目的 檢測(cè)高遷移率族蛋白B1( HMGB1) 和α平滑肌肌動(dòng)蛋白( α-SMA) 在博萊霉素( BLM) 致小鼠肺纖維化模型肺內(nèi)的表達(dá)水平, 探討HMGB1 在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 取20 只4 ～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠, 隨機(jī)分為BLM組和生理鹽水( NS) 對(duì)照組, 每組10 只。分別向氣管內(nèi)灌注BLM( 3 mg /kg) 和NS, 10 d 后處死小鼠。應(yīng)用RT-PCR 法檢測(cè)兩組肺組織HMGB1 和α-SMA的mRNA 表達(dá)水平, 應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)兩組肺組織中HMGB1 和α-SMA的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 RT-PCR 半定量和免疫組織化學(xué)半定量分析結(jié)果顯示, BLM組HMGB1 的mRNA 和蛋白表達(dá)均較NS 對(duì)照組顯著增加( 0. 61 ±0. 08 比0. 15 ±0. 02, 13. 12 ±1. 33 比7. 92 ±1. 10, P 均lt;0. 01) ; BLM組α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)均較NS 對(duì)照組顯著增加( 0. 89 ±0. 12 比0. 60 ±0. 07,13. 66 ±1. 01 比8. 18 ±1. 33, P 均lt;0. 01) 。結(jié)論 在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化中肺組織的HMGB1 和α-SMA 表達(dá)增加。肺纖維化病理過(guò)程可能與HMGB1 表達(dá)增加并活化α-SMA 的表達(dá)有關(guān)
目的 探討IL-10 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞髓樣分化因子88( MyD88) / 核因子κB( NF-κB) 炎癥信號(hào)活化的影響。方法 將小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1 分為脂多糖( LPS) 組和LPS + IL-10 組, 分別于0. 5、1及2 h 收集巨噬細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液,Western blot 檢測(cè)細(xì)胞MyD88 與胞漿、胞核NF-κB p65 亞基表達(dá), ELISA 法檢測(cè)培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子α( TNF-α) 含量。結(jié)果 在0 ～2 h, LPS 組細(xì)胞MyD88表達(dá)顯著持續(xù)上升, LPS +IL-10 組于LPS刺激后上升, 0. 5 h 達(dá)峰值, 2 h 恢復(fù)至正常水平, 1 h 和2 h相對(duì)含量均低于LPS 組( 11. 6 ±1. 3 比17. 5 ±0. 7, 8. 8 ±0. 3 比21. 4 ±1. 8, P lt; 0. 05) ; 總NF-κB 表達(dá)量在兩組間無(wú)明顯差異。NF-κB 核漿比變化趨勢(shì)與MyD88 類似, LPS + IL-10 組1 h 及2 h 相對(duì)含量亦均低于LPS 組( 1. 1 ±0. 1 比2. 4 ±0. 4,0. 6 ±0. 7 比3. 1 ±0. 6, P lt;0. 05) ; 相應(yīng)的, LPS+ IL-10 組1 h和2 h TNF-α含量亦低于LPS 組[ ( 222. 5 ±33. 5) pg/mL 比( 365. 2 ±22. 7 ) pg/mL, ( 212. 7 ±15. 9) pg/mL比( 566. 2 ±31. 5) pg/mL, P lt;0. 05] 。結(jié)論 IL-10 通過(guò)抑制減少M(fèi)yD88/NF-κB 信號(hào)通路活化, 降低TNF-α表達(dá), 從而下調(diào)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。
目的 比較乳酸乳球菌及植物乳桿菌對(duì)塵螨致變應(yīng)性氣道炎癥小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,對(duì)其脾細(xì)胞MAPK 通路的影響及可能機(jī)制。方法 將實(shí)驗(yàn)小鼠分對(duì)照組( N組) 、塵螨組( 單純塵螨致敏激發(fā), M組) 、塵螨+ 乳酸乳球菌組及塵螨+ 植物乳桿菌組[ 塵螨致敏激發(fā)同時(shí)分別用乳酸乳球菌灌胃( L組) , 植物乳桿菌灌胃( P 組) ] , 末次激發(fā)后3 d 行肺組織病理學(xué)檢查, ELISA 法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10 水平, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3 + CD4 + 脾細(xì)胞分泌IL-4 / IFNγ水平,Western blot 法檢測(cè)脾細(xì)胞中總的及磷酸化P38、ERK 和JNK 蛋白水平。結(jié)果 口服乳酸菌明顯減輕塵螨致敏激發(fā)導(dǎo)致的嗜酸細(xì)胞性氣道炎癥, 以喂服乳酸乳球菌更顯著。