目的 探討NGF 對骨折愈合的影響,以及對BMP-2 誘導(dǎo)成骨的作用。 方法 清潔級雄性6 ~ 8 周昆明小鼠60 只,體重23 ~ 25 g,隨機分為4 組,每組15 只。建立股骨中段不穩(wěn)定軟骨內(nèi)成骨骨折模型,A、B、C、D 組分別于骨折斷端局部使用NGF/ 生理鹽水、BMP-2、BMP-2/NGF/ 生理鹽水、生理鹽水。各組分別于術(shù)后14、21 和28 d 各處死5 只小鼠,并于骨折部位取材行大體、X 線片觀察、生化檢測及組織學(xué)觀察。處死小鼠前取小鼠眼球球后動靜脈血液行血清ALP 活性測定。 結(jié)果 術(shù)后各時間點,大體觀察A、B、C 組局部新生硬組織大小、硬度,骨折斷端骨痂生長依次增加,均高于D 組。X 線片觀察A、B、C 組骨折線逐漸模糊,鈣化面積依次增大,均快于D 組。組織學(xué)觀察A、B、C 組骨小梁成熟度依次增加,均優(yōu)于D 組。術(shù)后各時間點,A、B、C 組成骨面積和成骨區(qū)灰度值、血清ALP 含量、骨痂組織中ALP含量和鈣含量、骨痂濕重均高于D 組。術(shù)后各時間點各組成骨面積和成骨區(qū)灰度值比較、術(shù)后14 d 各組血清中ALP 含量比較、術(shù)后14 d 和21 d 各組骨痂組織中ALP 含量比較、術(shù)后21 d 和28 d 各組骨痂組織中鈣含量及骨痂濕重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。術(shù)后14 d,B、C 組與A、D 組比較骨痂濕重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。術(shù)后21、28 d,骨組織形態(tài)計量分析顯示各組新生骨骨小梁表面成骨細(xì)胞指數(shù)、平均骨小梁面積百分比和平均骨小梁寬度隨時間增大依次減小,A、B、C 組依次增大,均高于D 組,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 NGF 有促進骨折愈合作用,且具有協(xié)同BMP-2 誘導(dǎo)成骨的作用。
目的 構(gòu)建攜帶NGF 基因序列的5 型腺病毒(adenovirus expressing NGF,Ad-NGF),探討其在促進大鼠坐骨神經(jīng)神修復(fù)與再生中的作用。 方法 將NGF 基因序列克隆至5 型腺病毒穿梭質(zhì)粒pCA13,并在HEK-293 細(xì)胞中包裝得到重組腺病毒Ad-NGF 并測序鑒定。雄性SD 大鼠32 只,體重180 ~ 200 g,隨機分為4 組(n=8)。切斷大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)并縫合,建立坐骨神經(jīng)損傷模型。模型制備后,A 組及C 組分別于術(shù)側(cè)腓腸肌注射Ad-NGF 及不攜帶NGF基因序列的空腺病毒載體,1 × 108 PFU/ 次,隔天1 次,共3 次; B 組及D 組分別于術(shù)側(cè)腓腸肌注射NGF(200 U/d)及生理鹽水(100 μL/d),連續(xù)3 周。術(shù)后第31 天檢測坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、神經(jīng)電生理檢測,取吻合處及其遠(yuǎn)端1 cm 坐骨神經(jīng),采用RT-PCR 及Western blot 技術(shù)定量檢測大鼠損傷坐骨神經(jīng)中NGF mRNA 及蛋白的表達水平,并行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)、透射電鏡觀察。 結(jié)果 實驗成功構(gòu)建了攜帶NGF 基因序列的5 型腺病毒Ad-NGF。A 組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、誘發(fā)電位波幅及潛伏期與B、C、D 組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05);B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。RT-PCR 及Western blot 檢測顯示,A 組NGF mRNA 及蛋白表達量與B、C、D 組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05);B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察示A 組坐骨神經(jīng)再生情況明顯優(yōu)于其他組。透射電鏡觀察示A 組坐骨神經(jīng)橫切面軸突直徑、髓鞘厚度、神經(jīng)纖維個數(shù)與B、C、D 組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05);B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。 結(jié)論 Ad-NGF 提供了一種在周圍神經(jīng)損傷局部獲得大量NGF 的新方法,且可有效促進大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的修復(fù)。
