引用本文： 黄云, 袁伟锋, 李理, 黄文杰. 谷胱甘肽硫转移酶M5通过p38MAPK/NF-κB途径下调肿瘤坏死因子α介导的人支气管上皮细胞炎症水平. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(2): 171-175. doi: 10.7507/1671-6205.2016040 复制
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是机体遭受严重感染、休克、创伤等各种因素引起的肺组织结构损伤而出现的临床综合征，其本质是一种肺内过度性失控性的炎症反应，在分子水平表现为多种炎性因子和炎症介质的过度释放，促炎抗炎反应失 衡[1]。谷胱甘肽硫转移酶M5(glutathione S-transferase M5，GSTM5)属于GST家族，具有催化氧化还原反应的活性，有研究证实GST能影响JNK、p38、Ask1等激酶活化，参与细胞炎症反应、凋亡等生理过程的调节[2]。既往关于GSTM5的研究多集中于基因多态性与疾病相关性方面，而对于具体的机制研究较少。本研究通过肺瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，拟探讨GSTM5在ALI炎症反应中的作用及其机制。
材料与方法
一 、材料
1. 细胞：人支气管上皮细胞(16HBE)由广州军区广州总医院医学实验科细胞库提供。
2. 主要试剂及仪器：DMEM高糖培养基和胎牛血清购于Gibco公司；TNF-α购于PROSPEC；GSTM5-GFP质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成；质粒小提试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；Lipofectamine2000、Trizol、核因子κB(NF-κB)和β肌动蛋白(β-actin)引物购于Invitrogen公司；IL-6、IL-8、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于北京四正柏公司；兔抗人β-actin、 NF-κB、磷酸化的NF-κB(P-NF-κB)、p38、磷酸化的p38(P-p38)一抗和山羊抗兔二抗购于Cell Signaling Technology公司；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)酶购于TaKaRa公司；蛋白质免疫印迹法(Western blot)所需蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、制胶、电泳等试剂均购于碧云天生物技术研究所。PCR仪、凝胶成像系统及蛋白转膜仪购于Bio-RAD公司；Nanodrop 2000微量DNA/RNA定量仪购于Thermo Fisher公司；化学发光成像仪购于北京赛智创业科技有限公司。
二 方法
1. 细胞培养：16HBE接种于25 mm2塑料培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基于5% CO2、37℃的培养箱培养。当细胞生长接近铺满瓶底80%时，胰酶消化细胞传代或接种于6孔板中，密度约2×105个/mL。
2. 实验分组及细胞干预：实验分为4组：空白对照组、TNF-α组、GSTM5组和阴性对照组。其中，空白对照组不加干预因素，TNF-α组仅用TNF-α刺激，GSTM5组预转染GSTM5且用TNF-α刺激，阴性对照组预转染阴性对照质粒且用TNF-α刺激。
将细胞以2×105个/mL接种于6孔板，待细胞生长至铺满板底50%时开始干预：GSTM5组及阴性对照组分别转染GSTM5-GFP质粒、阴性对照质粒，对照组及TNF-α组不予处理。6 h后TNF-α组、GSTM5组和阴性对照组给予TNF-α(10 ng/mL)2%培养基继续培养，空白对照组给予等量2%培养基。刺激24 h后收集细胞上清液、细胞沉淀备检[3]。通过荧光显微镜观察是否有绿色荧光判断是否转染成功，以及荧光数与细胞总数的比值判断转染效率(转染效率=相同视野荧光细胞数/光镜细胞总数)。
3. ELISA检测细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10表达水平：分别收集各组细胞上清液，1 000 r/min离心10 min，取上清液。按照ELISA说明书步骤检测各组细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10浓度，重复检测4次，取平均值。
4. RT-PCR检测NF-κB mRNA表达：细胞沉淀按照Trizol说明书提取总RNA，微量DNA/RNA定量仪测定RNA浓度及纯度，根据RT-PCR反应体系取1 μg总RNA逆转录得到cDNA，再取1 μg逆转录产物进行PCR扩增反应，引物序列为：NF-κB上游5′-ACAACCCCTTCCAAGTTCCT-3′，下游5′-TGGT CCCGTGAAATACACCT-3′；β-actin上游5′-AGGGAA ATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下游5′-ACTCATCGT ACTCCTGCTTGCTGA-3′；PCR反应条件为94 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、35个循环、72 ℃ 10 min、4 ℃保存。最后取5 μL PCR产物、1 μL 6×loading buffer在1%琼脂糖凝胶电泳20 min，凝胶成像系统观察各组DNA表达水平。采用Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，计算NF-κB与β-actin的比值以表示NF-κB基因mRNA的相对表达量，重复检测4次，取平均值。
