目的 初步確立hBMSCs 的二維生物打印方法，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞噴射過程的控制并保持打印后細(xì)胞活力。 方法 取健康志愿者骨髓5 mL，常規(guī)培養(yǎng)hBMSCs 至第2 代，調(diào)整為1 × 106 個/mL 單細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)分3 組：打印組1 細(xì)胞先行碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光標(biāo)記，快速成型組織打印機(jī)進(jìn)行二維細(xì)胞打印，x 軸間隔300 μm，y 軸間隔1 500 μm，激光共聚焦顯微鏡觀察。打印組2 細(xì)胞未行PI 標(biāo)記，經(jīng)生物打印后培養(yǎng)2 h，Live/Dead viability Kit 測定細(xì)胞活力，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光染色情況；取1 份未經(jīng)Live/Dead viability Kit 測試的打印組2 細(xì)胞，培養(yǎng)7 d 后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁后常規(guī)培養(yǎng)，動態(tài)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。對照組除細(xì)胞懸液不行打印，其余操作同打印組2。 結(jié)果 打印組1 細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡觀察，“細(xì)胞墨滴”在二維組織中規(guī)則且均勻分布，滿足二維設(shè)計(jì)細(xì)胞打印要求；每個“細(xì)胞墨滴”包含細(xì)胞15 ～ 35 個。打印組2 細(xì)胞經(jīng)活力測試，細(xì)胞孵育30 min 后激光共聚焦顯微鏡觀察顯示細(xì)胞熒光染色情況。對照組細(xì)胞活力與打印組2 無明顯區(qū)別。打印后細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)7 d，細(xì)胞可正常貼壁生長，形態(tài)、生長狀態(tài)良好。 結(jié)論 通過生物打印技術(shù)可實(shí)現(xiàn)hBMSCs 在二維平面上的定向、定量規(guī)則分布，并為進(jìn)一步的細(xì)胞三維打印乃至器官打印體系奠定基礎(chǔ)。
目的 比較hBMSCs 和人胎盤基蛻膜MSCs（human placental decidua basalis-MSCs，hPDB-MSCs）在化學(xué)缺氧條件下的增殖情況，為尋找組織工程新的種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。 方法 采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)hBMSCs 與hPDB-MSCs，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物；CoCl2 建立化學(xué)缺氧模型，MTT 法檢測兩種細(xì)胞在不同CoC12 濃度（0、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L）和不同時間（6、12、24、48、72 和96 h）的增殖情況。 結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測顯示hPDB-MSCs 與hBMSCs 均表達(dá) CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人類白細(xì)胞抗原ABC（humanleucocyte antigen ABC，HLA-ABC），不表達(dá)CD34、CD40L 和HLA-DR；但與hBMSCs 相比，hPDB-MSCs 階段特異表達(dá)的胚胎抗原1（stage-specific embryonic antigen 1，SSEA-1）、SSEA-3、SSEA-4、腫瘤排斥抗原（tumor rejection autigen，TRA）-1-60、TRA-1-81 表達(dá)更高?；瘜W(xué)缺氧12 h 內(nèi)，hBMSCs 與hPDB-MSCs 增殖均被抑制，12 h 后均能促進(jìn)增殖；與對照組比較，hBMSCs 經(jīng)150 μmol/L CoCl2 作用24 h 出現(xiàn)顯著增殖（P lt; 0.05），hPDB-MSCs 在75 μmol/L CoCl2 作用12 h 后出現(xiàn)顯著增殖（P lt; 0.05）。 結(jié)論 與hBMSCs 相比，hPDB-MSCs 表達(dá)更高的胚胎干細(xì)胞特有表面抗原，同時對化學(xué)缺氧所致的增殖影響更為敏感，可能成為一種新的組織工程種子細(xì)胞來源。
目的 探討瘦素（leptin，LEP）對 hBMSCs 成骨分化的作用及機(jī)制。 方法 采用全骨髓法培養(yǎng)hBMSCs，取第3 代hBMSCs 分為A、B、C、D、E、F 組，待細(xì)胞貼壁后各組分別加入400、200、100、50 ng/mL LEP 、100 ng/ mL BMP 和普通培養(yǎng)基2 mL 進(jìn)行培養(yǎng)。于培養(yǎng)后7 d 行ALP 染色、21 d 行礦化結(jié)節(jié)染色，倒置相差顯微鏡觀察染色結(jié)果；并于培養(yǎng)后7、14、21 d，檢測各組ALP 活性、骨鈣素（osteocalcin，OCN）水平，篩選 LEP 的最佳誘導(dǎo)濃度；B、E、F 組細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，采用 RT-PCR 檢測成骨相關(guān)基因：核心結(jié)合因子（core-binding factor α1，Cbfα1）、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA 的表達(dá)。 結(jié)果 誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，ALP 染色結(jié)果顯示，A、B、C、D、E 組細(xì)胞胞漿均呈藍(lán)色陽性著色，F(xiàn) 組呈弱陽性；誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示，A、B、C、D、E 組細(xì)胞染色呈陽性，F(xiàn) 組呈陰性。B 組培養(yǎng)后7、14、21 d，ALP、OCN 活性低于 E 組，但顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），200 ng/mL LEP 為最佳濃度。B、E、F組細(xì)胞培養(yǎng)7 d，F(xiàn) 組Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA 均不表達(dá)；B、E 組各產(chǎn)物mRNA 均有表達(dá)，但B 組低于E 組。 結(jié)論 LEP 可促進(jìn) hBMSCs 成骨分化，其機(jī)制可能為LEP 促進(jìn)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)
