目的 探討骨髓基質(zhì)細(xì)胞與生物活性玻璃陶瓷(BGC) 和聚乳酸(PLA) 的生物相容性,為骨組織工程中生物材料的選擇提供依據(jù)。方法 將骨髓基質(zhì)細(xì)胞與BGC、PLA 復(fù)合體外培養(yǎng),進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)含量及酶學(xué)測(cè)定。結(jié)果 骨髓基質(zhì)細(xì)胞能在BGC、PLA 上貼附、繁殖,其生長(zhǎng)及功能不受影響,并且BGC具有一定的促細(xì)胞增殖作用。結(jié)論 BGC、PLA 具有良好的細(xì)胞相容性,有可能作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的載體應(yīng)用于組織工程的研究。
目的 比較全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法對(duì)hBMSCs 的分離效果。 方法 取健康成年人自愿捐贈(zèng)的骨髓，分別采用全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離、培養(yǎng)hBMSCs 并進(jìn)行傳代。采用倒置相差顯微鏡觀察原代細(xì)胞形態(tài)變化；取第2 代細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后行HE 染色；對(duì)比原代及第2、3 代細(xì)胞傳代時(shí)間；流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物；并檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后3、6、9 d 的ALP 含量，于第9 天采用Kaplow 法染色觀察細(xì)胞ALP 染色情況。 結(jié)果 全骨髓培養(yǎng)法分離的原代細(xì)胞呈聚集樣生長(zhǎng)，而密度梯度離心法分離的原代細(xì)胞呈單個(gè)、散在生長(zhǎng)。HE 染色示兩種方法分離培養(yǎng)的第2 代細(xì)胞輪廓清晰，大小及形態(tài)均勻一致。全骨髓培養(yǎng)法原代細(xì)胞的傳代時(shí)間（15.36 ± 1.67） d；明顯快于密度梯度離心法的（18.57 ± 1.05）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；第2、3 代細(xì)胞的傳代時(shí)間兩種分離方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，兩種方法培養(yǎng)的hBMSCs 上陽(yáng)性表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166 含量和陰性表面標(biāo)志物CD34 含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），陰性表面標(biāo)志物CD14、CD45 含量差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。兩種方法分離的第2 代細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)ALP 含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；成骨誘導(dǎo)后第9 天ALP 染色程度基本一致。 結(jié)論 全骨髓培養(yǎng)法可分離出hBMSCs，其分離效果與密度梯度離心法相似。
目的 通過檢測(cè)熒光微球655（quantum dot 655，QD655）標(biāo)記SD 大鼠BMSCs 的體外細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞貼附性以及標(biāo)記率，探討QD655 標(biāo)記BMSCs 及其示蹤的可行性。 方法 收集2 周齡健康SD 大鼠股骨和脛骨骨髓，貼壁培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs 采用QD655 標(biāo)記作為實(shí)驗(yàn)組，以未標(biāo)記BMSCs 作為對(duì)照組，采用錐蟲藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率，MTT 法觀察QD655 對(duì)細(xì)胞增殖性的影響；取實(shí)驗(yàn)組BMSCs 向成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2 周，采用茜素紅、ALP 染色定性鑒定細(xì)胞成骨分化能力，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 鑒定標(biāo)記對(duì)細(xì)胞成骨分化的影響；分別在標(biāo)記后即刻、1、2、4、6 周采用熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組BMSCs 陽(yáng)性標(biāo)記率；掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在膠原/ 生物活性玻璃復(fù)合材料上的貼附性。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞存活率均gt;90%，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；培養(yǎng)1、3、5、7、9 d，兩組細(xì)胞增殖率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。