目的探討富白細(xì)胞和血小板血漿(leucocyte- and platelet-rich plasma,L-PRP)在治療早期股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of femoral head,ANFH)兔模型中,對BMSCs成骨分化作用的影響。 方法取4~6月齡新西蘭大白兔24只,體重2.0~3.0 kg,雌雄不拘。隨機(jī)分成A、B、C、D 4組(n=6),建立雙側(cè)ANFH模型。取髂骨骨髓分離培養(yǎng)BMSCs并鑒定;采用Landesberg方法制備L-PRP。ANFH動(dòng)物模型修復(fù)方法:A組單純行髓芯減壓,B組行髓芯減壓聯(lián)合L-PRP移植,C組行髓芯減壓聯(lián)合BMSCs移植,D組行髓芯減壓聯(lián)合BMSCs及L-PRP移植。術(shù)后2、4、8周攝X線片,觀察髖關(guān)節(jié)和骨缺損灶骨密度變化,并行Lane-Sandhu X線評分評價(jià)成骨情況;取各組股骨頭標(biāo)本,行組織學(xué)觀察及血管計(jì)數(shù)、新生骨面積百分比檢測。 結(jié)果影像學(xué)及組織學(xué)觀察均顯示各組骨缺損呈現(xiàn)不同程度骨再生。術(shù)后2、4、8周,Lane-Sandhu X線片評分、血管計(jì)數(shù)、新生骨面積百分比均顯示:C、D組明顯優(yōu)于A、B組,D組優(yōu)于C組,B組優(yōu)于A組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論L-PRP在治療兔ANFH模型中對BMSCs成骨分化有促進(jìn)作用,為臨床髓芯減壓聯(lián)合BMSCs及L-PRP治療ANFH奠定了理論基礎(chǔ)。
目的構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體,并檢測其轉(zhuǎn)染豬BMSCs 后BMP-2表達(dá)活性及誘導(dǎo)BMSCs成骨分化情況,為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨軟骨奠定基礎(chǔ)。 方法取2只2月齡巴馬香豬(體重約15 kg)髂骨骨髓,采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs,并傳代。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體,并以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)10、25、50、100、200轉(zhuǎn)染第2代BMSCs,通過熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡觀察確定最佳MOI值。以最佳 MOI 值感染 BMSCs作為實(shí)驗(yàn)組,空載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs(空載體組)及未轉(zhuǎn)染的 BMSCs(空白組)作為對照,通過 RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測 BMP-2 mRNA及蛋白在 BMSCs 中的表達(dá),并應(yīng)用ALP染色、ALP活性檢測及茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色檢測其成骨分化情況。 結(jié)果經(jīng)RT-PCR基因測序鑒定 BMP-2基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染 BMSCs后熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá),且MOI值為 100 時(shí)為最佳表達(dá)。RT-PCR 提示 BMP-2 基因成功轉(zhuǎn)染至 BMSCs 中;免疫組織化學(xué)染色及 Western blot檢測示轉(zhuǎn)染后BMSCs并可持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) BMP-2蛋白;培養(yǎng)后2周BMSCs可見ALP表達(dá)及鈣結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論成功構(gòu)建 BMP-2基因重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染豬 BMSCs,BMP-2 基因轉(zhuǎn)染入 BMSCs 后能持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) BMP-2 基因和蛋白,并成功誘導(dǎo) BMSCs 向成骨細(xì)胞分 化。
目的探討微小RNA-451(micro RNA-451,miRNA-451)靶向調(diào)節(jié)鈣結(jié)合蛋白39(calcium binding protein 39,CAB39)表達(dá),促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化的效應(yīng)。 方法選擇pMIR-report質(zhì)粒及pRL-TK質(zhì)粒,通過雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng),鑒定CAB39是否為miRNA-451的靶基因。將pre-miRNA-451(A組)及anti-miRNA-451(C組)分別轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的pre-miRNA陰性對照組(B組)和anti-miRNA陰性對照組(D組);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成骨標(biāo)志物Runx2、ALP mRNA相對表達(dá)量;誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d,采用Western blot檢測細(xì)胞中CAB39蛋白表達(dá),茜素紅染色觀察細(xì)胞外鈣基質(zhì)沉積情況。 