引用本文： 蔡喜雨, 张鑫鑫, 姜晓锐, 江汕, 裴国献. 雪旺细胞对BMSCs来源内皮细胞分泌一氧化氮的作用研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(8): 998-1003. doi: 10.7507/1002-1892.20140220 复制
组织工程骨在成骨过程中受多种因素影响，其中支架材料中新生血管及时生成尤为重要。长入支架材料的血管可为种子细胞提供营养和氧，并转运细胞代谢产物，以确保种子细胞在支架材料中存活和进一步增殖[1-2]。然而新生骨成熟时还需有神经作用，神经可参与骨代谢、分泌和造血过程[3-5]。在临床实践中我们发现，中枢神经损伤患者其远端成骨效率强于无中枢神经损伤患者，提示神经也是影响组织工程骨成骨的重要因素。同时神经与血管也相互作用。神经纤维是由雪旺细胞（Schwann cells，SCs）构成的髓鞘包绕神经细胞轴突构成，SCs可分泌多种神经营养因子，其中脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor，BDNF）在体外可促进人脐静脉内皮细胞迁移和管状结构形成，其促血管新生作用与VEGF相当[6]。同时血管内皮细胞分泌的VEGF具有神经营养作用，并能刺激轴突生长、增强细胞存活及外周神经系统中SCs增殖。内皮细胞是构成血管内膜的重要细胞，内皮细胞所分泌的一氧化氮（nitric oxide，NO）能够调节血管张力、保护内皮细胞免受损伤、抑制血小板聚集、调节炎性细胞黏附，是舒张与收缩血管的重要物质[7]。本研究旨在观察生理性成骨过程中SCs对BMSCs来源内皮细胞分泌NO的作用，为进一步探究组织工程骨成骨过程中神经因素如何通过血管因素起作用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
1日龄SD乳鼠3只，2周龄SD大鼠2只，雌雄不限，均由南方医科大学实验动物中心提供。
SD大鼠BMSCs培养液（Cyagen公司，美国）；阿糖胞苷、Ⅰ型胶原酶、明胶、青霉素钠、链霉素（Sigma公司，美国）；Forskolin（Biovision公司，美国）；EGM-2培养基（Lonza公司，美国）；DMEM基础培养基（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶、FBS （GIBCO公司，美国）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗体、小鼠CD31单克隆抗体、小鼠源S-100单克隆抗体（Abcam公司，美国）；兔抗CD34单克隆抗体（天津三箭生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗、DyLight 594标记山羊抗兔IgG、DyLight 488标记小鼠抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；抗体稀释液（武汉博士德生物工程有限公司）；NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol抽提液（Invitrogen公司，美国）。Transwell共培养板（BD公司，美国）；iQ5实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；NO-1000全波长紫外 /可见光扫描分光光度计（Nano Drop公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）。
1.2 SCs分离培养及鉴定
1.2.1 SCs分离培养
取1日龄SD乳鼠3只，75%乙醇浸泡5 min。剪开大腿后外侧以及前肢胸前至前臂皮肤，深层分离组织，获取坐骨神经与臂丛神经，置于预冷PBS中；体视显微镜下剥离神经外膜，眼科剪剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 组织块，PBS漂洗2～3次，以离心半径12 cm、1 000 r/min离心30 s，弃上清。加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃消化7 min，加入含10%FBS的DMEM基础培养基终止消化，以离心半径12 cm、1 000 r/ min离心1 min，弃上清；取出沉淀的组织块贴壁于多聚赖氨酸包被过夜的6孔培养板中，待风干1 min后沿壁滴加SCs培养液（含10%FBS、2 μmol/L Forskolin以及1 × 10-5 mol/L阿糖胞苷的DMEM基础培养基），置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合达70%～80%时进行传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.2.2 SCs鉴定
