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找到 關(guān)鍵詞 包含"hVEGF165" 6條結(jié)果
  • 脂質(zhì)體介導的重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨能力的影響

    目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨誘導分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達載體。取健康成人自愿捐獻的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs,采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體(pIRES-neo)轉(zhuǎn)染至hBMSCs,作為A、B、C、D 組;另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細胞作為對照組(E 組)。培養(yǎng)4 周,采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達,Western blot 檢測細胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達,定量檢測ALP 活性,免疫組織化學方法檢測Col Ⅰ表達。 結(jié) 果 與E 組比較,A 組hBMSCs 高表達hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素,B 組大量表達骨鈣素及Col Ⅰ,C組高表達hVEGF165,而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達與D、E 組相似,呈陰性或僅有痕量表達。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02,A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05),C、D、E 組差異無統(tǒng)計學意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs,外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細胞中能持續(xù)表達,并能增強hBMSCs 的成骨能力。

    發(fā)表時間:2016-09-01 09:08 導出 下載 收藏 掃碼
  • hVEGF165 基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 的實驗研究

    目的 構(gòu)建攜帶hVEGF165 基因的重組腺病毒載體pAdxsi- 增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165 ,體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,觀察轉(zhuǎn)染后hVEGF165 的表達情況以及對BMSCs 生長增殖的影響,為進行血管再生的基因治療奠定實驗基礎(chǔ)。 方法 將hVEGF165 從原始質(zhì)粒切下連接到pShuttle- 巨細胞病毒-EGFP 重組穿梭載體,并轉(zhuǎn)移至pAdxsi 載體上,獲得重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165 ,進行酶切鑒定及基因測序。采用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165 ,并轉(zhuǎn)染人胚腎細胞HEK293,收獲重組腺病毒,測定病毒滴度。貼壁法培養(yǎng)Wistar 大鼠BMSCs,體外轉(zhuǎn)染攜帶EGFP 基因的重組腺病毒(pAdxsi-EGFP),熒光倒置相差顯微鏡及流式細胞術(shù)確定最佳病毒感染復數(shù)(multiplicities of infection,MOI)。依據(jù)最佳MOI 轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFP-hVEGF165 至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR 及ELISA 法檢測轉(zhuǎn)染后hVEGF165 的表達;MTT 法評價轉(zhuǎn)染后BMSCs 生長增殖情況。 結(jié)果 酶切鑒定及基因測序提示重組腺病毒載體質(zhì)粒含有hVEGF165 cDNA;經(jīng)多輪感染、擴增后,病毒滴度可達1 × 1010 pfu/mL。熒光倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFP 后MOI 為150 pfu/cell 時轉(zhuǎn)染效果最佳,流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率約88%。Western blot 和RT-PCR 檢測示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165 轉(zhuǎn)染BMSCs 48 h 后在蛋白質(zhì)和基因水平均可有效表達hVEGF165 ;ELISA 檢測示其含量在7 d 達高峰,在20 d 時仍有表達,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d 各時間點hVEGF165 含量均顯著高于EGFP 基因轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組(P lt; 0.05)。MTT 結(jié)果顯示,各時間點轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFPhVEGF165的BMSCs 與未轉(zhuǎn)染組細胞的吸光度(A)值比較差異無統(tǒng)計學意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 BMSCs 是一種較理想的基因載體細胞,成功制備的重組腺病毒載體質(zhì)??稍贛OI 值為150 時將hVEGF165 基因有效轉(zhuǎn)染至BMSCs;轉(zhuǎn)染后hVEGF165 表達水平較高、持續(xù)時間較長,且對BMSCs 的生長增殖無明顯影響。

    發(fā)表時間:2016-08-31 05:42 導出 下載 收藏 掃碼
  • 人基質(zhì)細胞衍生因子1α 和hVEGF165 基因轉(zhuǎn)染成肌細胞的實驗研究