實(shí)驗(yàn)組BMSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化2 周后，茜素紅及ALP 染色均呈陽(yáng)性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組BMSCs 的骨橋蛋白、骨鈣素、Ⅰ型膠原、ALP、BMP-2 mRNA 較對(duì)照組成倍數(shù)高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組BMSCs 標(biāo)記后即刻陽(yáng)性標(biāo)記率達(dá)96.50% ± 1.59%，隨著標(biāo)記時(shí)間延長(zhǎng)標(biāo)記率下降，標(biāo)記后1、2、4、6 周標(biāo)記率分別為93.30% ± 1.51%、72.40% ± 2.90%、40.10% ± 3.60%、10.00% ± 1.70%，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性標(biāo)記率均為0。掃描電鏡觀察示實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記后細(xì)胞和材料貼附良好。 結(jié)論 QD655 對(duì)大鼠BMSCs 標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)，標(biāo)記率及安全性高，是一種良好標(biāo)記 物。
目的 組織工程骨的神經(jīng)化能有效促進(jìn)支架材料內(nèi)血管生成，修復(fù)骨缺損。研究降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖與遷移的作用，進(jìn)一步揭示組織工程骨的神經(jīng)化促血管生成機(jī)制。 方法 體外分離獲取HUVECs，并通過血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與CD31 抗原鑒定，取第1 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6 組，分別以0（A 組）、1 × 10—12（B 組）、1 × 10—11（C 組）、1 × 10—10（D 組）、1 × 10—9（E 組）、1 × 10—8 mol/L（F 組）濃度CGRP 干預(yù)HUVECs。采用細(xì)胞免疫熒光觀察HUVECs 的CGRP1 受體（CGRP1 receptor，CGRP1R）表達(dá)情況，AlarmarBlue 法動(dòng)態(tài)檢測(cè)各組HUVECs 增殖率，Transwell 小室檢測(cè)各組HUVECs 的遷移能力，ELISA 法檢測(cè)HUVECs 分泌VEGF 的水平，Westernblot 法檢測(cè)其局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達(dá)。 結(jié)果 分離的細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)及vWF、CD31 免疫熒光鑒定為HUVECs，并可見CGRP1R 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)。CGRP 呈時(shí)間- 濃度依賴性刺激HUVECs 增殖；B ～ F組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力均高于A 組（P lt; 0.05），F(xiàn) 組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力最高。B ～ F 組遷移細(xì)胞數(shù)均顯著高于A組（P lt; 0.05），最大增幅達(dá)3 倍以上。B ～ F 組VEGF 分泌量均顯著高于A 組（P lt; 0.05）；C、D 組促進(jìn)細(xì)胞分泌VEGF 的能力最強(qiáng)。Western blot 檢測(cè)示，與A組相比，B～F組CGRP刺激HUVECs 3、7、10 d 后，F(xiàn)AK表達(dá)明顯增加（P lt; 0.05）。 結(jié)論 CGRP 對(duì)HUVECs 的增殖和遷移有直接促進(jìn)作用，可能作用機(jī)制為CGRP 能促進(jìn)VEGF 分泌和增加FAK 的表達(dá)。
目的 觀察外源性降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）在大鼠BMSCs 遷移中的作用及對(duì)VEGF、血管黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）表達(dá)的影響，探討CGRP 通過BMSCs促進(jìn)血管生成的作用機(jī)制。 方法 全骨髓法分離、培養(yǎng)SD 大鼠BMSCs，采用Western blot 法于傳代培養(yǎng)1、2、3 周時(shí)檢測(cè)BMSCs 中CGRP 受體（CGRP receptor，CGRPR）蛋白的表達(dá)。使用濃度為1 × 10-8 mol/L 的CGRP 作用于BMSCs作為實(shí)驗(yàn)組，單純BMSCs 作為對(duì)照組，在培養(yǎng)72 h 時(shí)采用細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CGRP 對(duì)BMSCs 遷移的影響；在培養(yǎng)1、3、5、7 d 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)CGRP 作用后VCAM-1 mRNA 的表達(dá)變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot 法檢測(cè)CGRP 作用后VEGF 的表達(dá)變化。 結(jié)果 Western blot 檢測(cè)示BMSCs 穩(wěn)定表達(dá)CGRPR，2 周時(shí)表達(dá)最高。