取第2代SCs制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗后加入3%H2O2，室温放置20 min；PBS漂洗后加入正常山羊封闭血清，37℃封闭30 min；加入1∶200稀释的小鼠源S-100单克隆抗体，4℃过夜。次日取出，PBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗，37℃放置30 min；PBS漂洗后加入AEC显色液，37℃放置10 min；PBS漂洗后加入苏木素复染1 min，封片，倒置相差荧光显微镜下观察。
1.3 BMSCs分离培养及向内皮细胞诱导分化
1.3.1 BMSCs分离培养
取2周龄SD大鼠2只，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡5 min。剪开双后肢皮肤及肌肉，显露并完整剪下股骨头至胫腓骨下端间骨质，剔除外周软组织，剪去股骨与胫骨两端；2 mL注射器针头插入骨髓腔，PBS冲洗2～3次，收集冲洗液，以离心半径12 cm、1 000 r/min离心10 min；弃上清，加入SD大鼠BMSCs培养液3 mL，吹打均匀，接种于25 cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。24 h后PBS漂洗并更换培养液，此后2～3 d换液1次。待细胞融合达70%～80%时进行传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.3.2 BMSCs向内皮细胞诱导分化及鉴定
第3代BMSCs融合达70%时，PBS漂洗2～3次，以EGM-2培养基培养，2～3 d换液1次，诱导分化28 d。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。取诱导分化28 d的BMSCs，重悬后制成细胞爬片，分别进行以下鉴定：① vWF免疫荧光染色鉴定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封闭血清，37℃封闭30 min；加入1∶400稀释的兔抗vWF多克隆抗体，放入湿盒，4℃过夜；次日PBS漂洗后加入1∶200稀释的DyLight 594标记山羊抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差荧光显微镜下观察。② CD31免疫荧光染色鉴定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封闭血清，37℃封闭30 min；加入1∶100稀释的小鼠CD31单克隆抗体，放入湿盒，4℃过夜；次日PBS漂洗，加入1∶200稀释的DyLight 488标记小鼠抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差荧光显微镜下观察。
1.4 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞释放NO的影响
取第2代纯化后的SCs和诱导培养28 d的BMSCs，分别以0.25%胰蛋白酶消化后以EGM-2培养基重悬，调整细胞密度至1 ×105个/mL。取孔径为0.4 μm的Transwell共培养板，实验分为2组，实验组上室接种100 μL SCs细胞悬液，添加EGM-2培养基至1.6 mL，下室接种100 μL BMSCs来源内皮细胞细胞悬液，添加EGM-2培养基至2.4 mL；对照组仅于下室接种100 μL BMSCs来源内皮细胞细胞悬液，添加EGM-2培养基至4 mL。每组设3个复孔，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。分别于培养后1、3、5、7 d收集培养液，根据NO检测试剂盒说明书绘制的内皮细胞诱导培养液NO浓度-吸光度（A）值标准曲线，计算NO浓度。
1.5 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞一氧化氮合酶2（nitric oxide synthetase 2，NOS2）与NOS3表达的影响
