目的研究雪旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）對BMSCs來源內(nèi)皮細(xì)胞分泌一氧化氮（nitric oxide，NO）功能的影響，為進(jìn)一步探究組織工程骨成骨過程中神經(jīng)因素對血管因素的作用奠定實驗基礎(chǔ)。 方法取1日齡SD乳鼠坐骨神經(jīng)及臂叢神經(jīng)，體外分離獲取SCs，采用S-100免疫組織化學(xué)染色鑒定；取2周齡SD大鼠脛骨及股骨骨髓，體外分離獲取BMSCs，誘導(dǎo)分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，采用血管性血友病因子與CD31免疫熒光染色鑒定。采用Transwell共培養(yǎng)板對SCs與BMSCs來源內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)作為實驗組，單純培養(yǎng)BMSCs來源內(nèi)皮細(xì)胞作為對照組，分別于1、3、5、7 d檢測培養(yǎng)液中NO濃度，1、3、7、10 d采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測一氧化氮合酶2（nitric oxide synthetase 2，NOS2）、NOS3 mRNA表達(dá)。 結(jié)果分離及誘導(dǎo)分化的細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色鑒定為SCs和內(nèi)皮細(xì)胞。實驗組及對照組內(nèi)各時間點間釋放NO濃度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；除3 d外，其余各時間點實驗組釋放NO濃度均顯著高于對照組（P＜0.05）。RT-qPCR檢測結(jié)果示，培養(yǎng)各時間點實驗組NOS2 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05）；兩組內(nèi)各時間點間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。除10 d外，其余各時間點實驗組NOS3 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05）；實驗組內(nèi)各時間點間NOS3 mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.673，P=0.062），對照組內(nèi)各時間點間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.581，P=0.000）。 結(jié)論SCs可促進(jìn)BMSCs來源內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，可能與SCs促進(jìn)NOS活性有關(guān)。
目的 通過檢測熒光微球655（quantum dot 655，QD655）標(biāo)記SD 大鼠BMSCs 的體外細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞貼附性以及標(biāo)記率，探討QD655 標(biāo)記BMSCs 及其示蹤的可行性。 方法 收集2 周齡健康SD 大鼠股骨和脛骨骨髓，貼壁培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs 采用QD655 標(biāo)記作為實驗組，以未標(biāo)記BMSCs 作為對照組，采用錐蟲藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞存活率，MTT 法觀察QD655 對細(xì)胞增殖性的影響；取實驗組BMSCs 向成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2 周，采用茜素紅、ALP 染色定性鑒定細(xì)胞成骨分化能力，實時熒光定量PCR 鑒定標(biāo)記對細(xì)胞成骨分化的影響；分別在標(biāo)記后即刻、1、2、4、6 周采用熒光顯微鏡動態(tài)檢測實驗組BMSCs 陽性標(biāo)記率；掃描電鏡觀察實驗組細(xì)胞在膠原/ 生物活性玻璃復(fù)合材料上的貼附性。 結(jié)果 實驗組與對照組細(xì)胞存活率均gt;90%，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；培養(yǎng)1、3、5、7、9 d，兩組細(xì)胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。實驗組BMSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化2 周后，茜素紅及ALP 染色均呈陽性，實時熒光定量PCR 檢測實驗組BMSCs 的骨橋蛋白、骨鈣素、Ⅰ型膠原、ALP、BMP-2 mRNA 較對照組成倍數(shù)高表達(dá)。實驗組BMSCs 標(biāo)記后即刻陽性標(biāo)記率達(dá)96.50% ± 1.59%，隨著標(biāo)記時間延長標(biāo)記率下降，標(biāo)記后1、2、4、6 周標(biāo)記率分別為93.30% ± 1.51%、72.40% ± 2.90%、40.10% ± 3.60%、10.00% ± 1.70%，對照組各時間點陽性標(biāo)記率均為0。掃描電鏡觀察示實驗組標(biāo)記后細(xì)胞和材料貼附良好。 結(jié)論 QD655 對大鼠BMSCs 標(biāo)記時間長，標(biāo)記率及安全性高，是一種良好標(biāo)記 物。