目的 研究NGF 對人真皮成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、膠原合成和遷移的影響,探討NGF 在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用。 方法 采用酶消化法體外分離培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞,取第3 代細(xì)胞進行實驗。分別加入0、25、50、100、200、400 ng/mL NGF,培養(yǎng)48 h 采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖;加入0、100 ng/mL NGF,培養(yǎng)48 h 采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞有絲分裂周期,采用羥脯氨酸法檢測培養(yǎng)液膠原含量,實時熒光定量PCR 測定細(xì)胞Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA 表達水平;建立體外細(xì)胞劃痕創(chuàng)傷模型,加入0、50、100、200 ng/mL NGF,培養(yǎng)24 h 觀察細(xì)胞遷移。 結(jié)果 MTT 法檢測結(jié)果顯示,各濃度組間細(xì)胞增殖的吸光度值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。在0、100 ng/mL NGF 作用下,細(xì)胞周期顯示兩組的G0/ G1 期、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05),羥脯氨酸法測得兩組細(xì)胞培養(yǎng)液膠原含量和實時熒光定量PCR 測定細(xì)胞Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA 表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h 后0、50、100、200 ng/mL NGF 濃度組細(xì)胞遷移率分別為52.12% ± 6.50%、80.67% ± 8.51%、66.33% ± 3.58% 和61.19% ± 0.97%,50、100 ng/mL NGF 可顯著促進細(xì)胞遷移(P lt; 0.05)。 結(jié)論 NGF 對人真皮成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA 表達無影響,不能促進膠原合成,但能促進人真皮成纖維細(xì)胞遷移。
目的 制備NGF-胰島素復(fù)合凝膠并觀察其對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的影響。 方法以卡波姆980為基質(zhì),分別加入NGF 4 000 U、胰島素800 U,制備胰島素凝膠、NGF凝膠、NGF-胰島素復(fù)合凝膠。觀察NGF-胰島素復(fù)合凝膠性狀,并行體外藥物釋放檢測。75只SPF級雄性Wistar大鼠,體重200~250 g,隨機分為正常對照組(A組)、糖尿病對照組(B組)、局部胰島素凝膠治療組(C組)、局部NGF凝膠治療組(D組)、局部NGF-胰島素復(fù)合凝膠治療組(E組),每組15只。B、C、D、E組大鼠采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg)制備1型糖尿病模型,A組注射相同劑量檸檬酸鈉緩沖液。造模成功后,采用恒溫水浴箱法于各組大鼠背部制備深Ⅱ度燙傷模型。A、B組創(chuàng)面外敷空白凝膠基質(zhì),C、D、E組對應(yīng)外敷胰島素凝膠、NGF凝膠、NGF-胰島素復(fù)合凝膠,每天換藥1次。燙傷后觀察各組大鼠存活情況,于3、7、11、15、21 d觀察創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面愈合率,各時間點每組處死3只大鼠取皮膚全層標(biāo)本行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察。 結(jié)果制備的NGF-胰島素復(fù)合凝膠清亮透明,保濕性及黏附性良好,易于涂抹及清洗。體外釋放檢測示NGF-胰島素復(fù)合凝膠釋藥時間可達24 h以上,且30 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。各組大鼠均存活至實驗完成。燙傷后3 d各組創(chuàng)面無縮小,7、11、15、21 d時E組創(chuàng)面愈合率最高,B組最低,與其余各組比較以及E、B組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。組織學(xué)觀察示各時間點E組肉芽組織和膠原纖維生長均優(yōu)于其余各組。免疫組織化學(xué)染色示各組CD34、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)均于3 d開始表達,且隨時間延長陽性細(xì)胞逐漸增多;各時間點E組微血管密度及PCNA最高,B組最低,與其余各組比較以及E、B組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論局部應(yīng)用NGF-胰島素復(fù)合凝膠可顯著促進大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合。
