目的 構(gòu)建人flag-AWP1（associated with protein kinase C related kinase 1）基因的重組腺病毒載體作為AWP1的轉(zhuǎn)基因工具，研究AWP1在人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304中的表達(dá)與定位。方法 將flag-AWP1基因亞克隆到腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV，經(jīng)酶切鑒定正確后PmeⅠ線性化,轉(zhuǎn)化至帶有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行重組； 經(jīng)PacⅠ酶切鑒定和 PCR鑒定、線性化后，用Lipofectamine轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝、反復(fù)感染以獲取高滴度重組病毒上清。再用獲得的重組腺病毒Ad-flag-AWP1感染ECV304細(xì)胞，激光掃描共焦顯微鏡下觀察AWP1在ECV304細(xì)胞中的表達(dá)與定位。結(jié)果 包裝病毒顆粒的PCR分析顯示，成功獲得了重組腺病毒Ad-flag-AWP1，該重組腺病毒能夠高效感染ECV304細(xì)胞，并在激光掃描共焦顯微鏡下觀察到AWP1在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，且定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。結(jié)論 成功構(gòu)建了flag-AWP1的重組腺病毒基因轉(zhuǎn)染載體，AWP1在ECV304細(xì)胞中的表達(dá)與定位提示AWP1可能具有細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的潛能，尚需進(jìn)一步研究。
目的 構(gòu)建人白細(xì)胞介素(human interleukin, hIL)-10和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)雙表達(dá)腺病毒載體，觀察目的基因在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的表達(dá)。方法 以T載體(pUCm-T/hIL-10 cDNA)為模板，PCR擴(kuò)增hIL-10 cDNA，連入穿梭質(zhì)粒，〖JP2〗卡那霉素抗性篩選，Not Ⅰ、Xhol Ⅰ酶切鑒定，測序，局部序列搜索工具(BLAST)分析序列正確，Pme Ⅰ 酶切，電穿孔單獨(dú)轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1，轉(zhuǎn)化XL10-Gold擴(kuò)增，PacⅠ酶切，AD-293細(xì)胞包裝，PCR鑒定，測定病毒滴度，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染VSMCs，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中hIL-10的含量。結(jié)果 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確，同源重組后PacⅠ酶切獲得30 kb和3 kb片段，重組病毒滴度為3×1010 efu/ml，PCR檢測含目的基因，轉(zhuǎn)染的VSMCs可見綠色熒光，hIL-10含量為25 ng/106個細(xì)胞。結(jié)論 構(gòu)建的雙表達(dá)載體于VSMCs成功表達(dá)，為血管內(nèi)膜增生的基因治療打下基礎(chǔ)。
目的 構(gòu)建攜帶反義二型基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）基因的重組腺病毒。方法 從新鮮肝癌組織中提取總RNA,用RT-PCR法合成MMP2 cDNA序列中5′端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近長約500 bp的基因片段，將此片段反義克隆到腺病毒載體(AdEasy)系統(tǒng)的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞生成攜帶反義MMP2基因的重組腺病毒AdMMP2AS。結(jié)果 成功構(gòu)建并包裝攜帶反義MMP2基因片段的重組腺病毒Ad-MMP2AS，病毒滴度達(dá)1×108/ml。結(jié)論 構(gòu)建的重組腺病毒Ad-MMP2AS可望能有效地將反義MMP2基因片段導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究肝癌浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)理以及探討抑制肝癌浸潤和轉(zhuǎn)移的方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的構(gòu)建肝癌特異性HSVTK/GCV重組腺病毒相關(guān)病毒質(zhì)粒并了解其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。