目的探討抑制 miR-429 改善體外血脊髓屏障(blood spinal cord barrier,BSCB)通透性的可行性及機制,為改善脊髓微環(huán)境提供新的基因治療靶點。方法首先,取永生化人腦微血管內(nèi)皮細胞系(hCMEC/D3),應(yīng)用 miR-429 拮抗劑 antagomiR-429 及其陰性對照 antagomiR-429-NC 進行轉(zhuǎn)染,通過熒光顯微鏡觀察以及實時熒光定量 PCR 檢測 miR-429 表達,驗證 antagomiR-429 轉(zhuǎn)染效率。然后觀察 miR-429 對體外 BSCB 通透性的影響。實驗分為 4 組,其中空白對照組(A 組)為正常 hCMEC/D3 細胞、Ha-sc 細胞構(gòu)建 BSCB 模型,低氧誘導(dǎo)組(B 組)、低氧誘導(dǎo)+antagomiR-429-NC 組(C 組)、低氧誘導(dǎo)+antagomiR-429 組(D 組)分別采用正常、antagomiR-429-NC 轉(zhuǎn)染以及 antagomiR-429 轉(zhuǎn)染的 hCMEC/D3 細胞,與 Ha-sc 細胞構(gòu)建 BSCB 模型并低氧處理 12 h。通過辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)通量測定體外 BSCB 通透性,實時熒光定量 PCR、Western blot 和免疫熒光染色觀測內(nèi)皮細胞中緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達水平。結(jié)果熒光顯微鏡下觀察 antagomiR-429 及 antagomiR-429-NC 成功轉(zhuǎn)染至 hCMEC/D3 細胞,轉(zhuǎn)染效率約為 90%;實時熒光定量 PCR 檢測 antagomiR-429 組 miR-429 相對表達量為 0.109±0.013,明顯低于 antagomiR-429-NC 組的 0.956±0.004(P<0.05)。HRP 通透性測量、實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測顯示,B、C 組 HRP 通透性明顯高于 A、D 組,ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白及 mRNA 相對表達量均明顯低于 A、D 組(P<0.05);B、C 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),D 組尚未達 A 組水平(P<0.05)。免疫熒光染色觀察示 D 組 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白在細胞膜邊界免疫熒光較 B、C 組增強,但尚未達 A 組強度。結(jié)論通過抑制 miR-429 表達可促進微血管內(nèi)皮細胞中 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 蛋白表達,進而改善因低氧導(dǎo)致的 BSCB 通透性增高。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后VEGF 受體胎肝激酶1(fetal liver kinase 1,F(xiàn)lk-1)基因和蛋白表達的影響,探討B(tài)MSCs 移植修復(fù)大鼠SCI 的機制。 方法 取4 周齡雄性Wistar 大鼠5 只,體重100 ~ 120 g,進行BMSCs 分離及培養(yǎng)。取81 只Wistar 雌性大鼠,體重220 ~ 250 g,采用改良Allen’s 打擊裝置制備SCI 模型,隨機分為3 組:假手術(shù)組(A 組,n=21),僅咬除T8 ~ 10 棘突和椎板;DMEM 組(B 組,n=30),SCI 區(qū)周圍注射DMEM;BMSCs 組(C 組,n=30),SCI 區(qū)周圍注射BMSCs。于移植術(shù)后1、3、5 d,采用RT-PCR 方法檢測各組大鼠SCI 區(qū)Flk-1 基因表達的變化;于移植術(shù)后3、7、14 d,免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓內(nèi)Flk-1 蛋白的表達。 結(jié)果 原代培養(yǎng)的BMSCs 細胞形態(tài)多樣,隨著傳代次數(shù)的增加,細胞形態(tài)逐漸趨于均一,多為扁平形和長梭形。RT-PCR 結(jié)果顯示,在移植術(shù)后1、3、5 d,C 組Flk-1 mRNA 表達水平與B 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05);但B、C 組與A 組比較,F(xiàn)lk-1 mRNA表達于術(shù)后1 d 明顯增加并達峰值(P lt; 0.01),術(shù)后3 d 下降(P lt; 0.01),至術(shù)后5 d 表達仍高于A組(P lt; 0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,移植術(shù)后3 、7 d,B 組Flk-1 蛋白表達較A 組顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.01);術(shù)后14 d,A、B 組Flk-1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05) ;移植術(shù)后3 d,B、C 組Flk-1 表達相似,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05),移植術(shù)后7 、14 d,C 組Flk-1 表達明顯高于B 組(P lt; 0.01)。 結(jié)論 SCI 后BMSCs 移植對Flk-1 mRNA 的表達無調(diào)節(jié)作用,但上調(diào)Flk-1 蛋白的表達,是修復(fù)SCI 的機制之一。
目的通過瞬時轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,觀察缺氧處理后人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情況,探討 HIF-1α 對 hAMSCs 耐受缺氧能力的影響。方法取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦自愿捐贈的羊膜組織分離、培養(yǎng) hAMSCs,通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及免疫熒光法檢測干細胞標志物 OCT-4、NANOG 表達,對培養(yǎng)細胞進行鑒定。取第 3 代 hAMSCs 進行缺氧處理(200 μmol/L CoCl2)后,按以下分組瞬時轉(zhuǎn)染對應(yīng)質(zhì)粒:A 組為 hAMSCs 空白組,B 組為 pcDNA3.1 陰性對照組,C 組為 shRNA 陰性對照組,D 組為 shRNA-HIF-1α 干擾組,E 組為 pcDNA3.1-HIF-1α 過表達組。缺氧處理后 12、24、48 h 采用細胞計數(shù)試劑盒 8(cell counting kit 8,CCK-8)檢測各組細胞成活率;24 h 采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,并采用 Western blot 檢測 HIF-1α、VEGF、B 細胞淋巴瘤 2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表達。