同1.4方法将SCs与BMSCs来源内皮细胞共培养（培养液更换为含5%FBS的EGM-2培养基），每组设3个复孔。培养1、3、7、10 d，采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测下层BMSCs来源内皮细胞的NOS2与NOS3 mRNA表达。抽提样品总RNA，其中细胞总RNA在液氮冷冻状态下研磨后加入Trizol并纯化获得。引物序列：NOS2上游5'-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3'，下游3'-A-TTGGACTTCGGGCTTCTGGG-5'；NOS3上游5'-GC-GGCTGGTACATGAGTTCAGA-3'，下游3'-ACACCG-ACAGACGTACCTAGA-5'；内参GAPDH上游5'-GG-ACCAGGTTGTCTCCTGTG-3'，下游3'-TGTAGGCCA-TGAGGTCCAC-5'。采用标准三步法进行反应：预变性95℃、10 min，1个循环；变性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、15 s，40个循环；延伸结束后进行检测，温度间隔为0.5℃，温度梯度为72～95℃与30℃，时间分别为每次6 s与30 s，进行熔解曲线分析检测。采用2-ΔΔCt 法分析两组NOS2与NOS3 mRNA相对表达量。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数 ± 标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SCs形态学观察与鉴定
倒置相差显微镜观察示，原代及第1代SCs呈双极或单极，胞体极窄，伸出长丝状突触，形似麦芒；原代培养的SCs中成纤维细胞较多，细胞不易观察（图 1）。纯化后的第2代SCs均匀分布时细胞突触交叉呈网格状生长。S-100免疫组织化学染色示，细胞质呈褐色，为阳性反应（图 2）。
图1
SCs形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 原代培养3 d ⓑ 第1代培养3 d 2.2 BMSCs形态学观察及向内皮细胞诱导分化鉴定
倒置相差显微镜观察示，原代及第3代BMSCs均呈梭形、三角形或多角形，边界清晰；第3代细胞平行排列，排列紧密处可呈草束状（图 3）。诱导培养28 d，细胞形态更为圆钝，细胞核增大，融合成“铺路石”样（图 4 a）。vWF免疫荧光染色鉴定示，大部分细胞细胞质呈强红色荧光（图 4 b）；CD31免疫荧光染色鉴定示，大部分细胞细胞膜呈绿色荧光（图 4 c）。
2.3 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞释放NO的影响
实验组释放NO浓度在3 d达最低点，此后呈上升趋势；对照组第3天高于1 d，在5 d达最低点，7 d时略有升高。两组内各时间点间释放NO浓度比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。1、5、7 d时实验组释放NO浓度均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；3 d时两组比较，差异无统计学意义（t=1.049，P=0.364）。见图 5。
图5
两组培养各时间点BMSCs来源内皮细胞释放NO浓度比较
Figure5.
NO concentration of medium for BMSCs derived endothelial cells in 2 groups at different time points
2.4 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞NOS2与NOS3 mRNA表达的影响
RT-qPCR检测结果显示，培养各时间点实验组NOS2 mRNA相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；两组内各时间点间比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。除第10天外，实验组NOS3 mRNA相对表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；实验组内各时间点间NOS3 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（F=6.673，P=0.062），对照组内各时间点间比较差异有统计学意义（F=36.581，P=0.000）。见表 1。
表1
两组培养后各时间点NOS2和NOS3 mRNA相对表达量比较（n=3，3 讨论
成熟的具有生理功能的组织工程骨需同时具备血管网络与神经纤维。血管网络是新生骨早期成活的关键因素，其对组织工程骨构建的重要作用已有大量研究证实；神经纤维对组织工程骨形成同样具有重要作用。在骨质中，来自感觉神经与自主神经的神经肽可直接作用于骨细胞，如感觉神经分泌的P物质、降钙素基因相关肽，副交感神经分泌的血管活性肠肽以及交感神经分泌的神经肽Y等[8-10]。目前研究多集中于血管因素对新骨形成的作用，而神经因素在新骨生成中的作用研究较少，血管及神经因素相互作用的研究更少。
一些学者采用糖尿病神经损伤、脑卒中疾病模型，进行神经、血管相互作用研究。SCs与神经细胞可分泌多种神经营养因子，如神经营养因子、BDNF、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、VEGF、FGF等，对血管内皮细胞均有特定而广泛的作用。如神经营养因子是交感神经元中提供神经营养和促进神经生长的主要因子，也可作为一种促血管因子在诸多疾病中起作用；另外，BDNF对血管新生也具有促进作用[11-13]。因此我们认为在新骨形成过程中，神经可能通过促血管生成对成骨起间接作用。