方法以腺病毒相關(guān)病毒的質(zhì)粒WAV2作為載體，將TK基因插在甲胎蛋白（AFP）增強(qiáng)子/白蛋白啟動子(AFP增強(qiáng)子/ALB啟動子)的調(diào)控基因的下游，重組成pWAV2/AFPALB/HYTK質(zhì)粒載體。同時構(gòu)建質(zhì)粒載體pEGFP1/AFPALB。然后將上述兩種不同載體分別轉(zhuǎn)入AFP陽性表達(dá)的HepG2細(xì)胞株以及陰性表達(dá)的7721、SPC 和7901細(xì)胞株。結(jié)果綠色熒光蛋白只在AFP陽性表達(dá)的HepG2細(xì)胞株表達(dá)，采用PCR技術(shù)，以HSVTK的引物擴(kuò)增所抽提的總DNA中，只有AFP陽性表達(dá)的HepG2細(xì)胞株擴(kuò)增出了710 bp的DNA片段。結(jié)論pWAV2/AFPALB/HYTK質(zhì)粒載體在體外實(shí)驗(yàn)中具有很好的靶向性。
目的構(gòu)建攜帶反義多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)的重組腺病毒并轉(zhuǎn)染人肝癌耐藥細(xì)胞株，為肝癌耐藥的基因治療提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。 方法將MRP基因片段反向克隆到腺病毒載體質(zhì)粒pAdTrackCMV上，與骨架質(zhì)粒在細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行同源重組，經(jīng)293細(xì)胞包裝、擴(kuò)增后得到攜帶反義MRP的重組腺病毒AdEasyGFPASmrp，再用其轉(zhuǎn)染人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC7721/ADM。結(jié)果成功地構(gòu)建了攜帶反義MRP的重組腺病毒，病毒滴度為2.5×109 efu/ml，多重感染復(fù)數(shù)為100時對SMMC7721/ADM細(xì)胞株轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達(dá)90%以上。結(jié)論構(gòu)建的重組腺病毒AdEasyGFPASmrp可望有效地將反義MRP導(dǎo)入人肝癌耐藥細(xì)胞株，為肝癌耐藥機(jī)理及其逆轉(zhuǎn)方式的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的 探討重組腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)的制備以及作為肝癌基因治療載體的可行性。 方法 重組報告基因加強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)基因至質(zhì)粒載體pSub201，用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法制備重組腺病毒相關(guān)病毒顆粒(rAAV/EGFP)，觀察其對肝癌細(xì)胞系的感染性。結(jié)果 用常規(guī)的雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法能制備高產(chǎn)量的rAAV(107～108感染單位/10 cm板)； 當(dāng)病毒感染多重性(MOI)=100時，rAAV/EGFP對肝癌細(xì)胞HepG2的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)100%。結(jié)論 重組腺病毒相關(guān)病毒可有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因至肝癌細(xì)胞，其作為肝癌的基因治療載體具有較好的研究前景。
目的 測定攜帶小鼠內(nèi)皮抑素（ mES ）基因的腺病毒（ Ad-mES ）在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，觀察 mES 對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。方法 分別以0.01、0.1、1、10及100共5個不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的Ad-mES轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株（LLC）。采用免疫組織化學(xué)法及Western blot檢測Ad-mES轉(zhuǎn)染LLC 48 h后mES蛋白的表達(dá)；應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)比色（MTT）分析法測定不同MOI值A(chǔ)d-mES轉(zhuǎn)染上清對基礎(chǔ)狀態(tài)下及經(jīng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）的增殖抑制作用。結(jié)果Ad-mES轉(zhuǎn)染LLC 48 h后，LLC細(xì)胞漿內(nèi)可見棕黃色mES陽性表達(dá)顆粒，培養(yǎng)上清可表達(dá)位于相對分子質(zhì)量20 000的mES陽性條帶，而未轉(zhuǎn)染對照組呈陰性。隨轉(zhuǎn)染Ad-mES MOI值的增高，培養(yǎng)上清基礎(chǔ)條件下及經(jīng)bFGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用越顯著（與基礎(chǔ)條件下比較，Plt;0.05）。結(jié)論 構(gòu)建的Ad-mES轉(zhuǎn)染LLC后能夠表達(dá)分泌mES；表達(dá)分泌于培養(yǎng)上清中的mES對血管內(nèi)皮細(xì)胞（尤其是bFGF刺激）具有明顯的增殖抑制作用。