目的 研究植入了感覺神經(jīng)束和血管束的組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損對神經(jīng)激肽1 受體（neurokinin 1 receptor，NK1R）和血管活性腸肽受體1（vasoactive intestinal peptide type 1 receptor，VIPR1）表達(dá)的影響。 方 法 5 月齡健康新西蘭大白兔54 只，抽取髂骨紅骨髓，全骨髓貼壁篩選法分離、培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，與β 磷酸三鈣支架復(fù)合培養(yǎng)制備組織工程骨。將54 只兔制備單側(cè)股骨1.5 cm 缺損模型，隨機(jī)分成3 組（n=18），分別在修復(fù)缺損的組織工程骨側(cè)槽中植入感覺神經(jīng)束（A 組）、股血管束（B 組），以及空白對照（C 組）。術(shù)后4、8、12 周各組分別處死6 只兔，對修復(fù)骨段進(jìn)行大體觀察、X 線片檢查成骨情況，提取總RNA 行實時熒光定量PCR 檢測NK1R mRNA 和VIPR1 mRNA 的表達(dá)情況，并行免疫組織化學(xué)染色檢測NK1R 和VIPR1 的表達(dá)情況。 結(jié)果 大體觀察和X 線片檢查均顯示A、B 組成骨情況優(yōu)于C 組。各組X 線片評分隨時間延長逐漸升高。術(shù)后4 周B 組X 線片評分高于A、C 組（P lt; 0.05），A、C 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；術(shù)后8、12 周A、B 組X 線片評分高于C 組（P lt; 0.05）；A、B 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。實時熒光定量PCR 檢測示各組NK1R mRNA 和VIPR1 mRNA 的表達(dá)量均于術(shù)后8 周達(dá)峰值，各時間點間表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；各時間點A、B 組NK1R mRNA 和VIPR1 mRNA 表達(dá)均高于C 組（P lt; 0.05）， B 組高于A 組（P lt; 0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示，各組NK1R 和VIPR1 的陽性表達(dá)均在術(shù)后8 周最強，且A、B 組的表達(dá)強于C 組。 結(jié)論 血管束植入法可以替代感覺神經(jīng)束植入法構(gòu)建血管、神經(jīng)化組織工程骨，并能促進(jìn)神經(jīng)肽受體的表達(dá)，避免因感覺神經(jīng)束植入導(dǎo)致支配區(qū)的感覺缺失，是一種較理想的復(fù)合組織工程骨構(gòu)建方法。
目的 骨組織工程所使用的支架材料能否快速、有效地血管化是骨修復(fù)的關(guān)鍵。研究增強型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料對血管化的協(xié)同和促進(jìn)作用，為構(gòu)建血管化組織工程骨修復(fù)骨缺損尋找適宜的支架材料。 方法 體外分離獲取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），并通過血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與CD34 抗原鑒定，取第1 代細(xì)胞用于實驗。將細(xì)胞接種于增強型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料上，掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附情況。取細(xì)胞接種于增強型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料作為實驗組，等量細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)作為對照組，采用alarmarBlue 法動態(tài)檢測細(xì)胞增殖率，實時熒光定量PCR 檢測內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體1（fms-related tyrosine kinase 1，F(xiàn)lt-1）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（kinase insert domain receptor，Kdr）的mRNA 表達(dá)。取SD 大鼠6 只，將支架材料包埋于大鼠股內(nèi)側(cè)皮下，實驗組采用增強型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料、中央軸向植入血管束，對照組采用非增強型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料，分別于植入5、10 d 取出，行冰凍切片并HE 染色動態(tài)觀察支架材料內(nèi)部的血管化狀態(tài)。 結(jié)果 分離的細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)及vWF、CD34 免疫熒光鑒定為HU VECs。掃描電鏡示HUVECs 在支架材料上黏附較好。HUVECs 在實驗組支架材料上增殖明顯，在第3 天后細(xì)胞增殖率開始高于對照組，11 d 達(dá)到增殖平臺期時細(xì)胞數(shù)仍多于對照組（P lt; 0.05）。實時熒光定量PCR 檢測示，培養(yǎng)3 d 實驗組VEGF、Flt-1、Kdr 的mRNA 表達(dá)均顯著高于對照組（P lt; 0.05）。包埋大鼠皮下實驗可見，實驗組5、10 d 時植入的血管仍通暢，其周圍新生血管隨時間延長而增多，材料周緣可見宿主血管浸潤生長，但新生血管稀疏；對照組僅有纖維組織生長，10 d 時材料已大部分降解，組織難以長入。 結(jié)論 增強型生物活性玻璃/ 膠原復(fù)合材料在大鼠體內(nèi)外可促進(jìn)血管化，可能適于作為構(gòu)建血管化組織工程骨的支架材料。