結(jié)果經(jīng)鑒定,CAB39是miRNA-451的靶基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測示,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d,A組Runx2、ALP mRNA相對表達(dá)量顯著高于B組,C組顯著低于D組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d,Western blot檢測示A組CAB39蛋白表達(dá)量為0.55 ± 0.05,較B組1.00 ± 0.07明顯降低;而C組為1.21 ± 0.05,較D組1.00 ± 0.04明顯增高;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。茜素紅染色示A組細(xì)胞外鈣基質(zhì)沉積較B組明顯增多,而C組細(xì)胞外鈣基質(zhì)沉積較D組明顯減少。 結(jié)論miRNA-451可通過抑制CAB39表達(dá),促進(jìn)MSCs成骨分化。
目的 地塞米松是MSCs 成骨誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)試劑,探討誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化過程中地塞米松的優(yōu)選濃度,為進(jìn)一步骨組織工程研究提供理論依據(jù)。 方法 3 月齡清潔級健康新西蘭大白兔5 只,雌雄不限,體重2 ~ 3 kg。取腹股溝區(qū)皮下脂肪4 ~ 6 mL,采用膠原酶消化離心貼壁法分離培養(yǎng)ADSCs,取第3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;聯(lián)合CD44、CD106 免疫熒光染色和成脂誘導(dǎo)分化鑒定ADSCs。調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105 個(gè)/mL,分別用普通培養(yǎng)液(A 組)及含0(B 組)、1 × 10-9(C 組)、1 × 10-8(D 組)、1 ×10-7(E 組)、1 × 10-6(F 組)、1 × 10-5 mol/L(G 組)地塞米松的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液對ADSCs 進(jìn)行培養(yǎng)。MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況;RT-PCR 檢測誘導(dǎo)細(xì)胞骨鈣素(osteocalcin,OC)和核心結(jié)合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)的表達(dá);測定ALP 活性及礦化面積百分率;對礦化結(jié)節(jié)行茜素紅染色。 結(jié)果 ADSCs 形態(tài)多為梭形、多角形,呈“漩渦狀”排列;表面抗原分子CD44 呈陽性,CD106 呈陰性,成脂誘導(dǎo)后可觀察到細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成,油紅O 染色呈陽性。MTT 檢測顯示隨地塞米松濃度升高,吸光度(A)值呈下降趨勢;其中成骨誘導(dǎo)5、7 d 時(shí),D、E 組A 值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。RT-PCR 檢測示,成骨誘導(dǎo)7 d OC 和Cbfα1 mRNA 的表達(dá)分別在E 組和D 組達(dá)高峰;成骨誘導(dǎo)14 d ALP 活性和礦化面積百分率均在D 組達(dá)高峰,隨后逐漸下降。D、E 組間OC 和Cbfα1 mRNA 的表達(dá)量、ALP 活性及礦化面積百分率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05),與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05)。成骨誘導(dǎo)14 d,G 組細(xì)胞均死亡;茜素紅染色除A、G 組外均呈陽性。 結(jié)論 成骨培養(yǎng)液中地塞米松濃度為1 × 10-8 mol/L 時(shí),能在減少對細(xì)胞增殖抑制的同時(shí),更有效地誘導(dǎo)ADSCs 成骨分化。
目的 既往研究表明辛伐他汀具有促成骨作用,現(xiàn)探討辛伐他汀對幼鼠骨小梁中骨形成相關(guān)因子表達(dá)以及BMSCs 成骨分化的影響。 方法 40 只1 周齡雄性SD 大鼠,體重17.5 ~ 19.5 g,隨機(jī)分為2 組,每組20 只。實(shí)驗(yàn)組于大鼠頸部皮下注射辛伐他汀注射液[5 mg/(kg·d)],對照組同法注射等劑量生理鹽水。于注射后1、3 周,兩組分別脫頸處死10 只大鼠,采用免疫組織化學(xué)染色檢測脛骨上端骨小梁BMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、VEGF 的表達(dá)情況。注射后1、3 周,兩組分別取大鼠雙側(cè)股骨,采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs,取第1 代BMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),培養(yǎng)后14 d 行ALP 染色,培養(yǎng)后21 d 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測BMP-2、Runx2、Osterix、Msx2、Dlx3、Dlx5 mRNA 的表達(dá),培養(yǎng)后28 d 行von Kossa 染色。 結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色示注射后1、3 周兩組脛骨上端骨小梁BMP-2、MMP-13、VEGF 表達(dá),差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d,注射后1、3 周兩組ALP染色陽性細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測示注射后1、3 周兩組BMP-2、Runx2、Osterix、Dlx3、Dlx5、Msx2 mRNA 表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d,注射后1、3 周兩組鈣結(jié)節(jié)單位面積比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 皮下注射辛伐他汀5 mg/(kg·d)后1、3 周對幼鼠骨小梁中骨形成相關(guān)因子表達(dá)以及BMSCs 成骨分化無明顯影響。