L 組及M組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10 的生成顯著增加( P lt;0. 05) , 并以L組更明顯, 且其IL-10 的釋放率亦明顯高于其余三組( P lt;0. 05) ; 流式細(xì)胞術(shù)顯示L組和P組分泌IL-4 的CD4 + 細(xì)胞減少的同時(shí), 總CD4 + 細(xì)胞比例反而增高, 以L 組為明顯。M組與P組磷酸化P38 表達(dá)水平較N組顯著增高, L 組與N組比較基本無(wú)變化, 各組間的磷酸化ERK 及JNK 無(wú)明顯差異。結(jié)論 口服乳酸乳球菌可改善塵螨所致小鼠嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥, 其免疫調(diào)節(jié)可能與誘導(dǎo)CD4 + 調(diào)節(jié)T細(xì)胞, 分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10, 下調(diào)P38 MAPK 通路活性, 從而下調(diào)Th2炎癥相關(guān)。
目的 觀察活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸( NAC) 對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的影響, 探討NAC 抑制肺纖維化的可能機(jī)制。方法 將45 只SPF 級(jí)雌性昆明小鼠隨機(jī)分為3 組: 對(duì)照組( 氣管內(nèi)霧化生理鹽水) 、纖維化組( 氣管內(nèi)博萊霉素3 mg/kg 溶于100 μL 生理鹽水內(nèi)霧化) 、NAC處理組( 氣管內(nèi)霧化博萊霉素后, NAC 400 mg·kg- 1·d- 1溶于100 μL 生理鹽水內(nèi)灌胃) 。處理后第28 d 收集樣本。小鼠左肺置于10% 中性甲醛固定, 石蠟包埋切片后行HE 與Masson 染色; 右肺堿水解法檢測(cè)肺組織羥脯氨酸的含量; 比色法檢測(cè)血清丙二醛( MDA) 的濃度和總抗氧化能力( T-AOC) ;提取肺組織總蛋白和總RNA, 分別采用Western blot 和RT-PCR 法檢測(cè)NADPH 氧化酶1( NOX1) 、NOX2 及NOX4 的基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 NAC 處理組小鼠肺組織病理?yè)p傷較纖維化組減輕,氣道上皮下膠原沉積及肺組織羥脯氨酸含量明顯減少( P lt;0. 05) , 血清MDA 濃度較纖維化組顯著降低( P gt;0. 05) , 血清T-AOC 較纖維化組升高( P =0. 029) 。纖維化組NOX1/2/4 基因及蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)( P lt;0. 05) , NAC 干預(yù)后NOX1/2 /4 基因及蛋白表達(dá)水平均有所下調(diào), NOX4 蛋白表達(dá)明顯低于纖維化組( P =0. 001) 。與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P gt;0. 05) 。結(jié)論 NAC 能顯著改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化, 其機(jī)制與抑制NOX4 蛋白表達(dá)、下調(diào)氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。
目的 探討急性肺損傷炎癥狀態(tài)下谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M5(GSTM5)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE炎癥水平的影響及其可能的分子機(jī)制。 方法 腫瘤壞死因子α(TNF-α；10 ng/mL)誘導(dǎo)16HBE，建立急性肺損傷細(xì)胞炎癥模型，分組處理如下：空白對(duì)照組、TNF-α組(TNF-α)、GSTM5組(GSTM5+TNF-α)、陰性對(duì)照組(陰性對(duì)照質(zhì)粒+TNF-α)。GSTM5組及陰性對(duì)照組分別采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染導(dǎo)入GSTM5-GFP質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10的含量，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)NF-κB mRNA表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NF-κB、P-NF-κB、p38、P-p38蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 熒光顯微鏡檢查證實(shí)成功構(gòu)建GSTM5-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染成功。TNF-α誘導(dǎo)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、IL-10濃度較空白對(duì)照組升高(P＜0.05)，GSTM5組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10均較TNF-α組降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，TNF-α刺激后各組細(xì)胞總NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平、NF-κB、p38磷酸化水平均較空白對(duì)照組增高(P＜0.05)，而GSTM5組較TNF-α組與陰性對(duì)照組降低(P＜0.05)。 結(jié)論 過(guò)表達(dá)GSTM5可下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE炎癥水平，其機(jī)制與GSTM5抑制p38MAPK、NF-κB磷酸化密切相關(guān)。
