目的 觀察癌胚抗原（CEA）陽(yáng)性靶向性淋巴細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)及體外靶向性治療作用。 方法 從健康人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），通過(guò)脂質(zhì)體lipofectamine 2000 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染將重組真核表達(dá)載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染導(dǎo)入 PBMC，以獲取 CEA 陽(yáng)性靶向性淋巴細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱靶淋巴細(xì)胞）；將不含 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 融合基因片段的 pcDNA3.0 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入 PBMC，獲取的淋巴細(xì)胞簡(jiǎn)稱為空載體淋巴細(xì)胞。將上述兩種淋巴細(xì)胞分別與 CEA 陽(yáng)性 KATOⅢ胃癌細(xì)胞和 CEA 陰性 BGC-823 胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察不同靶淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)（24 h 或 36 h ）后的識(shí)別情況或其對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。并將上述已獲取的兩種淋巴細(xì)胞分別通過(guò)尾靜脈注入荷 CEA 陽(yáng)性 KATOⅢ胃癌細(xì)胞裸鼠和荷 CEA 陰性 BGC-823 胃癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)，以觀察其對(duì)荷胃癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況的影響。 結(jié)果 ① 靶淋巴細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng) 24 h 時(shí)，靶淋巴細(xì)胞對(duì) KATOⅢ胃癌細(xì)胞的識(shí)別率為 72.3%，淋巴細(xì)胞對(duì) KATOⅢ胃癌細(xì)胞的識(shí)別能力較強(qiáng)；其對(duì) BGC-823 胃癌細(xì)胞識(shí)別率為 7.8%，其對(duì) BGC-823 胃癌細(xì)胞識(shí)別能力較弱。② 當(dāng)靶淋巴細(xì)胞、空載體淋巴細(xì)胞分別與 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細(xì)胞分別共培養(yǎng) 36 h 時(shí)，靶淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組的凋亡率明顯高于空載體淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組（P=0.032），而靶淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組和空載體淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組的凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.118）。③ 在觀察 40 d 內(nèi)，靶淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組的腫瘤體積明顯小于空載體淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組（F=5.010，P<0.01）和空白對(duì)照組（F=7.560，P<0.01）；靶淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組與空載體淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.210，P>0.05）。靶淋巴細(xì)胞+KATOⅢ胃癌細(xì)胞組的腫瘤體積明顯小于靶淋巴細(xì)胞+BGC-823 胃癌細(xì)胞組（F=4.982，P<0.01）。 結(jié)論 CEA 陽(yáng)性靶向性淋巴細(xì)胞可特異性促進(jìn) CEA 陽(yáng)性胃癌細(xì)胞凋亡，抑制荷 CEA 陽(yáng)性胃癌細(xì)胞裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。
目的 制備腫瘤相關(guān)糖蛋白-72抗原（TAG-72）嵌合錨定T細(xì)胞，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑癌活性。方法 分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），采用脂質(zhì)體lipofectamineTM 2000介導(dǎo)的細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，將已制備的重組真核表達(dá)載體即抗TAG-72-scFv-CD3ζ-pcDNA 3.0導(dǎo)入PBMC，以獲得TAG-72嵌合錨定T細(xì)胞，以此為轉(zhuǎn)染組；用轉(zhuǎn)染空載體pcDNA 3.0的PBMC作為對(duì)照組。將轉(zhuǎn)染組嵌合錨定T細(xì)胞和對(duì)照組PBMC細(xì)胞分別與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及Bcap37共培養(yǎng)，觀察兩者對(duì)乳腺癌細(xì)胞G1期的阻滯率。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組對(duì)MCF-7細(xì)胞系的G1期阻滯率為（82.3±6.9）%，對(duì)照組為（43.4±3.9）%，2組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組對(duì)Bcap37細(xì)胞系的G1期阻滯率為（51.3±4.7）%，對(duì)照組為（45.6±2.5）%，2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 TAG-72嵌合錨定T細(xì)胞可特異性地抑制TAG-72＋乳腺癌細(xì)胞的增殖，此將為乳腺癌的臨床診治提供一種有希望的途徑。