目的 比較采用兩種不同方法接種的hBMSCs 在生物珊瑚支架中的三維空間分布和基因表達(dá)。 方法 采用傳統(tǒng)接種法（A 組）和纖維蛋白凝膠接種法（B 組）構(gòu)建hBMSCs 和生物珊瑚支架復(fù)合體。A 組孵育3 h，B 組孵育30 min 后檢測兩組細(xì)胞接種效率。培養(yǎng)后2、7、14、21 d，兩組分別取材行DAPI 染色后，熒光顯微鏡觀察，采用AxioVision 圖像分析軟件測量每個切片10 倍物鏡視野中的細(xì)胞數(shù)量，以切片的不同水平區(qū)域（從表面到底部為L1 ～ L5）和垂直區(qū)域（從中心到邊緣）比較兩組細(xì)胞分布情況；采用實(shí)時熒光RT-PCR 檢測成骨分化基因骨凝集素（osteonectin，ON）、核心結(jié)合因子α1（core binding factor α1，Cbfα1）和骨鈣素（osteocalcin，OC）表達(dá)。 結(jié)果 B 組細(xì)胞接種效率為88.32% ± 4.20%，明顯高于A組66.51% ± 12.33%（P lt; 0.01）。培養(yǎng)后2 d，兩組細(xì)胞水平區(qū)域分布由L1 ～ L4 逐漸減少（P lt; 0.05）；垂直區(qū)域細(xì)胞數(shù)目比較，A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），B 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；兩組間各成骨分化基因表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。培養(yǎng)后 7 d，A 組細(xì)胞數(shù)目較2 d 時逐步減少，各水平區(qū)域間細(xì)胞數(shù)目比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），而B 組細(xì)胞數(shù)目和各成骨分化基因表達(dá)量迅速增加，各水平區(qū)域細(xì)胞數(shù)目趨于平衡，細(xì)胞分布均勻（P gt; 0.05），ON 和Cbfα1 基因表達(dá)量明顯高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt; 0.05）。培養(yǎng)后14 d，A 組各水平及垂直區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目均較7 d 時急速減少（P lt; 0.05），B 組細(xì)胞增殖良好且細(xì)胞總數(shù)與7 d 時相近；B 組OC 基因表達(dá)量達(dá)峰值，兩組間各基因表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt; 0.05）。培養(yǎng)后21 d，兩組各水平區(qū)域細(xì)胞數(shù)目和兩組間各基因表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；兩組各垂直區(qū)域細(xì)胞數(shù)目比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt; 0.05）。培養(yǎng)后714、21 d，B 組大部分區(qū)域細(xì)胞數(shù)目均較A 組多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 通過纖維蛋白凝膠接種較傳統(tǒng)方法接種可使hBMSCs 在支架中空間分布更均勻，能達(dá)到更快的細(xì)胞增殖和更有效的成骨分化。
目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨誘導(dǎo)分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達(dá)載體。取健康成人自愿捐獻(xiàn)的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體（pIRES-neo）轉(zhuǎn)染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照組（E 組）。培養(yǎng)4 周，采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達(dá)，Western blot 檢測細(xì)胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達(dá)，定量檢測ALP 活性，免疫組織化學(xué)方法檢測Col Ⅰ表達(dá)。 結(jié) 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達(dá)hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達(dá)骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達(dá)hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達(dá)與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達(dá)。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中能持續(xù)表達(dá)，并能增強(qiáng)hBMSCs 的成骨能力。