    目的 探索轉(zhuǎn)染hVEGF165 基因、人基質(zhì)細胞衍生因子1α(human stromal cell-derived factor 1α,hSDF- 1α)基因的大鼠成肌細胞在體外mRNA 和蛋白表達,為進一步檢測這兩種基因?qū)ρ苌傻膮f(xié)同效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 方法 取新生1 日齡雄性SD 大鼠,采用胰蛋白酶消化法體外分離培養(yǎng)、純化成肌細胞,并采用結(jié)蛋白免疫細胞化學染色鑒定。將質(zhì)粒增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165 和EGFP-hSDF-1α 轉(zhuǎn)染第3 代成肌細胞(轉(zhuǎn)染組),以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞作為對照組。體外培養(yǎng)后各時間點行RT-PCR、Western blot、ELISA 法檢測兩種質(zhì)粒mRNA 及蛋白的表達。 結(jié)果 培養(yǎng)的細胞經(jīng)鑒定確定為成肌細胞。熒光顯微鏡觀察示成功轉(zhuǎn)染hSDF- 1α和hVEGF165 進入成肌細胞,可見綠色熒光表達。RT-PCR 檢測示轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后2、4、6、8 d 均可見hVEGF165 和hSDF- 1αmRNA 的表達,Western blot 檢測示轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后2、4、6、8 d 成肌細胞內(nèi)均有hVEGF165 和hSDF-1α 蛋白表達,對照組均無相關(guān)表達。ELISA 檢測示對照組hSDF-1α 和hVEGF165 均穩(wěn)定表達,呈較低水平。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染2 d 時hSDF-1α 和hVEGF165 表達均達較高水平,之后呈逐漸下降趨勢;轉(zhuǎn)染后各時間點間hSDF-1α 和hVEGF165 表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05)。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后各時間點與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 轉(zhuǎn)染hSDF-1α 和hVEGF165 進入大鼠成肌細胞后在體外均有表達,為下一步研究體內(nèi)是否表達提供了實驗依據(jù)。

    發(fā)表時間:2016-08-31 05:42 導出 下載 收藏 掃碼
  • hVEGF165 及hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒載體的體外生物學活性研究

    目的 通過體外實驗探討hVEGF165 和hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒載體(recombinant adenoassociated virus,rAAV)體外生物學活性,為體內(nèi)應(yīng)用其進行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 分別采用rAAVhVEGF165-內(nèi)部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site,IRES)- hBMP-7(實驗組)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記的rAAV-IRES-GFP(對照組)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs,于轉(zhuǎn)染后1、2、3、7 及14 d 應(yīng)用ELISA 法及轉(zhuǎn)染后14 d 應(yīng)用Western blot 法鑒定兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達;轉(zhuǎn)染后14 d 行細胞免疫熒光染色觀察hVEGF165 和hBMP-7 表達一致性。應(yīng)用第3 代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管狀血管形成實驗檢測hVEGF165 蛋白活性。取第3 代BMSCs 行誘導成骨實驗,Gomori 鈣鈷法ALP 染色及茜素紅法鈣鹽染色檢測hBMP-7 蛋白活性。 結(jié)果 ELISA 檢測示隨轉(zhuǎn)染時間延長,兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達逐漸升高;實驗組各時間點hVEGF165 和hBMP-7 表達量均明顯高于對照組(P lt; 0.05)。Western blot 檢測示實驗組可見hVEGF165 和hBMP-7表達,對照組未見陽性表達。細胞免疫熒光染色觀察示實驗組hVEGF165 和hBMP-7 染色呈陽性,表達部位和強度具有較好一致性;對照組未見陽性表達。HUVEC 管狀血管形成實驗示實驗組HUVEC 拉長變形、出芽且相互交聯(lián)成管狀樣結(jié)構(gòu);與對照組相比,管狀血管數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05)。ALP 染色見實驗組細胞出現(xiàn)深染顆粒,對照組細胞內(nèi)淺著色;與對照組相比,礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 雙基因共表達rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7體外具有良好的生物學活性。

