【摘要】 目的 探討骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）對室管膜前下區(qū)（anterior subventricular zone，SVZa）神經(jīng)干細胞DLX5表達的影響?！》椒ā◇w外培養(yǎng)SVZa神經(jīng)干細胞，用BMP-2及其拮抗劑Noggin誘導SVZa神經(jīng)干細胞，分別用免疫熒光染色和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測DLX5表達變化?！〗Y(jié)果 BMP-2組SVZa神經(jīng)干細胞DLX5蛋白表達和DLX5mRNA表達水平明顯高于對照組（Plt;0.05），且該效應能被其拮抗劑Noggin特異性地抑制?！〗Y(jié)論 BMP-2是DLX5上游調(diào)節(jié)基因，可促進SVZa神經(jīng)干細胞DLX5的表達。【Abstract】 Objective To investigate the effect of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)on expression of DLX5 of neural stem cells in anterior subventricular zone (SVZa). Methods The neural stem cells of SVZa were separated and cultured in vitro, which were induced by BMP-2 and Noggin.Immunofluorescence staining and RT-PCR were employed to assay the expression of DLX5. Results The percentages of expression of DLX5 protein and DLX5 mRNA in BMP-2 group were much higher than those in the control group (Plt;0.05). And this induction could be specifically blocked by Noggin. Conclusion BMP-2 is an upstream gene of DLX5; BMP-2 can promote the expression of DLX5 of the neural stem cells of SVZa.
目的 既往研究表明辛伐他汀具有促成骨作用，現(xiàn)探討辛伐他汀對幼鼠骨小梁中骨形成相關(guān)因子表達以及BMSCs 成骨分化的影響。 方法 40 只1 周齡雄性SD 大鼠，體重17.5 ～ 19.5 g，隨機分為2 組，每組20 只。實驗組于大鼠頸部皮下注射辛伐他汀注射液[5 mg/（kg·d）]，對照組同法注射等劑量生理鹽水。于注射后1、3 周，兩組分別脫頸處死10 只大鼠，采用免疫組織化學染色檢測脛骨上端骨小梁BMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、VEGF 的表達情況。注射后1、3 周，兩組分別取大鼠雙側(cè)股骨，采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs，取第1 代BMSCs 成骨誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)后14 d 行ALP 染色，培養(yǎng)后21 d 采用實時熒光定量PCR 檢測BMP-2、Runx2、Osterix、Msx2、Dlx3、Dlx5 mRNA 的表達，培養(yǎng)后28 d 行von Kossa 染色。 結(jié)果 免疫組織化學染色示注射后1、3 周兩組脛骨上端骨小梁BMP-2、MMP-13、VEGF 表達，差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。成骨誘導培養(yǎng)14 d，注射后1、3 周兩組ALP染色陽性細胞百分比差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；成骨誘導培養(yǎng)21 d，實時熒光定量PCR 檢測示注射后1、3 周兩組BMP-2、Runx2、Osterix、Dlx3、Dlx5、Msx2 mRNA 表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；成骨誘導培養(yǎng)28 d，注射后1、3 周兩組鈣結(jié)節(jié)單位面積比差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 皮下注射辛伐他汀5 mg/（kg·d）后1、3 周對幼鼠骨小梁中骨形成相關(guān)因子表達以及BMSCs 成骨分化無明顯影響。