細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組CGRP 刺激后穿膜遷移細(xì)胞數(shù)（3.20 ± 1.77）個(gè)/HP，較對(duì)照組（1.11 ± 0.49）個(gè)/HP 明顯增多（t=4.230，P=0.001）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示，實(shí)驗(yàn)組VCAM-1 mRNA 表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，7 d 時(shí)最高；實(shí)驗(yàn)組3、5、7 d的VCAM-1 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。免疫細(xì)胞化學(xué)染色示，培養(yǎng)1、3 d 兩組均無(wú)陽(yáng)性染色；培養(yǎng)5、7 d 實(shí)驗(yàn)組VEGF 染色呈陽(yáng)性，對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性染色。Western blot 檢測(cè)示，培養(yǎng)1、3 d 兩組均未檢測(cè)到VEGF蛋白表達(dá)；培養(yǎng)5、7 d 實(shí)驗(yàn)組VEGF 蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P lt; 0.05）；實(shí)驗(yàn)組5 d 的VEGF 蛋白表達(dá)量明顯高于7 d（P lt; 0.05）。 結(jié)論 CGRP 能促進(jìn)BMSCs 遷移及VEGF 表達(dá)，這可能是CGRP 調(diào)節(jié)骨內(nèi)部血流變化而影響骨代謝的機(jī)制之一。
目的 骨組織工程所使用的支架材料能否快速、有效地血管化是骨修復(fù)的關(guān)鍵。研究增強(qiáng)型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料對(duì)血管化的協(xié)同和促進(jìn)作用，為構(gòu)建血管化組織工程骨修復(fù)骨缺損尋找適宜的支架材料。 方法 體外分離獲取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），并通過血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與CD34 抗原鑒定，取第1 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于增強(qiáng)型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料上，掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附情況。取細(xì)胞接種于增強(qiáng)型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料作為實(shí)驗(yàn)組，等量細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)作為對(duì)照組，采用alarmarBlue 法動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞增殖率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（fms-related tyrosine kinase 1，F(xiàn)lt-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（kinase insert domain receptor，Kdr）的mRNA 表達(dá)。取SD 大鼠6 只，將支架材料包埋于大鼠股內(nèi)側(cè)皮下，實(shí)驗(yàn)組采用增強(qiáng)型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料、中央軸向植入血管束，對(duì)照組采用非增強(qiáng)型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料，分別于植入5、10 d 取出，行冰凍切片并HE 染色動(dòng)態(tài)觀察支架材料內(nèi)部的血管化狀態(tài)。 結(jié)果 分離的細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)及vWF、CD34 免疫熒光鑒定為HU VECs。掃描電鏡示HUVECs 在支架材料上黏附較好。HUVECs 在實(shí)驗(yàn)組支架材料上增殖明顯，在第3 天后細(xì)胞增殖率開始高于對(duì)照組，11 d 達(dá)到增殖平臺(tái)期時(shí)細(xì)胞數(shù)仍多于對(duì)照組（P lt; 0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示，培養(yǎng)3 d 實(shí)驗(yàn)組VEGF、Flt-1、Kdr 的mRNA 表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P lt; 0.05）。包埋大鼠皮下實(shí)驗(yàn)可見，實(shí)驗(yàn)組5、10 d 時(shí)植入的血管仍通暢，其周圍新生血管隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多，材料周緣可見宿主血管浸潤(rùn)生長(zhǎng)，但新生血管稀疏；對(duì)照組僅有纖維組織生長(zhǎng)，10 d 時(shí)材料已大部分降解，組織難以長(zhǎng)入。 結(jié)論 增強(qiáng)型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料在大鼠體內(nèi)外可促進(jìn)血管化，可能適于作為構(gòu)建血管化組織工程骨的支架材料。