目的 利用重組腺病毒載體將生長分化因子5（growth and differentiation factor 5，GDF-5）基因?qū)雋BMSCs，研究GDF-5 基因的表達(dá)和對hBMSCs 成骨分化的影響。 方法 將重組腺病毒GDF-5（adenovirus GDF-5，Ad-GDF-5） [ 含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記] 和空載腺病毒Ad-GFP 進(jìn)行擴(kuò)增并測定滴度，并以不同滴度兩種病毒感染第3 代hBMSCs，干預(yù)后2 d 熒光顯微鏡下觀察GFP 表達(dá)情況，RT-PCR 檢測GDF-5 在hBMSCs中的表達(dá)。取第3 代貼壁hBMSCs 隨機(jī)分為4 組：實(shí)驗(yàn)組（GDF-5 基因轉(zhuǎn)染組）、成骨誘導(dǎo)組、空載組和對照組。于干預(yù)后不同時間行倒置相差顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察、熒光定量RT-PCR、免疫熒光染色和von Kossa 染色檢測細(xì)胞分化情況。 結(jié)果 Ad-GDF-5 滴度為1.0 × 109 pfu/mL，Ad-GFP 滴度為1.2 × 109 pfu/mL。Ad-GDF-5 及Ad-GFP 均能對hBMSCs 有效感染，并使其表達(dá)目的基因和GFP 基因。干預(yù)后1 ～ 7 d 實(shí)驗(yàn)組和成骨誘導(dǎo)組hBMSCs 細(xì)胞形態(tài)及生長方式向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而對照組和空載組hBMSCs 仍保持原有形態(tài)及生長方式。熒光定量RT-PCR 檢測示，干預(yù)后4 d 實(shí)驗(yàn)組GDF-5 基因表達(dá)明顯高于其余各組（P lt; 0.05）；實(shí)驗(yàn)組和成骨誘導(dǎo)組ALP、Col Ⅰ、骨鈣素基因表達(dá)均高于空載組和對照組（P lt; 0.05），成骨誘導(dǎo)組Col Ⅰ基因表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組（P lt; 0.05）。干預(yù)后4 d，免疫熒光染色示成骨誘導(dǎo)組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)并分泌Col Ⅰ，空載組和對照組細(xì)胞未見Col Ⅰ表達(dá)。干預(yù)后10 d，成骨誘導(dǎo)組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞von Kossa 染色為陽性，對照組和空載組為陰性。 結(jié)論 GDF-5 基因可通過腺病毒載體導(dǎo)入hBMSCs 穩(wěn)定表達(dá)，并促使其成骨分化，為進(jìn)一步研究這種轉(zhuǎn)基因hBMSCs 修復(fù)骨組織奠定了基礎(chǔ)。
目的 比較全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法對hBMSCs 的分離效果。 方法 取健康成年人自愿捐贈的骨髓，分別采用全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離、培養(yǎng)hBMSCs 并進(jìn)行傳代。采用倒置相差顯微鏡觀察原代細(xì)胞形態(tài)變化；取第2 代細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后行HE 染色；對比原代及第2、3 代細(xì)胞傳代時間；流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物；并檢測細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后3、6、9 d 的ALP 含量，于第9 天采用Kaplow 法染色觀察細(xì)胞ALP 染色情況。 結(jié)果 全骨髓培養(yǎng)法分離的原代細(xì)胞呈聚集樣生長，而密度梯度離心法分離的原代細(xì)胞呈單個、散在生長。HE 染色示兩種方法分離培養(yǎng)的第2 代細(xì)胞輪廓清晰，大小及形態(tài)均勻一致。全骨髓培養(yǎng)法原代細(xì)胞的傳代時間（15.36 ± 1.67） d；明顯快于密度梯度離心法的（18.57 ± 1.05）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；第2、3 代細(xì)胞的傳代時間兩種分離方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，兩種方法培養(yǎng)的hBMSCs 上陽性表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166 含量和陰性表面標(biāo)志物CD34 含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），陰性表面標(biāo)志物CD14、CD45 含量差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。兩種方法分離的第2 代細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后各時間點(diǎn)ALP 含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；成骨誘導(dǎo)后第9 天ALP 染色程度基本一致。 結(jié)論 全骨髓培養(yǎng)法可分離出hBMSCs，其分離效果與密度梯度離心法相似。