目的 觀察Fas 相關(guān)死亡域樣白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白( FLIP) 重組體腺病毒滴鼻吸入對大鼠肺組織FLIP表達(dá)的影響以及對急性肺損傷( ALI) 的防治效果。方法 48 只SD 大鼠隨機(jī)分為4 組, 每組12 只。FLIP治療組: 脂多糖( LPS) 腹腔注射法建立大鼠ALI 模型, 制模后給予Ad-FLIP腺病毒滴鼻吸入; FLIP 預(yù)防組: 先以Ad-FLIP 腺病毒感染大鼠然后復(fù)制ALI 模型。對照治療組和對照預(yù)防組則分別在制模之后和之前, 給予增強(qiáng)型綠色熒光蛋白( EGFP) 腺病毒載體作為對照。觀察各組大鼠的一般情況和肺大體標(biāo)本, 光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變, 測定肺組織濕干重比( W/D) 和肺通透性指數(shù)( LPI) 。采用RT-PCR、免疫組化法檢測并比較各組肺組織FLIP 的表達(dá)水平。結(jié)果 FLIP治療組和預(yù)防組與各對照組相比, 大鼠一般情況較好, 肺大體標(biāo)本和組織病理學(xué)改變減輕, 肺組織濕干重比、肺通透性指數(shù)降低, 肺組織FLIP 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著增高( P lt; 0. 01) 。結(jié)論 滴鼻吸入FLIP 重組體腺病毒能夠上調(diào)大鼠肺組織的FLIP 表達(dá), 保護(hù)肺呼吸膜, 減輕肺水腫,對大鼠ALI 有一定防治作用。
目的 測定重組腺病毒介導(dǎo)β半乳糖苷酶基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，為利用人類單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK)基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞治療肺癌提供依據(jù)。 方法 將轉(zhuǎn)染β半乳糖苷酶(LacZ)的重組腺病毒AD5F35（AD5F35LacZ）加入培養(yǎng)有內(nèi)皮祖細(xì)胞的24孔板，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后用LacZ檢測試劑盒染色，計(jì)算轉(zhuǎn)染率。結(jié)果 在光學(xué)顯微鏡下觀察，藍(lán)色細(xì)胞為AD5F35LacZ基因轉(zhuǎn)染成功的內(nèi)皮祖細(xì)胞。在不同感染復(fù)數(shù)MOI的前提下，腺病毒對內(nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率是不同的，在一定的范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染率隨MOI的增大而增大，在MOI達(dá)到400時，轉(zhuǎn)染率最大，為98.38%±1.25%。 結(jié)論 重組腺病毒可成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率隨MOI的增大而增大，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為400時轉(zhuǎn)染率最大。
目的 應(yīng)用含人血紅素加氧酶 - 1基因 (human Heme Oxygenase- 1,h HO- 1)的重組腺病毒 (Adeno- XTMh HO- 1,Ad- h HO- 1)轉(zhuǎn)染靜脈移植血管 ,觀察 h HO- 1基因預(yù)防靜脈移植血管內(nèi)膜增生的作用?！》椒ā?2 1只日本大耳白兔分為 3組 ,對照組 ,Ad- null組和 Ad- h HO- 1組 ,每組各 7只。在兔頸外靜脈移植于頸總動脈的血管移植術(shù)前分別應(yīng)用肝素生理鹽水、Ad- null和 Ad- h HO- 1病毒液常溫浸泡靜脈移植血管 30 min。術(shù)后 2 8d病理切片觀察移植血管內(nèi)膜增生的情況 ,計(jì)算機(jī)圖象分析儀計(jì)算新生內(nèi)膜厚度、中膜厚度及二者比值 ;采用免疫組織化學(xué)染色方法 (S- P法 )觀察術(shù)后 14 d、2 8d移植血管壁 h HO- 1蛋白表達(dá)情況?！〗Y(jié)果 Ad- h HO- 1組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜厚度與中膜厚度比均顯著低于Ad- null組和對照組 (Plt;0 .0 1) ,中膜厚度差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Pgt;0 .0 5 )。 Ad- h HO- 1組靜脈血管壁細(xì)胞 h HO- 1免疫組化染色陽性...更多?！〗Y(jié)論 Ad- h HO- 1轉(zhuǎn)染兔靜脈旁路移植血管能夠抑制內(nèi)膜增生。