目的 研究局部植入辛伐他汀對兔顱骨極限骨缺損的修復作用及對血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）歸巢的影響，探討辛伐他汀促進骨缺損修復的作用機制。 方法 將辛伐他汀50 mg 加聚乳酸200 mg 以及單純聚乳酸200 mg 分別溶解于1 mL 丙酮，制備辛伐他汀- 聚乳酸復合材料及單純聚乳酸材料。取2 只雄性新西蘭大白兔骨髓以體外貼壁法培養(yǎng)EPCs，將第3 代EPCs 制備為2 × 106 個/mL 細胞懸液，采用性別錯配移植，經(jīng)耳緣靜脈移植至12 只雌性新西蘭大白兔，每只兔各2 mL。移植3 d 后于12 只雌性兔顱骨制備直徑15 mm 的骨缺損，分別將辛伐他汀- 聚乳酸復合材料（實驗組，n=6）及單純聚乳酸材料（對照組，n=6）植入骨缺損部位。術(shù)后觀察兔一般情況，于8 周后行大體觀察并攝X 線片檢測顱骨缺損修復情況；采用血管明膠墨汁灌注染色、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測血管生成及EPCs 歸巢情況。 結(jié)果 兩組實驗動物均存活至實驗完成。術(shù)后8 周實驗組骨缺損處有質(zhì)硬組織生成，X 線片示不規(guī)則高密度影，組織學觀察見新骨組織，F(xiàn)ISH 檢測血管數(shù)量較多，血管壁可見移植的含Y 染色體的陽性細胞。對照組骨缺損處僅纖維結(jié)締組織覆蓋，X 線片示低密度軟組織影，組織學觀察未見新骨形成，且僅在移植物周邊見少量血管，F(xiàn)ISH 檢測未見含Y 染色體的陽性細胞。實驗組及對照組新骨形成百分比分別為91.63% ± 4.07% 及59.45% ± 5.43%，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 局部植入辛伐他汀可以促進骨缺損修復，其作用機制與其動員EPCs 歸巢至骨缺損部位、促進血管生成及最終促進骨形成有關(guān)。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）體內(nèi)誘導成骨及成血管的活性，為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head，ANFH）的AAV 基因治療提供理論基礎。 方法 取體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，分別采用以下4 種病毒轉(zhuǎn)染并分為4 組：rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）-hBMP-7（A 組）、rAAV-hVEGF165- 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（B 組）、rAAV- hBMP-7-GFP（C 組）及rAAV-IRES-GFP（D 組）。取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作后肢缺血模型，并隨機分為4 組（n=6），于股骨肌肉內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應用超聲影像學檢測兔后肢脛前動脈血流量，行CD34 免疫組織化學染色檢測微血管生成。另取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作股骨肌袋模型，并隨機分為4 組（n=6），于肌袋內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應用X 線片檢測兔后肢原位骨化，行von Kossa 鈣鹽染色檢測肌肉組織成骨礦化。 結(jié)果 病毒注射后動物未出現(xiàn)局部或全身毒性反應。病毒注射后8 周，A 組兔后肢脛前動脈血流百分比及CD34 陽性微血管數(shù)均高于其他3 組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；B 組高于C、D 組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。病毒注射后8 周，A、C 組兔后肢肌袋內(nèi)出現(xiàn)可被X 線檢測到的原位骨化，von Kossa 肌肉組織鈣鹽染色可見大量鈣鹽沉積，且A 組原位骨化及鈣鹽沉積程度均較C 組強；B 組及D 組均未見明顯原位骨化及鈣鹽沉積形成。 結(jié)論 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 載體具有體內(nèi)誘導成骨及成血管的生物學活性。