5. Western blot检测细胞总蛋白中NF-κB、P-NF-κB、 p38、P-p38表达水平：细胞沉淀用预冷PBS清洗2次后加入含1%PMSF的蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白(50 μg)经95 ℃ 5 min变性后进行SDS-PAGE电泳，蛋白经半干法电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜10 min并洗3次，一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育1 h，洗膜3次，加入显影液后在化学发光成像仪上显影。采用Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，各组β-actin条带灰度值一致时，计算P-NF-κB与NF-κB、P-p38与p38的比值以表示NF-κB、p38蛋白的相对表达量[4]，重复检测4次，取平均值。
三 统计学处理
应用SPSS 22.0数据分析软件进行统计学分析，数据采用
结 果
一 GSTM5组、阴性对照组转染效率
GSTM5组、阴性对照组培养细胞均可见荧光，GSTM5组转染效率0.422±0.016、阴性对照组转染效率0.460±0.045(P＞0.05)，差异无统计学意义。结果见图 1。
图1
相同视野下GSTM5组、阴性对照组培养细胞光镜及荧光检测像(×100) a.GSTM5组光镜；b.GSTM5组荧光；c.阴性对照组光镜；d：阴性对照组荧光
二 细胞培养上清液中IL-6、IL-8、IL-10浓度
TNF-α组与阴性对照组16HBE细胞培养上清液中IL-6、IL-8、IL-10水平较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组表达下调(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 2。
图2
各组细胞培养上清液中IL-6、IL-8、IL-10的含量(n=4，A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组。与TNF-α组、阴性对照组比较，#
三、NF-κB mRNA的表达
TNF-α组与阴性对照组NF-κB mRNA表达较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组表达降低(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 3及表 1。
图3
各组细胞NF-κB mRNA的表达
A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组
表1
各组细胞NF-κB mRNA、P-NF-κB/NF-κB、P-p38/p38蛋白相对含量(n=4，四 P-NF-κB、NF-κB蛋白的表达
TNF-α组与阴性对照组P-NF-κB/NF-κB比值较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组降低(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 4及表 1。
图4
各组细胞NF-κB、P-NF-κB蛋白的表达
A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组
五 P-p38、p38蛋白的表达
TNF-α组与阴性对照组P-p38/p38比值较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组下降(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 5及表 1。
图5
各组细胞p38、P-p38蛋白的表达
A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组
讨 论
ALL因其高发病率、高病死率一直以来都是人们研究的热点。近年来，越来越多的研究证实促炎因子与抗炎因子之间的动态平衡是影响ALI预后的重要因素，一旦平衡被打破，可发生炎症因子失控性释放，导致肺组织及全身损伤[5]。深入研究ALL与炎症因子之间的关系，进一步了解其发病机制，可以为临床治疗ALL提供更多的依据。GSTM5属于GST家族蛋白，既往关于GSTM5的研究主要集中于抗氧化及基因多态性方面[6-7]，而作为转录因子发挥非酶性调控作用方面未见报道。
引起ALI的炎症介质主要包括促炎因子IL-1β、IL-6、 IL-8、 IL-12 、TNF-α和γ干扰素(γ-IFN)，以及抗炎因子IL-4、 IL-10、 IL-13、转化生长因子-β和粒细胞噬细胞集落刺激因子，这些炎症介质构成了ALI炎症反应和免疫调节的基础，ALI时炎症反应失控，表现为促炎抗炎因子均过度释放[8]。本研究通过构建GSTM5真核表达载体并转染16HBE细胞，TNF-α刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，选取促炎抗炎因子的典型代表IL-6、IL-8、IL-10作为判断细胞炎症水平的标准，以及炎症信号通路中的关键转录因子NF-κB、p38MAPK作为观察靶点，从而探讨GSTM5对TNF-α诱导ALI炎症水平影响及其作用机制。结果显示过表达GSTM5时细胞中炎症因子IL-6、IL-8、IL-10均较TNF-α组、阴性对照组降低(P＜0.05)，提示GSTM5具有降低TNF-α诱导的16HBE炎症水平作用。
