• 1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科(合肥230022);;
  • 2.復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院血管外科(上海200032);;
  • 3.復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院實驗中心(上海200032);

目的 　構(gòu)建人白細(xì)胞介素(human interleukin, hIL)-10和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)雙表達(dá)腺病毒載體，觀察目的基因在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的表達(dá)。
方法 　以T載體(pUCm-T/hIL-10 cDNA)為模板，PCR擴(kuò)增hIL-10 cDNA，連入穿梭質(zhì)粒，〖JP2〗卡那霉素抗性篩選，Not Ⅰ、Xhol Ⅰ酶切鑒定，測序，局部序列搜索工具(BLAST)分析序列正確，Pme Ⅰ 酶切，電穿孔單獨轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1，轉(zhuǎn)化XL10-Gold擴(kuò)增，PacⅠ酶切，AD-293細(xì)胞包裝，PCR鑒定，測定病毒滴度，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染VSMCs，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中hIL-10的含量。
結(jié)果 　重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確，同源重組后PacⅠ酶切獲得30 kb和3 kb片段，重組病毒滴度為3×1010 efu/ml，PCR檢測含目的基因，轉(zhuǎn)染的VSMCs可見綠色熒光，hIL-10含量為25 ng/106個細(xì)胞。
結(jié)論 　構(gòu)建的雙表達(dá)載體于VSMCs成功表達(dá)，為血管內(nèi)膜增生的基因治療打下基礎(chǔ)。

引用本文： 汪圣毅,王玉琦,符偉國,劉康達(dá),劉弋. 白細(xì)胞介素-10腺病毒載體制備及其在血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá). 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2007, 14(6): 660-664. doi: 復(fù)制

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