BMSCs在体外向内皮细胞方向诱导分化的机制及诱导方法并不成熟，但多采用含有VEGF的培养基。本研究采用EGM-2培养基，其中含有EGF、VEGF、bFGF、IGF、氢化可的松、抗坏血酸以及肝素钠。本研究通过S-100免疫组织化学染色鉴定表明，BMSCs诱导分化的细胞为具有正常功能的内皮细胞，可用于后期的功能测定实验。
NO由NOS合成，在体内以自由基形式存在。NOS具有3种不同形式，神经型（neuronal NOS，nNOS）、内皮型（endothelial NOS，eNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS）[14-15]。与血管功能及再生关系最密切的是iNOS与eNOS。其中，iNOS可转运内皮细胞产生的NO，促进内皮细胞增殖，加速血管修复；eNOS可维持内皮组织与周围组织微环境稳态，是微循环中保证组织局部正常血液灌流的重要调节因子[16]。此外，NO与VEGF的关系极为密切。VEGF对eNOS与iNOS介导的血管新生具有诱导作用[6]；同时eNOS与iNOS为VEGF提供细胞信号转导的靶点，尤其在缺氧、脂质过氧化、血管受损等病理生理过程中为VEGF修复局部内皮组织、改善血管通透性提供必要的微环境[17-19]。此外，由于NO极不稳定，本研究中只能通过检测NO2-的浓度间接测定NO浓度，并检测合成NO的NOS相关基因NOS2与NOS3表达，进一步阐释血管内皮细胞在SCs作用下分泌NO的情况。本研究通过非接触共培养体系检测发现，SCs对BMSCs来源内皮细胞的NOS2与NOS3 mRNA表达均有促进作用，且随时间延长该作用有累积效应。提示SCs能够上调BMSCs来源内皮细胞的NOS相关基因表达，活化NOS，从而促进NO生成、转运及在局部聚集，促进血管再生，进而间接促进组织工程骨形成。
综上述，本实验结果提示SCs可促进BMSCs来源内皮细胞分泌NO，为后期研究组织工程骨形成过程中神经因素对血管因素的作用奠定了实验基础。但内皮细胞具有多种分泌功能，其产生的多种细胞因子及其他大分子对血管化及成骨均具有促进作用，而本研究仅针对其分泌NO的功能进行研究，有一定局限性。为了更好阐释神经因素对血管化及间接对组织工程骨成骨的作用，尚需进行更为全面的研究。
组织工程骨在成骨过程中受多种因素影响，其中支架材料中新生血管及时生成尤为重要。长入支架材料的血管可为种子细胞提供营养和氧，并转运细胞代谢产物，以确保种子细胞在支架材料中存活和进一步增殖[1-2]。然而新生骨成熟时还需有神经作用，神经可参与骨代谢、分泌和造血过程[3-5]。在临床实践中我们发现，中枢神经损伤患者其远端成骨效率强于无中枢神经损伤患者，提示神经也是影响组织工程骨成骨的重要因素。同时神经与血管也相互作用。神经纤维是由雪旺细胞（Schwann cells，SCs）构成的髓鞘包绕神经细胞轴突构成，SCs可分泌多种神经营养因子，其中脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor，BDNF）在体外可促进人脐静脉内皮细胞迁移和管状结构形成，其促血管新生作用与VEGF相当[6]。同时血管内皮细胞分泌的VEGF具有神经营养作用，并能刺激轴突生长、增强细胞存活及外周神经系统中SCs增殖。内皮细胞是构成血管内膜的重要细胞，内皮细胞所分泌的一氧化氮（nitric oxide，NO）能够调节血管张力、保护内皮细胞免受损伤、抑制血小板聚集、调节炎性细胞黏附，是舒张与收缩血管的重要物质[7]。本研究旨在观察生理性成骨过程中SCs对BMSCs来源内皮细胞分泌NO的作用，为进一步探究组织工程骨成骨过程中神经因素如何通过血管因素起作用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
1日龄SD乳鼠3只，2周龄SD大鼠2只，雌雄不限，均由南方医科大学实验动物中心提供。
SD大鼠BMSCs培养液（Cyagen公司，美国）；阿糖胞苷、Ⅰ型胶原酶、明胶、青霉素钠、链霉素（Sigma公司，美国）；Forskolin（Biovision公司，美国）；EGM-2培养基（Lonza公司，美国）；DMEM基础培养基（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶、FBS （GIBCO公司，美国）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗体、小鼠CD31单克隆抗体、小鼠源S-100单克隆抗体（Abcam公司，美国）；兔抗CD34单克隆抗体（天津三箭生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗、DyLight 594标记山羊抗兔IgG、DyLight 488标记小鼠抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；抗体稀释液（武汉博士德生物工程有限公司）；NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol抽提液（Invitrogen公司，美国）。