目的探討腫瘤相關(guān)糖蛋白72(TAG72)靶向性嵌合錨定T淋巴細(xì)胞的制備方法，并檢測(cè)它對(duì)TAG72陽(yáng)性肝癌細(xì)胞增殖的阻滯效應(yīng)。方法分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，然后用免疫磁珠法分離得到CD8+ T淋巴細(xì)胞。將重組真核表達(dá)載體anti-TAG72-scFv-CD28-pcDNA3.0采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)，以制備TAG72靶向性的嵌合錨定T淋巴細(xì)胞; 將嵌合錨定T淋巴細(xì)胞與TAG72陽(yáng)性肝癌細(xì)胞SMMC7721共培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞的周期變化，分析嵌合錨定T淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。結(jié)果TAG72靶向性嵌合錨定T淋巴細(xì)胞可識(shí)別肝癌細(xì)胞SMMC7721； 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，嵌合錨定T淋巴細(xì)胞可引起肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖阻滯。結(jié)論TAG72靶向性嵌合錨定T淋巴細(xì)胞可特異性識(shí)別TAG72陽(yáng)性肝癌細(xì)胞SMMC7721并引起其增殖阻滯。
目的 構(gòu)建含有由抗腫瘤相關(guān)糖蛋白72(anti-TAG72)單鏈抗體片段(single chain variable fragment,scFv)及CD28胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)的融合基因anti-TAG72 scFv-CD28的重組綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28，并轉(zhuǎn)染獲得嵌合錨定T淋巴細(xì)胞。方法 將anti-TAG72單鏈抗體及CD28胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)基因的嵌合錨定融合分子克隆入綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C3，獲得pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28表達(dá)載體。用卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。將上述重組質(zhì)粒pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28以脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以獲得嵌合錨定T淋巴細(xì)胞，用熒光顯微鏡檢測(cè)嵌合分子anti-TAG72 scFv-CD28在PBMC中的表達(dá)，并檢驗(yàn)嵌合錨定融合分子anti-TAG72 scFv-CD28的表達(dá)。結(jié)果 重組綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28中anti-TAG72 scFv-CD28片段為1 002 bp，與已知的序列相符。酶切、測(cè)序結(jié)果表明，嵌合錨定融合分子基因片段anti-TAG72 scFv-CD28被正確插入pEGFP-C3載體； 轉(zhuǎn)染后anti-TAG72 scFv-CD28片段及綠色熒光物質(zhì)表達(dá)于嵌合錨定T淋巴細(xì)胞胞膜表面及胞漿中，為綠色熒光顯色。結(jié)論 完成了綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28的構(gòu)建，并成功在PBMC瞬時(shí)表達(dá)。
目的 探討抗腫瘤相關(guān)糖蛋白-72(TAG-72)單鏈抗體的原核表達(dá)及與4種肝癌細(xì)胞系和肝癌組織的特異性親和力。方法 將抗TAG-72單鏈抗體的cDNA片段插入噬菌粒載體pCANTAB5E, 獲得噬菌粒載體TAG-72-scFv-pCANTAB5E。將后者轉(zhuǎn)化入E.coli HB2151, 經(jīng)β, D異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)獲得抗TAG-72單鏈抗體蛋白。采用細(xì)胞培養(yǎng)及免疫細(xì)胞/組織化學(xué)方法, 檢測(cè)4種肝癌細(xì)胞系及石蠟包埋的肝癌組織中TAG-72抗原的表達(dá)。結(jié)果 SDS-PAGE及Western blot法證實(shí), 抗TAG-72單鏈抗體蛋白分子得以正確表達(dá)?？筎AG-72單鏈抗體可與肝癌細(xì)胞系SMMC7721、HepG2和HHCC結(jié)合, 表明這3種細(xì)胞表達(dá)了特異性腫瘤抗原; 抗TAG-72單鏈抗體不能結(jié)合BEL7402細(xì)胞。40例肝癌組織中TAG-72抗原表達(dá)陽(yáng)性率Ⅰ期、Ⅱ~Ⅲ期分別為23.08%(3/13)和62.96%(17/27),在正常肝組織標(biāo)本中無(wú)TAG-72抗原表達(dá),TAG-72抗原在正常肝組織及肝癌組織中表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論 TAG-72抗原在肝癌細(xì)胞或肝癌組織中有特異性表達(dá)，有可能成為判斷肝癌的標(biāo)志物。
目的探討芒果苷對(duì)大鼠急性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的保護(hù)作用并分析其相關(guān)機(jī)制。 方法成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、SCI組（B組）、10 mg/kg芒果苷處理組（C組）、25 mg/kg芒果苷處理組（D組）、50 mg/kg芒果苷處理組（E組），每組18只。B、C、D、E組采用Allen法（60 g/cm）建立大鼠T9 SCI模型，A組僅切除T8～10椎板；C、D、E組術(shù)后每天按照10、25、50 mg/kg劑量腹腔注射芒果苷，共注射30 d；A、B組于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。術(shù)后觀察大鼠存活情況，于24、48、72 h采用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能；72 h時(shí)取損傷節(jié)段脊髓測(cè)量其水含量，ELISA檢測(cè)氧化應(yīng)激反應(yīng)因子丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）以及炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性；30 d時(shí)取損傷節(jié)段脊髓采用ELISA法檢測(cè)Caspase-3、9活性，Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)，組織學(xué)觀察脊髓組織形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色觀察Caspase-3蛋白表達(dá)。 