    發(fā)表時間:2016-08-31 05:47 導出 下載 收藏 掃碼
  • hVEGF165 及hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒載體介導基因表達的時效性研究

    目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒載體(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介導基因表達的時效性,為體內(nèi)應(yīng)用其進行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用熒光細胞計數(shù)法測定rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs 的最佳轉(zhuǎn)染復數(shù)。分別采用rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site,IRES)- hBMP-7(實驗組)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記平行對照rAAV-IRES-GFP(對照組)在最佳轉(zhuǎn)染復數(shù)條件下轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs。于不同時間點分別行GFP 表達檢測、RT-PCR 檢測、Western blot 檢測明確rAAV 體外介導基因表達的時效性關(guān)系。將實驗組及對照組病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs 以5 × 106 個/ mL 密度,分別注射至9 只2 月齡純種雄性新西蘭大耳白兔制備的肌袋模型內(nèi)各1 mL(實驗組1 及對照組1),于不同時間點分別行GFP表達檢測、Western blot 檢測及ELISA 檢測明確rAAV 體內(nèi)介導基因表達的時效性關(guān)系。 結(jié) 果 rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染復數(shù)為5 × 104 v.g/cell。通過體外檢測顯示rAAV 轉(zhuǎn)染BMSCs 后1 d 即有目的基因表達,14 d 時表達強度明顯增強,至28 d 時仍維持較強表達。通過體內(nèi)檢測顯示體內(nèi)轉(zhuǎn)染2 周可檢測到目的基因表達,6 周時表達強 度增強,8 周時仍維持較高水平。ELISA 法檢測實驗組1 細胞培養(yǎng)上清中hVEGF165 和hBMP-7 含量分別為(248.67 ± 75.58)pg/mL 和(4.80 ± 0.61) ng/ mL, 對照組1 分別為(32.28 ± 8.42)pg/mL 和(0.64 ± 0.42)ng/mL,兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 雙基因共表達rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 具有較好的轉(zhuǎn)染時效性。

    發(fā)表時間:2016-08-31 05:49 導出 下載 收藏 掃碼
  • hVEGF165 及hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒載體體內(nèi)誘導成骨及成血管研究

    目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)體內(nèi)誘導成骨及成血管的活性,為股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)的AAV 基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 取體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs,分別采用以下4 種病毒轉(zhuǎn)染并分為4 組:rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(A 組)、rAAV-hVEGF165- 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)(B 組)、rAAV- hBMP-7-GFP(C 組)及rAAV-IRES-GFP(D 組)。取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作后肢缺血模型,并隨機分為4 組(n=6),于股骨肌肉內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs,8 周后應(yīng)用超聲影像學檢測兔后肢脛前動脈血流量,行CD34 免疫組織化學染色檢測微血管生成。另取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作股骨肌袋模型,并隨機分為4 組(n=6),于肌袋內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs,8 周后應(yīng)用X 線片檢測兔后肢原位骨化,行von Kossa 鈣鹽染色檢測肌肉組織成骨礦化。 結(jié)果 病毒注射后動物未出現(xiàn)局部或全身毒性反應(yīng)。病毒注射后8 周,A 組兔后肢脛前動脈血流百分比及CD34 陽性微血管數(shù)均高于其他3 組,差異有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05);B 組高于C、D 組,差異有統(tǒng)計學意義(P lt; 0.05);C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P gt; 0.05)。病毒注射后8 周,A、C 組兔后肢肌袋內(nèi)出現(xiàn)可被X 線檢測到的原位骨化,von Kossa 肌肉組織鈣鹽染色可見大量鈣鹽沉積,且A 組原位骨化及鈣鹽沉積程度均較C 組強;B 組及D 組均未見明顯原位骨化及鈣鹽沉積形成。 結(jié)論 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 載體具有體內(nèi)誘導成骨及成血管的生物學活性。

    發(fā)表時間:2016-09-01 09:04 導出 下載 收藏 掃碼
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