Transwell共培养板（BD公司，美国）；iQ5实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；NO-1000全波长紫外 /可见光扫描分光光度计（Nano Drop公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）。
1.2 SCs分离培养及鉴定
1.2.1 SCs分离培养
取1日龄SD乳鼠3只，75%乙醇浸泡5 min。剪开大腿后外侧以及前肢胸前至前臂皮肤，深层分离组织，获取坐骨神经与臂丛神经，置于预冷PBS中；体视显微镜下剥离神经外膜，眼科剪剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 组织块，PBS漂洗2～3次，以离心半径12 cm、1 000 r/min离心30 s，弃上清。加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃消化7 min，加入含10%FBS的DMEM基础培养基终止消化，以离心半径12 cm、1 000 r/ min离心1 min，弃上清；取出沉淀的组织块贴壁于多聚赖氨酸包被过夜的6孔培养板中，待风干1 min后沿壁滴加SCs培养液（含10%FBS、2 μmol/L Forskolin以及1 × 10-5 mol/L阿糖胞苷的DMEM基础培养基），置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合达70%～80%时进行传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.2.2 SCs鉴定
取第2代SCs制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗后加入3%H2O2，室温放置20 min；PBS漂洗后加入正常山羊封闭血清，37℃封闭30 min；加入1∶200稀释的小鼠源S-100单克隆抗体，4℃过夜。次日取出，PBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗，37℃放置30 min；PBS漂洗后加入AEC显色液，37℃放置10 min；PBS漂洗后加入苏木素复染1 min，封片，倒置相差荧光显微镜下观察。
1.3 BMSCs分离培养及向内皮细胞诱导分化
1.3.1 BMSCs分离培养
取2周龄SD大鼠2只，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡5 min。剪开双后肢皮肤及肌肉，显露并完整剪下股骨头至胫腓骨下端间骨质，剔除外周软组织，剪去股骨与胫骨两端；2 mL注射器针头插入骨髓腔，PBS冲洗2～3次，收集冲洗液，以离心半径12 cm、1 000 r/min离心10 min；弃上清，加入SD大鼠BMSCs培养液3 mL，吹打均匀，接种于25 cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。24 h后PBS漂洗并更换培养液，此后2～3 d换液1次。待细胞融合达70%～80%时进行传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.3.2 BMSCs向内皮细胞诱导分化及鉴定
第3代BMSCs融合达70%时，PBS漂洗2～3次，以EGM-2培养基培养，2～3 d换液1次，诱导分化28 d。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。取诱导分化28 d的BMSCs，重悬后制成细胞爬片，分别进行以下鉴定：① vWF免疫荧光染色鉴定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封闭血清，37℃封闭30 min；加入1∶400稀释的兔抗vWF多克隆抗体，放入湿盒，4℃过夜；次日PBS漂洗后加入1∶200稀释的DyLight 594标记山羊抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差荧光显微镜下观察。② CD31免疫荧光染色鉴定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封闭血清，37℃封闭30 min；加入1∶100稀释的小鼠CD31单克隆抗体，放入湿盒，4℃过夜；次日PBS漂洗，加入1∶200稀释的DyLight 488标记小鼠抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差荧光显微镜下观察。