目的 研究轉(zhuǎn)染叉頭蛋白O1(FOXO1)后A549細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變,為深入探討FOXO1在急性肺損傷中的作用機(jī)制提供線索。 方法 應(yīng)用腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激A549細(xì)胞,應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將真核表達(dá)載體GV230-FOXO1轉(zhuǎn)染入經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞,再提取細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行分析。 結(jié)果 成功構(gòu)建并驗(yàn)證了FOXO1真核表達(dá)載體,提取了高質(zhì)量的mRNA進(jìn)行芯片分析,并通過(guò)RNA質(zhì)量控制(RNA QC)驗(yàn)證。芯片分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因中上調(diào)的基因有317個(gè),下調(diào)的基因有237個(gè)。這些差異表達(dá)的基因功能涉及細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多個(gè)方面。 結(jié)論 應(yīng)用基因芯片技術(shù)可成功篩選轉(zhuǎn)染FOXO1基因后A549細(xì)胞的差異表達(dá)基因。FOXO1在急性肺損傷中可能通過(guò)改變細(xì)胞的增殖、凋亡與分化等水平來(lái)影響疾病的進(jìn)程。
目的以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）吉非替尼對(duì)博來(lái)霉素所致小鼠肺纖維化進(jìn)行干預(yù)，探討轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒 O3a（Foxo3a）的相關(guān)下游信號(hào)通路，闡明 Foxo3a 在肺纖維化中可能的作用機(jī)制。方法將 30 只 6 周齡 SPF 級(jí) C57BL/6 小鼠（雌雄各半）隨機(jī)平均分為 3 組：對(duì)照組（氣管內(nèi)滴入 0.9% 的氯化鈉注射液）、博來(lái)霉素組（氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素 3 mg/kg）和吉非替尼組（氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素 3 mg/kg 后以吉非替尼 20 mg·kg–1·d–1灌胃）。14 d 后收集小鼠肺組織，左肺行 HE 及 Masson 染色，取右肺以逆轉(zhuǎn)錄–聚合酶鏈反應(yīng)法與免疫印跡法分別檢測(cè) α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、上皮鈣黏素（E-cadherin）、高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）、Foxo3a、叉頭盒 M1（FoxM1）、Snail1 mRNA 與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果吉非替尼處理后，肺組織病理?yè)p傷及纖維化程度評(píng)分較博來(lái)霉素組明顯降低（均 P<0.01），與博來(lái)霉素組比較，α-SMA、Snail1（均 P<0.01）、HMGB1（P<0.05）mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，E-cadherin（P<0.01）、Foxo3a、FoxM1（均 P>0.05）mRNA 表達(dá)水平上調(diào)；α-SMA（P<0.05）、Snail1（P<0.01）、HMGB1 蛋白水平（P<0.05）以及 Foxo3a 蛋白磷酸化水平（P<0.01）表達(dá)下調(diào)，E-cadherin（P<0.05）、Foxo3a 及 FoxM1 蛋白表達(dá)上調(diào)（均 P>0.05）。結(jié)論Foxo3a 活性增加可下調(diào) Snail1，使 α-SMA 表達(dá)降低、E-cadherin 表達(dá)升高，從而減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。