目的 磷酸鈣生物材料由于其優(yōu)良的生物相容性而具有廣闊的應(yīng)用前景,但傳統(tǒng)方法難以制備具有復(fù)雜形狀的支架。以快速成形方法制備磷酸鈣多孔陶瓷支架材料,并對其體外成骨性能進(jìn)行初步研究。 方法 采用快速成形方法制備磷酸鈣多孔陶瓷支架材料(直徑10 mm、高度5 mm、孔徑800 μm),取Beagle 犬髂骨髓分離培養(yǎng)BMSCs,接種第3 代BMSCs 于支架材料上。將實(shí)驗(yàn)分為4 組,A 組為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞/ 材料復(fù)合物組,B 組為未經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞/ 材料復(fù)合物組,另設(shè)平皿成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及常規(guī)培養(yǎng)為陽性對照組(C 組)及陰性對照組(D 組)。于接種后第1、3、7 天,利用DNA 定量檢測方法及ALP 定量、定性檢測方法檢測BMSCs 在支架材料上的增殖及ALP 的表達(dá);并經(jīng)DiO 熒光染色后,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs 在材料上的黏附生長情況。 結(jié)果 DNA定量結(jié)果表明,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,C、D 組在第3 天時(shí)細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期;A、B 組細(xì)胞呈持續(xù)增長趨勢,細(xì)胞培養(yǎng)過程中增殖速度均略低于C、D 組,且未出現(xiàn)明顯的平臺期。DiO 熒光染色示,BMSCs 在以快速成形方法制備的磷酸鈣多孔陶瓷支架材料上黏附、生長狀態(tài)良好。ALP 染色示,隨培養(yǎng)時(shí)間延長,A、B 組支架上細(xì)胞染色均逐漸加深,A 組各時(shí)間點(diǎn)染色程度均明顯強(qiáng)于B 組。培養(yǎng)后第1、3 天,4 組ALP 表達(dá)均較低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05);培養(yǎng)第7 天,各組ALP 表達(dá)均明顯升高,A 組比其他各組明顯高表達(dá)(P lt; 0.05),B 組及C 組均明顯高于D 組(P lt; 0.05)。 結(jié)論 快速成形的多孔磷酸鈣陶瓷具有良好的細(xì)胞相容性,BMSCs 與支架復(fù)合在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可以進(jìn)行成骨分化。因此通過快速成形技術(shù)制備的磷酸鈣多孔陶瓷是骨組織工程可選的細(xì)胞支架。
目的 綜述Hedgehog 信號通路對MSCs 的增殖和多向分化的調(diào)控。 方法 查閱并綜合分析近年有關(guān)Hedgehog 信號通路對MSCs 生物學(xué)特性調(diào)控的文獻(xiàn),并進(jìn)行綜述。 結(jié)果 Hedgehog 信號通路促進(jìn)MSCs 的增殖,并在其成骨、成軟骨分化中發(fā)揮重要作用,抑制其成脂分化。 結(jié)論 Hedgehog 信號通路對MSCs 增殖與多向分化調(diào)控的功能可作為組織或器官缺血、骨質(zhì)疏松、軟骨發(fā)育不全和肥胖癥等新的治療靶點(diǎn)。
目的 脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是組織工程種子細(xì)胞的重要來源之一。探討低溫保存對hADSCs 體外生長特性及成骨分化潛能的影響,驗(yàn)證凍存后的ADSCs 作為組織工程骨種子細(xì)胞的可行性。 方法 取自愿捐獻(xiàn)的經(jīng)脂肪抽吸術(shù)獲取人脂肪組織,采用膠原酶消化法分離hADSCs。取第2 代hADSCs 置于— 196℃液氮保存4 周后,37℃復(fù)蘇并測定細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組為低溫保存的hADSCs,對照組為未經(jīng)低溫保存的hADSCs;均用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用DNA 定量(Hoechst33258 熒光比色法)測定細(xì)胞體外增殖活性,ALP 染色及茜素紅染色法測定ALP 活性和Ca2+ 含量,觀察低溫凍存對細(xì)胞成骨能力的影響。 結(jié)果 低溫凍存復(fù)蘇后的hADSCs 存活率為90.44% ± 2.62%。兩組細(xì)胞數(shù)量隨成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長不斷增加,7 d 達(dá)平臺期;ALP 表達(dá)活性也不斷增加,于成骨誘導(dǎo)11 d 達(dá)平臺期,且2 周時(shí)ALP 染色均呈陽性;成骨誘導(dǎo)3 周時(shí)兩組茜素紅染色均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。兩組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量、ALP 活性和Ca2+ 含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 低溫保存的hADSCs 體外生長及成骨能力未發(fā)生顯著變化,可以作為組織工程骨的種子細(xì)胞。