NF-κB是经典的炎症相关转录因子，在多种炎症疾病过程中可发现其过度激活，向核内易位继而诱导相应炎症因子的转录与表达。NF-κB作为炎症反应的一个核心，在ALI的发生与发展中扮演着重要角色[9-10]。许多研究表明NF-κB在ALI中处于过度激活状态，促进下游炎症因子的表达，从而参与ALI病程的进展[11-12]。为此，我们设计实验构建GSTM5真核表达载体并转染16HBE细胞，TNF-α刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，RT-PCR检测细胞内NF-κB mRNA表达水平，Western blot检测细胞内NF-κB、P-NF-κB蛋白表达水平。结果显示过表达GSTM5时细胞中NF-κB mRNA、P-NF-κB/NF-κB均较TNF-α组、阴性对照组下降(P＜0.05)，说明GSTM5可抑制TNF-α诱导的16HBE炎症反应时细胞内NF-κB磷酸化水平，从而降低细胞最终炎症水平。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是一组细胞内广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是信号从细胞表面传递到细胞核内的重要传递者。其中p38是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，p38信号通路与炎症关系密切，它通过非磷酸化转化为磷酸化状态促进下游底物的磷酸化，从而活化下游炎症相关转录因子，最终导致炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10)释放增加[13]。为此，我们拟进一步探讨GSTM5下调细胞炎症水平是否与p38通路有关，同样构建GSTM5真核表达载体并转染16HBE细胞，TNF-α刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，Western blot检测细胞内p38、P-p38蛋白表达水平。结果显示过表达GSTM5时细胞中p38蛋白表达各组没有明显差异，但P-p38表达水平GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组明显下调(P＜0.05)，说明GSTM5可抑制TNF-α诱导的16HBE炎症反应时细胞内p38的磷酸化。GSTM5下调细胞炎症水平的同时，也下调细胞内NF-κB、p38的磷酸化水平，而NF-κB、p38又是炎症反应的中心环节，说明GSTM5作用于NF-κB、p38而间接下调细胞炎症水平，但具体作用机制及NF-κB与p38上下游关系还需进一步研究证实。
综上，过度炎症反应是急性肺损伤的主要病理生理机制，控制急性肺损伤时细胞炎症水平是治疗ALI的关键。本研究发现GSTM5可降低TNF-α介导的16HBE炎症因子水平，其机制与抑制p38、NF-κB磷酸化密切相关。因此，下调GSTM5表达，可抑制细胞因子的产生和释放，有效阻止炎症介质的扩增，减轻急性炎症反应，对ALI的治疗有积极作用。本研究主要探讨GSTM5作为转录因子在炎症反应中的非酶学调控作用，这可能为GSTM5及GST家族在炎症信号通路中的研究提供新方向，但具体调控机制及结合位点还需进一步深入研究。
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是机体遭受严重感染、休克、创伤等各种因素引起的肺组织结构损伤而出现的临床综合征，其本质是一种肺内过度性失控性的炎症反应，在分子水平表现为多种炎性因子和炎症介质的过度释放，促炎抗炎反应失 衡[1]。谷胱甘肽硫转移酶M5(glutathione S-transferase M5，GSTM5)属于GST家族，具有催化氧化还原反应的活性，有研究证实GST能影响JNK、p38、Ask1等激酶活化，参与细胞炎症反应、凋亡等生理过程的调节[2]。既往关于GSTM5的研究多集中于基因多态性与疾病相关性方面，而对于具体的机制研究较少。本研究通过肺瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，拟探讨GSTM5在ALI炎症反应中的作用及其机制。
材料与方法
一 、材料
1. 细胞：人支气管上皮细胞(16HBE)由广州军区广州总医院医学实验科细胞库提供。
2. 主要试剂及仪器：DMEM高糖培养基和胎牛血清购于Gibco公司；TNF-α购于PROSPEC；GSTM5-GFP质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成；质粒小提试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；Lipofectamine2000、Trizol、核因子κB(NF-κB)和β肌动蛋白(β-actin)引物购于Invitrogen公司；IL-6、IL-8、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于北京四正柏公司；兔抗人β-actin、 NF-κB、磷酸化的NF-κB(P-NF-κB)、p38、磷酸化的p38(P-p38)一抗和山羊抗兔二抗购于Cell Signaling Technology公司；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)酶购于TaKaRa公司；蛋白质免疫印迹法(Western blot)所需蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、制胶、电泳等试剂均购于碧云天生物技术研究所。PCR仪、凝胶成像系统及蛋白转膜仪购于Bio-RAD公司；Nanodrop 2000微量DNA/RNA定量仪购于Thermo Fisher公司；化学发光成像仪购于北京赛智创业科技有限公司。
二 方法