1.4 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞释放NO的影响
取第2代纯化后的SCs和诱导培养28 d的BMSCs，分别以0.25%胰蛋白酶消化后以EGM-2培养基重悬，调整细胞密度至1 ×105个/mL。取孔径为0.4 μm的Transwell共培养板，实验分为2组，实验组上室接种100 μL SCs细胞悬液，添加EGM-2培养基至1.6 mL，下室接种100 μL BMSCs来源内皮细胞细胞悬液，添加EGM-2培养基至2.4 mL；对照组仅于下室接种100 μL BMSCs来源内皮细胞细胞悬液，添加EGM-2培养基至4 mL。每组设3个复孔，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。分别于培养后1、3、5、7 d收集培养液，根据NO检测试剂盒说明书绘制的内皮细胞诱导培养液NO浓度-吸光度（A）值标准曲线，计算NO浓度。
1.5 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞一氧化氮合酶2（nitric oxide synthetase 2，NOS2）与NOS3表达的影响
同1.4方法将SCs与BMSCs来源内皮细胞共培养（培养液更换为含5%FBS的EGM-2培养基），每组设3个复孔。培养1、3、7、10 d，采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测下层BMSCs来源内皮细胞的NOS2与NOS3 mRNA表达。抽提样品总RNA，其中细胞总RNA在液氮冷冻状态下研磨后加入Trizol并纯化获得。引物序列：NOS2上游5'-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3'，下游3'-A-TTGGACTTCGGGCTTCTGGG-5'；NOS3上游5'-GC-GGCTGGTACATGAGTTCAGA-3'，下游3'-ACACCG-ACAGACGTACCTAGA-5'；内参GAPDH上游5'-GG-ACCAGGTTGTCTCCTGTG-3'，下游3'-TGTAGGCCA-TGAGGTCCAC-5'。采用标准三步法进行反应：预变性95℃、10 min，1个循环；变性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、15 s，40个循环；延伸结束后进行检测，温度间隔为0.5℃，温度梯度为72～95℃与30℃，时间分别为每次6 s与30 s，进行熔解曲线分析检测。采用2-ΔΔCt 法分析两组NOS2与NOS3 mRNA相对表达量。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数 ± 标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SCs形态学观察与鉴定
倒置相差显微镜观察示，原代及第1代SCs呈双极或单极，胞体极窄，伸出长丝状突触，形似麦芒；原代培养的SCs中成纤维细胞较多，细胞不易观察（图 1）。纯化后的第2代SCs均匀分布时细胞突触交叉呈网格状生长。S-100免疫组织化学染色示，细胞质呈褐色，为阳性反应（图 2）。
图1
SCs形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 原代培养3 d ⓑ 第1代培养3 d 2.2 BMSCs形态学观察及向内皮细胞诱导分化鉴定
倒置相差显微镜观察示，原代及第3代BMSCs均呈梭形、三角形或多角形，边界清晰；第3代细胞平行排列，排列紧密处可呈草束状（图 3）。诱导培养28 d，细胞形态更为圆钝，细胞核增大，融合成“铺路石”样（图 4 a）。vWF免疫荧光染色鉴定示，大部分细胞细胞质呈强红色荧光（图 4 b）；CD31免疫荧光染色鉴定示，大部分细胞细胞膜呈绿色荧光（图 4 c）。
2.3 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞释放NO的影响
实验组释放NO浓度在3 d达最低点，此后呈上升趋势；对照组第3天高于1 d，在5 d达最低点，7 d时略有升高。两组内各时间点间释放NO浓度比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。1、5、7 d时实验组释放NO浓度均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；3 d时两组比较，差异无统计学意义（t=1.049，P=0.364）。见图 5。
图5
两组培养各时间点BMSCs来源内皮细胞释放NO浓度比较
Figure5.