目的 探討人椎間盤細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞的分子表型差異，分析hBMSCs 經(jīng)TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合誘導后能否分化為軟骨細胞和髓核細胞。 方法 取9 例自愿捐贈者髂嵴骨髓20 ～ 40 mL 分離培養(yǎng)hBMSCs。取第4 代hBMSCs 行三維微球培養(yǎng)。根據(jù)基礎培養(yǎng)基中加入的生長因子不同，實驗分成 4 組，分別為加入10 ng/mL TGF-β3 組（A 組）、200 ng/mL BMP-7 組（B 組）、同時加入兩種生長因子組（C 組）以及空白對照組（D 組）。于培養(yǎng)后21 d，行組織學及免疫組織化學觀察；于培養(yǎng)后4、21 d 進行PCR 檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型膠原、蛋白多糖和SOX9 基因的表達。 結(jié)果 培養(yǎng)后21 d，HE 染色示A 組和C 組細胞呈軟骨細胞樣形態(tài)特征，甲苯胺藍染色及免疫組織化學染色Ⅱ型膠原表達呈陽性。B 組和D 組細胞形態(tài)無明顯改變，PCR 檢測示培養(yǎng)后21 d，A、C 組SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達較4 d 時明顯增加（P lt; 0.05）。B、D 組Ⅰ型膠原表達較4 d 時明顯增加（P lt; 0.05），SOX9、蛋白多糖及Ⅱ型膠原較4 d 時無明顯變化（P gt;0.05）。其中僅A組Ⅹ型膠原表達呈陽性。 結(jié)論 TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合應用能促進hBMSCs 分化更接近于椎間盤細胞，可能為椎間盤組織工程提供種子細胞。
目的 觀察以纖維蛋白膠（fibrin sealant，F(xiàn)S ）為載體復合骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)的注射型骨修復材料對體外培養(yǎng)的兔骨髓基質(zhì)細胞（marrow stromal cells， MSCs）增殖和分化的影響，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法 取3日齡新西蘭兔骨髓進行培養(yǎng)傳代，采用第3代細胞進行研究。實驗分為3組，實驗組：以含1 μg/ml rhBMP-2注射型FS培養(yǎng)細胞；FS對照組：以單純FS培養(yǎng)細胞；空白對照組：不作任何處理。采用細胞培養(yǎng)、組織化學及電鏡等方法對各組兔MSCs的增殖、貼壁率、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性及染色、Ⅰ型膠原表達、超微結(jié)構(gòu)及細胞在材料中的生長情況進行觀察。 結(jié)果 各組細胞促增殖作用由強到弱依次是：FS對照組→實驗組→空白對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；對細胞貼壁率的影響總體由強到弱依次是：FS對照組→實驗組→空白對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。各組ALP活性由強到弱依次是：實驗組→FS對照組→空白對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；各組細胞的Ⅰ型膠原表達水平由高到低依次是：實驗組→FS對照組→空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。 掃描電鏡觀察，材料表面粗糙，有微孔存在，F(xiàn)S對照組、實驗組細胞與材料融合生長。透射電鏡觀察：實驗組細胞向成骨細胞分化程度高，但細胞增殖活性較FS對照組稍差；FS對照組細胞向成骨細胞分化的程度較實驗組低，細胞增殖活性較好；空白對照組的細胞增殖活性較差，胞外基質(zhì)少。 結(jié)論 以FS為載體復合BMP的注射型骨修復材料可顯著提高MSCs向成骨細胞方向的分化水平，但對MSCs促增殖作用不明顯。