1. 细胞培养：16HBE接种于25 mm2塑料培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基于5% CO2、37℃的培养箱培养。当细胞生长接近铺满瓶底80%时，胰酶消化细胞传代或接种于6孔板中，密度约2×105个/mL。
2. 实验分组及细胞干预：实验分为4组：空白对照组、TNF-α组、GSTM5组和阴性对照组。其中，空白对照组不加干预因素，TNF-α组仅用TNF-α刺激，GSTM5组预转染GSTM5且用TNF-α刺激，阴性对照组预转染阴性对照质粒且用TNF-α刺激。
将细胞以2×105个/mL接种于6孔板，待细胞生长至铺满板底50%时开始干预：GSTM5组及阴性对照组分别转染GSTM5-GFP质粒、阴性对照质粒，对照组及TNF-α组不予处理。6 h后TNF-α组、GSTM5组和阴性对照组给予TNF-α(10 ng/mL)2%培养基继续培养，空白对照组给予等量2%培养基。刺激24 h后收集细胞上清液、细胞沉淀备检[3]。通过荧光显微镜观察是否有绿色荧光判断是否转染成功，以及荧光数与细胞总数的比值判断转染效率(转染效率=相同视野荧光细胞数/光镜细胞总数)。
3. ELISA检测细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10表达水平：分别收集各组细胞上清液，1 000 r/min离心10 min，取上清液。按照ELISA说明书步骤检测各组细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-10浓度，重复检测4次，取平均值。
4. RT-PCR检测NF-κB mRNA表达：细胞沉淀按照Trizol说明书提取总RNA，微量DNA/RNA定量仪测定RNA浓度及纯度，根据RT-PCR反应体系取1 μg总RNA逆转录得到cDNA，再取1 μg逆转录产物进行PCR扩增反应，引物序列为：NF-κB上游5′-ACAACCCCTTCCAAGTTCCT-3′，下游5′-TGGT CCCGTGAAATACACCT-3′；β-actin上游5′-AGGGAA ATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下游5′-ACTCATCGT ACTCCTGCTTGCTGA-3′；PCR反应条件为94 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、35个循环、72 ℃ 10 min、4 ℃保存。最后取5 μL PCR产物、1 μL 6×loading buffer在1%琼脂糖凝胶电泳20 min，凝胶成像系统观察各组DNA表达水平。采用Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，计算NF-κB与β-actin的比值以表示NF-κB基因mRNA的相对表达量，重复检测4次，取平均值。
5. Western blot检测细胞总蛋白中NF-κB、P-NF-κB、 p38、P-p38表达水平：细胞沉淀用预冷PBS清洗2次后加入含1%PMSF的蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白(50 μg)经95 ℃ 5 min变性后进行SDS-PAGE电泳，蛋白经半干法电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜10 min并洗3次，一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育1 h，洗膜3次，加入显影液后在化学发光成像仪上显影。采用Quantity One 软件分析电泳条带灰度值，各组β-actin条带灰度值一致时，计算P-NF-κB与NF-κB、P-p38与p38的比值以表示NF-κB、p38蛋白的相对表达量[4]，重复检测4次，取平均值。
三 统计学处理
应用SPSS 22.0数据分析软件进行统计学分析，数据采用
结 果
一 GSTM5组、阴性对照组转染效率
GSTM5组、阴性对照组培养细胞均可见荧光，GSTM5组转染效率0.422±0.016、阴性对照组转染效率0.460±0.045(P＞0.05)，差异无统计学意义。结果见图 1。
图1
相同视野下GSTM5组、阴性对照组培养细胞光镜及荧光检测像(×100) a.GSTM5组光镜；b.GSTM5组荧光；c.阴性对照组光镜；d：阴性对照组荧光
二 细胞培养上清液中IL-6、IL-8、IL-10浓度
TNF-α组与阴性对照组16HBE细胞培养上清液中IL-6、IL-8、IL-10水平较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组表达下调(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 2。
图2
各组细胞培养上清液中IL-6、IL-8、IL-10的含量(n=4，A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组。与TNF-α组、阴性对照组比较，#
三、NF-κB mRNA的表达
TNF-α组与阴性对照组NF-κB mRNA表达较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组表达降低(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 3及表 1。
图3
各组细胞NF-κB mRNA的表达
A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组
表1
各组细胞NF-κB mRNA、P-NF-κB/NF-κB、P-p38/p38蛋白相对含量(n=4，四 P-NF-κB、NF-κB蛋白的表达