目的 探討人椎間盤細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分子表型差異，分析hBMSCs 經(jīng)TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合誘導(dǎo)后能否分化為軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞。 方法 取9 例自愿捐贈者髂嵴骨髓20 ～ 40 mL 分離培養(yǎng)hBMSCs。取第4 代hBMSCs 行三維微球培養(yǎng)。根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的生長因子不同，實(shí)驗(yàn)分成 4 組，分別為加入10 ng/mL TGF-β3 組（A 組）、200 ng/mL BMP-7 組（B 組）、同時加入兩種生長因子組（C 組）以及空白對照組（D 組）。于培養(yǎng)后21 d，行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察；于培養(yǎng)后4、21 d 進(jìn)行PCR 檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型膠原、蛋白多糖和SOX9 基因的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)后21 d，HE 染色示A 組和C 組細(xì)胞呈軟骨細(xì)胞樣形態(tài)特征，甲苯胺藍(lán)染色及免疫組織化學(xué)染色Ⅱ型膠原表達(dá)呈陽性。B 組和D 組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，PCR 檢測示培養(yǎng)后21 d，A、C 組SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達(dá)較4 d 時明顯增加（P lt; 0.05）。B、D 組Ⅰ型膠原表達(dá)較4 d 時明顯增加（P lt; 0.05），SOX9、蛋白多糖及Ⅱ型膠原較4 d 時無明顯變化（P gt;0.05）。其中僅A組Ⅹ型膠原表達(dá)呈陽性。 結(jié)論 TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)hBMSCs 分化更接近于椎間盤細(xì)胞，可能為椎間盤組織工程提供種子細(xì)胞。
目的 分析hBMSCs 經(jīng)5- 氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）誘導(dǎo)向心肌樣細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)譜的改變。 方法 取胸外科非血液病患者手術(shù)中廢棄的肋骨骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，5-aza 誘導(dǎo)第2 代hBMSCs。取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測α-actin、肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和連接蛋白43（connexin 43）表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測cTnT 陽性細(xì)胞百分率；利用人表達(dá)譜基因芯片技術(shù)篩選分化過程中的差異表達(dá)基因，對部分基因進(jìn)行功能分類和分層聚類分析。 結(jié)果 hBMSCs 經(jīng)5-aza 誘導(dǎo)后，部分呈肌細(xì)胞樣形態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測示誘導(dǎo)前細(xì)胞α-actin、cTnT 染色呈弱陽性，connexin 43 染色呈陰性；誘導(dǎo)后3 周細(xì)胞α-actin、cTnT、connexin 43 染色均呈陽性。流式細(xì)胞儀檢測示誘導(dǎo)前cTnT 陽性細(xì)胞百分率為7.43% ± 0.02%，誘導(dǎo)后3 周為49.64% ± 0.05%。分化過程中共檢測到1 814 個顯著差異表達(dá)基因，對其中647 個基因分層聚類，聚為5 類，生物功能包括信號傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝、增殖分化、發(fā)育以及形態(tài)發(fā)生等。 結(jié)論 hBMSCs 經(jīng)5-aza 誘導(dǎo)向心肌樣細(xì)胞分化過程受信號傳導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄基因、生長因子等多種因素在不同時間點(diǎn)上的共同調(diào)控。
目的 明確萎縮性骨不連組織中表達(dá)上調(diào)的數(shù)種微小RNA（micro RNA，miRNA）與其相應(yīng)靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs 成骨分化過程中的表達(dá)變化趨勢和生物學(xué)功能。 方法 取自體髂骨植骨手術(shù)患者的髂骨骨髓血，采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)hBMSCs。取第4 代hBMSCs 以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)成骨分化，分別提取0、12 h，1、2、4、7、14 d 時的細(xì)胞總RNA 和蛋白，進(jìn)行miRNA 的實(shí)時定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、相應(yīng)靶基因mRNA 的qRT-PCR 和蛋白Western blot 檢測。 結(jié)果 誘導(dǎo)hBMSCs 成骨分化時，成骨性靶基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase liver/bone/kidney，ALPL）、PDGF-α 多肽（PDGF-α polypeptide，PDGF-A）和BMP-2 的mRNA 和蛋白表達(dá)在多數(shù)時間點(diǎn)同對照（0 h）相比增加（BMP-2 在12 h 和1 d 時下降），1 ～ 7 d 變化最為顯著。不同時間點(diǎn)的miRNA、靶基因mRNA 和蛋白表達(dá)水平存在差異，其中hsa-miRNA-149 和hsa-miRNA-654-5p miRNA 含量的變化趨勢與各自靶基因ALPL 和BMP-2 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平總體上成負(fù)相關(guān)（P lt; 0.05），hsa-miRNA-221 與其靶基因PDGF-A 的變化趨勢無明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系（P gt; 0.05）。 結(jié)論 誘導(dǎo)hBMSCs 成骨分化過程中，hsa-miRNA-149 和hsa-miRNA-654-5p 對其相應(yīng)靶基因ALPL 和BMP-2 的mRNA 及蛋白存在密切調(diào)控關(guān)系。