結(jié)果術(shù)后各組大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。B、C、D、E組BBB評(píng)分均顯著低于A組，B、C、D、E組評(píng)分呈逐漸增高趨勢(shì)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D、E組脊髓水含量均顯著高于A組，B、C、D、E組水含量呈逐漸降低趨勢(shì)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA檢測(cè)示，B、C、D、E組MDA、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、Caspase-3、Caspase-9活性均顯著高于A組，B、C、D、E組均呈逐漸降低趨勢(shì)；而CAT、SOD、GSH活性均顯著低于A組，B、C、D、E組均呈逐漸增加趨勢(shì)；以上指標(biāo)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot示，B、C、D、E組Bax蛋白表達(dá)明顯高于A組，B、C、D、E組表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)；Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于A組，B、C、D、E組表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)；組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組織學(xué)觀察示B組脊髓組織符合SCI病理改變，C、D、E組神經(jīng)壞死程度較B組好轉(zhuǎn)，并且E組效果優(yōu)于D組，D組優(yōu)于C組。免疫組織化學(xué)染色觀察，B、C、D、E組Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著高于A組，B、C、D、E組呈逐漸降低趨勢(shì)（P＜0.05）。 結(jié)論對(duì)于大鼠急性SCI，芒果苷可通過(guò)減輕脊髓組織水腫、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
目的 構(gòu)建受甲胎蛋白（AFP）增強(qiáng)子和白蛋白（Alb）啟動(dòng)子調(diào)控的含有血管抑制素（angiostatin）K5序列的真核表達(dá)載體，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染，將angiostatin K5基因?qū)敫伟┘?xì)胞，觀察angiostatin K5的表達(dá)。方法 用RTPCR法從正常人真核細(xì)胞擴(kuò)增出angiostatin K5基因，將AFP增強(qiáng)子和Alb啟動(dòng)子調(diào)控序列定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，并將angiostatin K5 cDNA置于上述調(diào)控序列之下，從而構(gòu)建得到重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1AFABangiostatin K5His。利用細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將angiostatin K5基因?qū)敫伟┘?xì)胞。利用SDSPAGE和Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中angiostatin K5的表達(dá)。結(jié)果 通過(guò)酶切鑒定及DNA測(cè)序證實(shí)目的真核表達(dá)載體pcDNA3.1AFABangiostatin K5His與預(yù)期的結(jié)果相同。SDSPAGE及Western blot分析證明，angiostatin K5在肝癌細(xì)胞中得以表達(dá)。結(jié)論 構(gòu)建的肝癌特異性重組真核表達(dá)載體可增加對(duì)AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的治療的特異性，并用于實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的特異性血管抑制作用。
目的 比較胃腸道漿肌層吻合、黏膜外吻合、一層吻合和二層吻合對(duì)吻合愈合的影響。方法 家兔分成4組，即漿肌層吻合組、二層吻合組、一層吻合組和黏膜外吻合組。每組10只，每只動(dòng)物行1個(gè)胃十二指腸側(cè)側(cè)吻合、2個(gè)回腸端端吻合和2個(gè)結(jié)腸端端吻合。術(shù)后第3和7 d，每組分別各取5只動(dòng)物，測(cè)定吻合破裂壓（ABP）、組織羥脯氨酸（HP）含量并做病理檢查。結(jié)果 術(shù)后第3 d，各組ABP間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。術(shù)后第7 d， 二層吻合、一層吻合和黏膜外吻合的ABP間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)； 胃十二指腸漿肌層吻合的ABP高于二層吻合和一層吻合（P＜0.05）； 回腸漿肌層吻合的ABP高于二層吻合（P＜0.01）； 結(jié)腸漿肌層吻合的ABP高于二層吻合、一層吻合和黏膜外吻合（P＜0.05）。術(shù)后第3 d，胃十二指腸和回腸吻合的各組HP含量無(wú)明顯差異，結(jié)腸二層吻合HP含量高于一層吻合（P＜0.05）； 術(shù)后第7 d回腸、結(jié)腸吻合的各組HP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)， 胃十二指腸漿肌層吻合HP含量高于二層吻合（P＜0.025）。術(shù)后第3 d，胃十二指腸和回腸吻合的各組炎癥程度相似，結(jié)腸黏膜外吻合的炎癥反應(yīng)輕于二層吻合（P＜0.05）； 術(shù)后第7 d，胃十二指腸和結(jié)腸吻合的各組炎癥程度相似，回腸漿肌層吻合炎癥反應(yīng)輕于二層吻合（P＜0.05）。術(shù)后第7 d，胃腸道吻合各組黏膜愈合指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。結(jié)論 胃腸道漿肌層吻合和其他手工吻合一樣安全可靠，但更加簡(jiǎn)便。