目的 比較兩種表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑( EGFR-TKI) 吉非替尼與厄羅替尼對(duì)博萊霉素致小鼠肺纖維化的干預(yù)作用。方法 40 只雌性BALB/ c 小鼠分為對(duì)照組( NS 組) 、博萊霉素纖維化組( BLM組) 、吉非替尼組( GE 組) 和厄羅替尼組( ER 組) 。實(shí)驗(yàn)第1 d, BLM組、GE 組和ER 組小鼠經(jīng)氣管滴入博萊霉素致肺纖維化, NS 組氣管內(nèi)滴入生理鹽水; 同時(shí), GE 組及ER 組分別口服吉非替尼( 20 mg·kg- 1·d - 1 ) 和厄羅替尼( 25 mg·kg- 1· d- 1 ) , 余兩組口服生理鹽水。持續(xù)給藥2 周后殺鼠取肺, 左肺石蠟包埋切片行HE 染色與Masson 染色, 免疫組化檢測(cè)總EGFR 及磷酸化EGFR; 右肺勻漿檢測(cè)羥脯氨酸含量。結(jié)果 吉非替尼與厄羅替尼均能明顯減輕博萊霉素引起的肺結(jié)構(gòu)破壞、膠原沉積, 降低磷酸化EGFR 表達(dá)及纖維化小鼠肺羥脯氨酸含量( P lt;0. 05) , 兩者的上述作用無(wú)明顯差異( P gt;0. 05) 。結(jié)論 EGFR-TKI 通過(guò)抑制EGFR 磷酸化, 有效減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化形成, 為肺纖維化的靶向治療提供了新思路。
目的 建立急性肺損傷肺泡上皮細(xì)胞炎癥模型, 探討NF-κB p65 基因在炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中的作用。方法 以腫瘤壞死因子α( TNF-α, 10 ng/mL) 刺激A549 細(xì)胞, 運(yùn)用RNA 干擾技術(shù)沉默核因子κB( NF-κB) p65 基因, 采用RT-PCR 及Western blot 法檢測(cè)沉默效率, ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素1β( IL-1β) 、IL-4、IL-6 等炎癥因子濃度, 比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛( MDA) 及超氧化物歧化酶( SOD) 濃度, MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果 TNF-α刺激A549 細(xì)胞可在基因及蛋白水平上調(diào)NF-κB p65 的表達(dá), 并增加NF-κB 蛋白的核轉(zhuǎn)位; 同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-4、IL-6 的濃度升高, 細(xì)胞內(nèi)MDA 增多, SOD 減少, 細(xì)胞存活率降低。預(yù)轉(zhuǎn)染NF-κB p65 siRNA 可在基因水平及蛋白水平有效沉默NF-κB p65 表達(dá), 降低TNF-α誘導(dǎo)的上述各炎癥因子及MDA 濃度的增高, 減少SOD 的耗損, A549 細(xì)胞存活率升高( Plt;0.05) 。結(jié)論 NF-κB 能介導(dǎo)TNF-α觸發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激, 導(dǎo)致細(xì)胞存活率明顯降低; 沉默NF-κB p65 基因可有效下調(diào)炎癥反應(yīng)水平及其誘發(fā)的氧化應(yīng)激, 減輕肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的損傷。
目的 比較脂多糖( LPS) 經(jīng)三種不同給藥方式復(fù)制急性肺損傷( ALI) 小鼠模型的病理?yè)p傷特征及炎癥反應(yīng)程度, 優(yōu)化ALI 小鼠造模方法。方法 BLAB/ c 小鼠麻醉后分別采用氣管內(nèi)霧化( ITA 組) 、氣管內(nèi)滴入( ITI 組) 和腹腔注射( IPI 組) LPS( 5 mg/kg) 的方法復(fù)制ALI 小鼠模型, 同時(shí)用伊文斯藍(lán)取代LPS 顯示氣管內(nèi)霧化和滴入時(shí)藥物的肺內(nèi)分布。LPS 給藥2 h 后處死小鼠, 分別取肺組織行干濕重比、HE 染色及病理評(píng)分,Western blot 檢測(cè)肺組織IκB-α含量及IκB-α、NF-κB p65 磷酸化水平, qRT-PCR 檢測(cè)肺組織TNF-α和IL-1βmRNA 轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。結(jié)果 ITA 組伊文斯藍(lán)在小鼠各肺葉中分布較ITI 組更均勻。LPS 給藥2 h 后ITA 組、ITI 組和IPI 組小鼠肺組織干濕重比和病理?yè)p傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組( NC 組, P lt; 0. 01) , 其中ITA 組病理?yè)p傷評(píng)分最重( P lt;0. 05) 。Western blot 結(jié)果顯示ITA 組小鼠肺組織IκB-α降解程度、IκB-α和NF-κB p65 磷酸化水平均顯著高于ITI 組 ( P lt;0. 05) , 而ITI 組又顯著高于IPI 組( P lt;0. 05) 。qRT-PCR 結(jié)果顯示ITA 組小鼠肺組織TNF-α和 IL-1βmRNA 轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度均顯著高于ITI 組( P lt; 0. 05) , 而ITI 組又顯著高于IPI 組( P lt; 0. 05) 。結(jié)論 氣管內(nèi)霧化LPS 造成的肺組織病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)更加廣泛和嚴(yán)重, 且具有手術(shù)創(chuàng)傷小、操作方便等特點(diǎn), 是復(fù)制急性肺損傷小鼠模型的優(yōu)選方案