目的 以聚乳酸／聚羥基乙酸（poly-lactide-co-glycolide，PLGA）為載體，探討重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）在關(guān)節(jié)軟骨修復方面的作用及可行性。方法 將PLGA制成直徑4 mm，厚3 mm的圓柱形，與rhBMP-2復合（0.5 mg/塊），制備PLGA-rhBMP-2復合物。選取2月齡新西蘭兔，抽取骨髓行原代及傳代培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為2×10.7/ml，與PLGA共培養(yǎng)24 h，制備PLGA細胞復合物。另取2月齡新西蘭兔72只，于雙側(cè)髕股關(guān)節(jié)股骨髁部制備直徑4 mm、深達髓腔的缺損。其中36只兔右側(cè)缺損處植入PLGA-rhBMP-2復合物，為實驗組；左側(cè)植入PLGA，為單純載體組；另36只兔左側(cè)缺損不作任何處理，為空白對照組，右側(cè)缺損處植入PLGA-細胞復合物，作為細胞組。術(shù)后4、8、12、24、36和48周取材，行大體、組織學觀察以及組織學評分。結(jié)果術(shù)后動物均存活。術(shù)后4周，實驗組和細胞組缺損內(nèi)被半透明組織填充，觸之柔軟，表面較光滑，軟骨細胞周圍基質(zhì)異染弱，新生軟骨厚度較正常軟骨厚；空白對照組和單純載體組未見明顯組織形成。8周，實驗組和細胞組內(nèi)新生組織呈白色，半透明，質(zhì)較韌，表面平整，與周圍正常軟骨界限模糊；新生軟骨細胞分布均一，但仍較正常軟骨厚，PLGA已大部分降解，僅遺留少量顆粒；單純載體組和空白對照組缺損明顯，底部形成少量白色膜狀組織。12、24周，實驗組和細胞組缺損內(nèi)完全充填白色半透明新生軟骨組織，質(zhì)韌，表面平整，與正常軟骨界限消失，厚度接近正常軟骨，與正常軟骨連接良好，表面細胞平行排列，深層有縱向排列的傾向，呈團狀，陷窩形成，但有別于正常軟骨細胞；單純載體組和空白對照組缺損邊緣及底部形成少量軟骨細胞，大部分為纖維組織。 36、48周，實驗組和細胞組新生軟骨組織色稍發(fā)白，表面連續(xù)，欠平整，與正常軟骨界限消失，未見滑膜增生; 新生軟骨厚度較正常軟骨薄，軟骨細胞周圍基質(zhì)異染較弱；單純載體組及空白對照組缺損仍存在，但較以前縮小，基底形成纖維組織，髁部可見部分軟骨面不平整、剝脫，部分軟骨下骨外露，滑膜增厚。組織學評分，實驗組和細胞組術(shù)后12、24周分別與4、 8和48周比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各時間點實驗組、細胞組分別與單純載體組和空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），實驗組與細胞組在各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 PLGA-rhBMP-2復合物在降解過程中釋放出rhBMP-2，rhBMP-2作用于缺損局部的骨髓基質(zhì)細胞，誘導其向軟骨細胞分化，從而修復軟骨缺損；此方法簡便易行，有實用價值，有望成為治療軟骨缺損的一種新方法。
目的 通過研究大鼠股骨干骨折合并腦外傷時骨痂組織內(nèi)骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）表達水平的變化，探討腦外傷對骨折愈合的影響及作用機制。 方法 取12周雄性SD大鼠32只，體重368±25 g。隨機分成4組，每組8只：A組為骨折合并腦外傷1周組，B組為單純骨折1周組，C組為骨折合并腦外傷2周組，D組為單純骨折2周組。A、C組制作腦外傷和股骨干骨折模型，B、D組制作單純股骨干骨折模型作對照。各組攝X線片后截取骨痂，行HE染色觀察骨痂生長情況及其組織形態(tài)，免疫組織化學染色測定BMP-2表達，RT-PCR檢測BMP-2 mRNA水平。結(jié)果 X線片示A組骨折端有較少量骨痂形成，骨折線較清晰；B組骨折線清晰；C組骨折端有較多骨痂形成，骨折線已模糊；D組僅有少量骨痂形成，骨折線較清晰。HE染色A組可見較多早期軟骨細胞、成纖維細胞；B組骨折間隙可見成纖維細胞，僅夾雜有少量的早期軟骨細胞；C組骨折端有新生骨小梁長入；D組未見有骨小梁形成。免疫組織化學染色可見成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、早期軟骨細胞、成骨細胞胞漿均出現(xiàn)廣泛的強陽性反應，A組陽性細胞數(shù)量多于B組，并且顯色強；C組陽性細胞數(shù)量多于D組，并且顯色強。分析顯示A、C組平均陽性細胞百分數(shù)為0.762%±0.052%、0.756%±0.079%，分別高于同一時間點B、D組的0.702%±0.052%、0.672%±0.044%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RT- PCR分析顯示：A～D組骨痂BMP-2 mRNA 含量依次遞減，A、C組骨痂BMP-2 mRNA 含量為1.07±0.13、0.78±0.11，均顯著高于同一時間點B、D組的0.91±0.12、0.61±0.08，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論 腦外傷對骨折愈合有促進作用，可能與腦外傷后BMP2表達水平升高有關(guān)。