NO concentration of medium for BMSCs derived endothelial cells in 2 groups at different time points
2.4 非接触共培养下SCs对BMSCs来源内皮细胞NOS2与NOS3 mRNA表达的影响
RT-qPCR检测结果显示，培养各时间点实验组NOS2 mRNA相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；两组内各时间点间比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。除第10天外，实验组NOS3 mRNA相对表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；实验组内各时间点间NOS3 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（F=6.673，P=0.062），对照组内各时间点间比较差异有统计学意义（F=36.581，P=0.000）。见表 1。
表1
两组培养后各时间点NOS2和NOS3 mRNA相对表达量比较（n=3，3 讨论
成熟的具有生理功能的组织工程骨需同时具备血管网络与神经纤维。血管网络是新生骨早期成活的关键因素，其对组织工程骨构建的重要作用已有大量研究证实；神经纤维对组织工程骨形成同样具有重要作用。在骨质中，来自感觉神经与自主神经的神经肽可直接作用于骨细胞，如感觉神经分泌的P物质、降钙素基因相关肽，副交感神经分泌的血管活性肠肽以及交感神经分泌的神经肽Y等[8-10]。目前研究多集中于血管因素对新骨形成的作用，而神经因素在新骨生成中的作用研究较少，血管及神经因素相互作用的研究更少。
一些学者采用糖尿病神经损伤、脑卒中疾病模型，进行神经、血管相互作用研究。SCs与神经细胞可分泌多种神经营养因子，如神经营养因子、BDNF、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、VEGF、FGF等，对血管内皮细胞均有特定而广泛的作用。如神经营养因子是交感神经元中提供神经营养和促进神经生长的主要因子，也可作为一种促血管因子在诸多疾病中起作用；另外，BDNF对血管新生也具有促进作用[11-13]。因此我们认为在新骨形成过程中，神经可能通过促血管生成对成骨起间接作用。
BMSCs在体外向内皮细胞方向诱导分化的机制及诱导方法并不成熟，但多采用含有VEGF的培养基。本研究采用EGM-2培养基，其中含有EGF、VEGF、bFGF、IGF、氢化可的松、抗坏血酸以及肝素钠。本研究通过S-100免疫组织化学染色鉴定表明，BMSCs诱导分化的细胞为具有正常功能的内皮细胞，可用于后期的功能测定实验。
NO由NOS合成，在体内以自由基形式存在。NOS具有3种不同形式，神经型（neuronal NOS，nNOS）、内皮型（endothelial NOS，eNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS）[14-15]。与血管功能及再生关系最密切的是iNOS与eNOS。其中，iNOS可转运内皮细胞产生的NO，促进内皮细胞增殖，加速血管修复；eNOS可维持内皮组织与周围组织微环境稳态，是微循环中保证组织局部正常血液灌流的重要调节因子[16]。此外，NO与VEGF的关系极为密切。VEGF对eNOS与iNOS介导的血管新生具有诱导作用[6]；同时eNOS与iNOS为VEGF提供细胞信号转导的靶点，尤其在缺氧、脂质过氧化、血管受损等病理生理过程中为VEGF修复局部内皮组织、改善血管通透性提供必要的微环境[17-19]。此外，由于NO极不稳定，本研究中只能通过检测NO2-的浓度间接测定NO浓度，并检测合成NO的NOS相关基因NOS2与NOS3表达，进一步阐释血管内皮细胞在SCs作用下分泌NO的情况。本研究通过非接触共培养体系检测发现，SCs对BMSCs来源内皮细胞的NOS2与NOS3 mRNA表达均有促进作用，且随时间延长该作用有累积效应。提示SCs能够上调BMSCs来源内皮细胞的NOS相关基因表达，活化NOS，从而促进NO生成、转运及在局部聚集，促进血管再生，进而间接促进组织工程骨形成。
综上述，本实验结果提示SCs可促进BMSCs来源内皮细胞分泌NO，为后期研究组织工程骨形成过程中神经因素对血管因素的作用奠定了实验基础。但内皮细胞具有多种分泌功能，其产生的多种细胞因子及其他大分子对血管化及成骨均具有促进作用，而本研究仅针对其分泌NO的功能进行研究，有一定局限性。为了更好阐释神经因素对血管化及间接对组织工程骨成骨的作用，尚需进行更为全面的研究。