TNF-α组与阴性对照组P-NF-κB/NF-κB比值较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组降低(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 4及表 1。
图4
各组细胞NF-κB、P-NF-κB蛋白的表达
A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组
五 P-p38、p38蛋白的表达
TNF-α组与阴性对照组P-p38/p38比值较空白对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。而GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组下降(P＜0.05)，差异有统计学意义。结果见图 5及表 1。
图5
各组细胞p38、P-p38蛋白的表达
A：空白对照组；B：TNF-α组；C：GSTM5组；D：阴性对照组
讨 论
ALL因其高发病率、高病死率一直以来都是人们研究的热点。近年来，越来越多的研究证实促炎因子与抗炎因子之间的动态平衡是影响ALI预后的重要因素，一旦平衡被打破，可发生炎症因子失控性释放，导致肺组织及全身损伤[5]。深入研究ALL与炎症因子之间的关系，进一步了解其发病机制，可以为临床治疗ALL提供更多的依据。GSTM5属于GST家族蛋白，既往关于GSTM5的研究主要集中于抗氧化及基因多态性方面[6-7]，而作为转录因子发挥非酶性调控作用方面未见报道。
引起ALI的炎症介质主要包括促炎因子IL-1β、IL-6、 IL-8、 IL-12 、TNF-α和γ干扰素(γ-IFN)，以及抗炎因子IL-4、 IL-10、 IL-13、转化生长因子-β和粒细胞噬细胞集落刺激因子，这些炎症介质构成了ALI炎症反应和免疫调节的基础，ALI时炎症反应失控，表现为促炎抗炎因子均过度释放[8]。本研究通过构建GSTM5真核表达载体并转染16HBE细胞，TNF-α刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，选取促炎抗炎因子的典型代表IL-6、IL-8、IL-10作为判断细胞炎症水平的标准，以及炎症信号通路中的关键转录因子NF-κB、p38MAPK作为观察靶点，从而探讨GSTM5对TNF-α诱导ALI炎症水平影响及其作用机制。结果显示过表达GSTM5时细胞中炎症因子IL-6、IL-8、IL-10均较TNF-α组、阴性对照组降低(P＜0.05)，提示GSTM5具有降低TNF-α诱导的16HBE炎症水平作用。
NF-κB是经典的炎症相关转录因子，在多种炎症疾病过程中可发现其过度激活，向核内易位继而诱导相应炎症因子的转录与表达。NF-κB作为炎症反应的一个核心，在ALI的发生与发展中扮演着重要角色[9-10]。许多研究表明NF-κB在ALI中处于过度激活状态，促进下游炎症因子的表达，从而参与ALI病程的进展[11-12]。为此，我们设计实验构建GSTM5真核表达载体并转染16HBE细胞，TNF-α刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，RT-PCR检测细胞内NF-κB mRNA表达水平，Western blot检测细胞内NF-κB、P-NF-κB蛋白表达水平。结果显示过表达GSTM5时细胞中NF-κB mRNA、P-NF-κB/NF-κB均较TNF-α组、阴性对照组下降(P＜0.05)，说明GSTM5可抑制TNF-α诱导的16HBE炎症反应时细胞内NF-κB磷酸化水平，从而降低细胞最终炎症水平。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是一组细胞内广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是信号从细胞表面传递到细胞核内的重要传递者。其中p38是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，p38信号通路与炎症关系密切，它通过非磷酸化转化为磷酸化状态促进下游底物的磷酸化，从而活化下游炎症相关转录因子，最终导致炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10)释放增加[13]。为此，我们拟进一步探讨GSTM5下调细胞炎症水平是否与p38通路有关，同样构建GSTM5真核表达载体并转染16HBE细胞，TNF-α刺激16HBE建立细胞急性肺损伤模型，Western blot检测细胞内p38、P-p38蛋白表达水平。结果显示过表达GSTM5时细胞中p38蛋白表达各组没有明显差异，但P-p38表达水平GSTM5组较TNF-α组、阴性对照组明显下调(P＜0.05)，说明GSTM5可抑制TNF-α诱导的16HBE炎症反应时细胞内p38的磷酸化。GSTM5下调细胞炎症水平的同时，也下调细胞内NF-κB、p38的磷酸化水平，而NF-κB、p38又是炎症反应的中心环节，说明GSTM5作用于NF-κB、p38而间接下调细胞炎症水平，但具体作用机制及NF-κB与p38上下游关系还需进一步研究证实。
综上，过度炎症反应是急性肺损伤的主要病理生理机制，控制急性肺损伤时细胞炎症水平是治疗ALI的关键。本研究发现GSTM5可降低TNF-α介导的16HBE炎症因子水平，其机制与抑制p38、NF-κB磷酸化密切相关。因此，下调GSTM5表达，可抑制细胞因子的产生和释放，有效阻止炎症介质的扩增，减轻急性炎症反应，对ALI的治疗有积极作用。本研究主要探讨GSTM5作为转录因子在炎症反应中的非酶学调控作用，这可能为GSTM5及GST家族在炎症信号通路中的研究提供新方向，但具体调控机制及结合位点还需进一步深入研究。