目的 探討自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)活性多肽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）體外定向誘導成骨的能力，評價BMP-2活性多肽的成骨誘導性及誘導成骨的劑量依賴性 方法取4周齡Wistar大鼠分離培養(yǎng)MSCs，傳至第3代時改用條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別加入濃度為300、200、100、50及0 μg/ml的BMP2活性多肽，并依次記為A、B、C、D和E組。細胞培養(yǎng)至5、10、15及20 d，檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，測定鈣含量，采用實時熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)QPCR)檢測Ⅰ型膠原、骨橋蛋白 (osteopontin，OPN) 及骨鈣素（osteocalcin，OCN） mRNA的表達，檢測不同濃度BMP2活性多肽體外誘導成骨的能力。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后，培養(yǎng)細胞由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切巍ｋS條件培養(yǎng)基中BMP-2活性多肽濃度的增加，細胞發(fā)生成骨樣改變的時間提前。ALP活性和鈣含量檢測顯示，A組和B組較其他組增加明顯，且差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A、B組間比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。FQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度條件培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，Ⅰ型膠原、OPN和OCN mRNA在各組均有表達。Ct值表明其表達量的大小順序為A、B、C、D組，E組無表達，A組和B組的Ct值明顯大于C組和D組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。結(jié)論 BMP-2活性多肽能有效地促進MSCs向成骨方向分化，其誘導作用存在劑量依賴關(guān)系，最佳誘導劑量為200 μg/ml。
目的 檢測重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）與納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nano-hydroxyapatite/collagen/ polylactic acid, nHAC/PLA）復合后形成的活性nHAC/PLA（active nHAC/ PLA, AnHAC/PLA）修復顱骨極限缺損的效果。方法 新西蘭大白兔48只，體重2.0~2.5 kg。制備直徑為15 mm的顱骨全層缺損模型，隨機分成4組，每組12只。陽性對照組：缺損區(qū)植入自體髂骨；空白對照組：缺損區(qū)不植入任何材料；陰性對照組：缺損區(qū)植入nHAC/PLA；實驗組：缺損區(qū)植入AnHAC/PLA，每塊AnHAC/PLA上平均吸附rhBMP-21.431 mg。術(shù)后8、16周通過比較顱骨缺損區(qū)X線阻射面積占總?cè)睋p面積百分比、HE染色和Masson’s三色法染色觀察顱骨極限缺損的修復情況。結(jié)果；術(shù)后8、16周，各組顱骨缺損區(qū)X線阻射程度，陽性對照組分別為67.21%±2.06%、86.48%±1.73%，空白對照組分別為5.84%±1.92%、9.48%±2.72%，陰性對照組分別為19.13%±2.51%、3567%±3.28%，實驗組分別為58.84%±2.55%、85.61%±3.36%。其中除16周實驗組與陽性對照組以及空白對照組8、16周比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)外，其余各組各時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組織學觀察顯示,陽性對照組骨缺損區(qū)16周骨小梁較8周增寬，被大量骨組織充填；空白對照組8、16周骨缺損區(qū)均被纖維組織充填，無新骨生成；陰性對照16周骨缺損區(qū)為剩余材料與纖維組織充填，周邊新骨較8周形成增多；實驗組8周材料植入?yún)^(qū)為新生骨替代，16周新生骨呈板層狀，缺損區(qū)材料殘留較少，且周圍可見較多成骨細胞。結(jié)論 nHAC/PLA是rhBMP-2的良好載體，兩者復合后制備的AnHAC/PLA具有良好骨形成能力，有望應用于臨床上修復較大型骨缺損。