目的 探討瘦素(leptin,LEP)對 hBMSCs 成骨分化的作用及機(jī)制。 方法 采用全骨髓法培養(yǎng)hBMSCs,取第3 代hBMSCs 分為A、B、C、D、E、F 組,待細(xì)胞貼壁后各組分別加入400、200、100、50 ng/mL LEP 、100 ng/ mL BMP 和普通培養(yǎng)基2 mL 進(jìn)行培養(yǎng)。于培養(yǎng)后7 d 行ALP 染色、21 d 行礦化結(jié)節(jié)染色,倒置相差顯微鏡觀察染色結(jié)果;并于培養(yǎng)后7、14、21 d,檢測各組ALP 活性、骨鈣素(osteocalcin,OCN)水平,篩選 LEP 的最佳誘導(dǎo)濃度;B、E、F 組細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后,采用 RT-PCR 檢測成骨相關(guān)基因:核心結(jié)合因子(core-binding factor α1,Cbfα1)、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA 的表達(dá)。 結(jié)果 誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d,ALP 染色結(jié)果顯示,A、B、C、D、E 組細(xì)胞胞漿均呈藍(lán)色陽性著色,F(xiàn) 組呈弱陽性;誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d,礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示,A、B、C、D、E 組細(xì)胞染色呈陽性,F(xiàn) 組呈陰性。B 組培養(yǎng)后7、14、21 d,ALP、OCN 活性低于 E 組,但顯著高于其余各組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.05),200 ng/mL LEP 為最佳濃度。B、E、F組細(xì)胞培養(yǎng)7 d,F(xiàn) 組Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA 均不表達(dá);B、E 組各產(chǎn)物mRNA 均有表達(dá),但B 組低于E 組。 結(jié)論 LEP 可促進(jìn) hBMSCs 成骨分化,其機(jī)制可能為LEP 促進(jìn)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)
目的 探討成骨細(xì)胞特異性鈣黏蛋白(cadherin ectodomain Ⅱ,Cad- Ⅱ)涂布于同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料(freeze-dried demineralized bone matrix,F(xiàn)DBM)對兔BMSCs 黏附、增殖及成骨分化能力的影響。 方法 取4 周齡日本大耳白兔10 只,體重0.61 ~ 0.88 kg,雌雄不限,常規(guī)分離培養(yǎng)BMSCs。取第2 代BMSCs(細(xì)胞密度1 × 106 個(gè) /mL)分別與經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM(實(shí)驗(yàn)組)和未經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM(對照組)復(fù)合,行MTT 檢測細(xì)胞增殖能力,細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞上架率和上架數(shù),倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及HE 染色觀察細(xì)胞生長情況。另取第2 代BMSCs(細(xì)胞密度5 × 105 個(gè)/mL)分別與經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM(實(shí)驗(yàn)組)和未經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的FDBM(對照組)復(fù)合培養(yǎng),行ALP 活性檢測和骨鈣素免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞成骨分化情況。 結(jié)果 MTT 檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs 在經(jīng)Cad- Ⅱ修飾的支架材料上能正常增殖,但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt; 0.05)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上架率為87.41% ± 5.19%,明顯高于對照組35.56% ± 1.75%(P lt; 0.01);對照組每片材料細(xì)胞上架數(shù)平均為 2.6 × 104 個(gè),實(shí)驗(yàn)組平均高達(dá)5.0 × 105 個(gè),明顯多于對照組(P lt; 0.05)。倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及HE 染色觀察均顯示實(shí)驗(yàn)組支架上黏附細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d,實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞均可表達(dá)骨鈣素,具有成骨細(xì)胞表型;培養(yǎng)14 d,實(shí)驗(yàn)組和對照組ALP 活性分別為29.33 ± 1.53 和18.31 ± 1.32,骨鈣素免疫組織化學(xué)染色陽性率分別為83% ± 7% 和56% ± 7%,兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P lt; 0.01);與同組7、21 d 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt; 0.01),7 d 與21 d 組間及組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P gt;0.05)。 結(jié)論 Cad- Ⅱ修飾的FDBM 對BMSCs 增殖無明顯促進(jìn)作用,但能提高細(xì)胞黏附性,并促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。