結(jié)果CCK-8 法檢測示,缺氧處理后各時間點與 A、C 組比較,D 組細胞成活率明顯降低(P<0.05);與 A、B 組比較,E 組細胞成活率明顯升高,其中 24 h 組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);E 組內(nèi) 24 h 時細胞成活率明顯高于 12、48 h 時(P<0.05)。流式細胞儀檢測示,與 A、C 組比較,D 組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與 A、B 組比較,E 組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。Western blot 檢測示,與 A、C 組比較,D 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯減少,Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而 E 組結(jié)果相反,與 A、B 組比較,E 組細胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表達明顯增加,Bax、C-Caspase-3 蛋白表達明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HIF-1α 基因過表達能夠明顯改善 hAMSCs 耐受缺氧能力,其機制可能與上調(diào) VEGF 和 Bcl-2 表達及下調(diào) Bax 和 C-Caspase-3 表達作用相關(guān)。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后運動功能恢復(fù)、VEGF 基因表達和血管生成的影響,探討B(tài)MSCs 治療SCI 的機制。 方法 取5 只4 周齡Wistar 雄性大鼠骨髓,分離培養(yǎng)BMSCs,取第3 ~ 4 代細胞進行實驗。取Wistar 雌性成年大鼠87 只,體重220 ~ 250 g,隨機分為假手術(shù)組(A 組,21 只)、DMEM注射組(B 組,33 只)和BMSCs 移植組(C 組,33 只)。A 組僅咬除T8 ~ 10 棘突和椎板;B、C 組參照Nystrom 方法制備T8 ~ 10 SCI 模型,傷后30 min C 組注射BMSCs(共3.0 × 105 個),B 組注射等量DMEM。于術(shù)后3、7、14、28 d 采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分法評價大鼠后肢運動功能;術(shù)后3、7、14、28 d 應(yīng)用Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色行微血管計數(shù)觀測血管生成情況;術(shù)后1、3、5 d 應(yīng)用RT-PCR 法檢測損傷脊髓組織內(nèi)VEGF mRNA 的表達。 結(jié)果 術(shù)后各時間點B、C 組大鼠后肢功能隨時間延長均有不同程度恢復(fù),各時間點BBB 評分與A 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。術(shù)后28 d,C 組BBB 評分顯著高于B 組(P lt; 0.05),其余時間點B、C 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。術(shù)后3 d,B、C 組損傷周圍區(qū)脊髓灰質(zhì)腹側(cè)角內(nèi)微血管數(shù)目明顯少于A 組(P lt; 0.05);術(shù)后7、14、28 d 與A 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。C 組術(shù)后3、7 d 脊髓灰質(zhì)腹側(cè)角內(nèi)微血管數(shù)目與B 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05);但術(shù)后14、28 d 顯著高于B 組(P lt; 0.05)。各組術(shù)后各時間點損傷周圍區(qū)脊髓白質(zhì)內(nèi)的微血管數(shù)目比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。RTPCR檢測示,A 組大鼠脊髓組織內(nèi)VEGF mRNA 表達水平較低。B、C 組與A 組相比,于術(shù)后1 d 開始VEGF mRNA 表達增加,3 d 時表達達峰值,5 d 時表達下降但仍高 于A 組,各時間點與A 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05);C 組各時間點均高于B 組(P lt; 0.05)。 結(jié)論 BMSCs 可能通過上調(diào)VEGF 基因表達和增加脊髓內(nèi)新生血管而促進大鼠SCI 后運動功能恢復(fù)。
目的 氨基胍(aminoguanidine,AG)能顯著減輕腦外傷及中風(fēng)動物模型腦水腫,提高神經(jīng)功能恢復(fù)程度。探討AG對大鼠急性脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后脊髓水腫的作用及相關(guān)機制。 方法 取成年雄性SD大鼠150只(體重230~255 g),分為對照組(A組,25只)、假損傷組(B組,25只)、SCI后未治療組(C組,25只)和SCI后AG治療組(75只);AG治療組按給藥劑量分為AG 75 mg/kg組(D組,25只)、AG 150 mg/kg組(E組,25只)和AG 300 mg/kg組(F組,25只)。A組未行任何處理,B組僅行椎板切除術(shù)但不治療;C、D、E、F組制備靜壓型大鼠SCI模型后,C組腹腔注射5%DMSO,D、E、F組腹腔注射相應(yīng)劑量AG。于造模后0、12、24、48 h用干濕重法檢測受損脊髓組織含水量以篩選最佳劑量,進一步用伊文思蘭(Evans blue,EB)法評測血-脊髓屏障功能,用RT-PCR檢測水通道蛋白4(aquaporins 4,AQP4)mRNA表達,Western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測AQP4蛋白表達。 結(jié)果脊髓組織含水量檢測示,E組在造膜后12、24、48 h對SCI后脊髓組織水腫有明顯抑制作用(P lt; 0.05),選擇該劑量組用于后續(xù)實驗。造模后12、24、48 h,E組EB含量明顯低于C組(P lt; 0.05),降低血-脊髓屏障通透性。RT-PCR檢測結(jié)果示造模后12、24、48 h,B、E組AQP4 mRNA表達明顯低于C組;Western blot檢測示造模后24、48 h,B、E組AQP4蛋白表達明顯低于C組;免疫組織化學(xué)染色示造模后48 h,B、E組AQP4蛋白表達明顯低于C組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05);但各指標各時間點B、E組間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論急性SCI后大鼠經(jīng)150 mg/kg AG治療后,能降低AQP4表達,改善脊髓水腫,減輕損傷。