 为典型的香豆素衍生物，来源广泛，药用价值大。研究显示，香豆素类化合物均具有良好的抗肿瘤活性[16-17]。DAP 具有抗炎、镇痛、抗菌、镇静催眠、强心及抗血栓形成等多种作用[18]；同时 DAP 的毒副作用较低，在体内代谢较快，用药安全性较高[19]；目前临床上主要用于治疗心脏病、脉管炎以及关节退行性疾病[20]。有研究表明，香豆素类化合物蛇床子素能够促进小鼠成骨细胞成骨，提高骨密度[21]。在成软骨分化方面的研究显示，DAP 能够协同 TGF-β1 诱导大鼠 ADSCs 成软骨分化[22]。
目前实验室常规使用的促进干细胞分化增殖的诱导剂是各种细胞因子，而这些细胞因子的提取及分离价格昂贵，而且人体的内环境很难靠细胞因子来模拟。本研究我们采用天然药物 DAP 联合 IGF-1 基因转染大鼠 ADSCs，观察二者协同作用对种子细胞成软骨分化的影响。结果显示单独使用 DAP 对细胞的Ⅱ型胶原和 Aggrecan 的表达水平无明显影响，说明 DAP 单独使用缺乏诱导 ADSCs 成软骨分化的作用能力。DAP 与 IGF-1 联合作用后，实验组Ⅱ型胶原、Aggrecan 的 mRNA 和蛋白表达水平均比对照组细胞明显增强，而且随着 DAP 浓度的增加而增强，其中 60、90 μg/mL DAP 浓度组显著高于 0 μg/mL DAP 浓度组。这些软骨特异性标志物的表达，说明 ADSCs 经 DAP 和 IGF-1 联合诱导，发生了成软骨分化，二者联合呈明显协同作用，但具体机制有待深入研究。
综上述，通过基因转染技术可使大鼠 ADSCs 稳定表达 IGF-1，联合应用天然药物 DAP 处理，能够明显提高 IGF-1 的生物学效能，促进 ADSCs 成软骨分化，为构建经济且有效的治疗软骨损伤和退变的组织工程软骨提供了新思路。对于如何在生理范围内达到最佳效果及远期效果均需要进一步实验证实。