目的 改進雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)原代培養(yǎng)方法,以獲得大量高純度SCs;研究豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)與SCs的生物相容性;通過復(fù)合SCs,使SIS負(fù)載NGF。 方法取2~3日齡SD乳鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng),以胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶分步消化,差速貼壁20 min,G418處理48 h,含2.5%FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);MTT法檢測SCs增殖情況,抗S-100免疫熒光染色檢測SCs純度。將第3代SCs和SIS復(fù)合培養(yǎng),行HE染色和掃描電鏡觀察兩者復(fù)合生長情況,復(fù)合培養(yǎng)1、2、3、4、5、7 d ELISA法檢測培養(yǎng)上清中NGF含量。復(fù)合培養(yǎng)3、5、7、10、13、15 d后反復(fù)凍融脫細(xì)胞處理,ELISA法檢測脫細(xì)胞后SIS中NGF含量。 結(jié)果純化后的SCs純度達98%以上;MTT檢測示SCs傳代后3 d進入對數(shù)生長期,7 d后進入平臺期。HE染色和掃描電鏡觀察均顯示SCs在SIS上黏附良好,細(xì)胞形態(tài)呈紡錘形,有明顯突起,分泌較多細(xì)胞外基質(zhì)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)SCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)后,培養(yǎng)上清中的NGF含量隨時間延長而逐漸升高,與同時間點對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P gt; 0.05)。通過與SCs復(fù)合后反復(fù)凍融脫細(xì)胞,SIS中NGF含量在培養(yǎng)10 d達峰值(414.29 ± 20.87)pg/cm2,顯著高于未復(fù)合細(xì)胞的單純SIS材料中NGF含量(4.92 ± 2.06) pg/ cm2,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論聯(lián)合雙酶消化、差速貼壁、G418處理、低濃度酶消化和低濃度血清培養(yǎng),可在較短時間內(nèi)獲得大量高純度SCs。SCs與SIS復(fù)合生長相容性好,不影響SCs的NGF分泌。通過與SCs的復(fù)合、反復(fù)凍融脫細(xì)胞后,SIS中負(fù)載了大量NGF,有望成為良好的神經(jīng)修復(fù)材料。
目的 探討局部應(yīng)用NGF 聯(lián)合胰島素對糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面血管中凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax 表達的影響及創(chuàng)面愈合的機制。 方法 取75 只清潔級雄性Wistar 大鼠,體重200 ~ 220 g,隨機分為正常對照組(A 組)、糖尿病對照組(B 組)、胰島素治療組(C 組)、NGF 治療組(D 組)、NGF 聯(lián)合胰島素治療組(E 組),每組15 只。B、C、D、E 組大鼠采用兩步給藥法腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病模型,STZ 劑量分別為第1 天10 mg/kg,第3 天50 mg/kg;A 組給予相同劑量檸檬酸緩沖液。模型制備后1 個月,采用水蒸氣燙傷法于各組大鼠背部制備2 個深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。燙傷模型制備后,A、B 組創(chuàng)面外敷3 層生理鹽水紗布;C 組創(chuàng)面外敷3 層浸潤5 U 胰島素諾和靈30R 的紗布,并每日腹部皮下注射諾和靈30R 4 ~ 6 U/kg;D 組創(chuàng)面外敷3 層浸潤5 mL NGF 溶液(25 U/mL)的紗布;E 組聯(lián)合C、D組方法處理。觀察大鼠一般情況,傷后7、11、15、21 d 大體觀察各組創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面愈合率,傷后3、7、11、15、21 d 取創(chuàng)面組織行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,檢測創(chuàng)面Bcl-2、Bax、CD34 的表達并計算微血管密度。 結(jié)果 各組大鼠均存活至實驗完成。隨時間延長,各組創(chuàng)面逐漸縮小,其中E 組創(chuàng)面愈合速度、皮膚角化、毛發(fā)生長及肉芽組織和膠原纖維生長均優(yōu)于其余各組。傷后各時間點E 組創(chuàng)面愈合率均高于其余各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。傷后隨時間延長,各組CD34、Bcl-2 表達逐漸增強,至15 d 達高峰,21 d 表達減弱;E 組各時間點表達均強于其他各組(P lt; 0.05)。傷后3 d 各組均未見Bax 表達,7 d 后開始見新生血管內(nèi)皮細(xì)胞Bax 表達,且隨時間延長表達逐漸增強,其中E 組表達強度均低于其余各組(P lt; 0.05)。 結(jié)論 局部聯(lián)合應(yīng)用NGF 和胰島素可通過抑制創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、增加創(chuàng)面血管生成,促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合。
目的 通過研究局部應(yīng)用不同濃度NGF 對骨折愈合的影響,進一步探討NGF 促進骨折愈合的適宜濃度。 方法 成年雄性SD 大鼠75 只,體重(220.0 ± 2.5)g,隨機分成A、B、C、D、E 5 組(n=15)。實驗動物建立右脛骨中上段骨折模型,A、B、C、D 組分別于骨折斷端局部注射含0.006 48 × 10-2、0.032 40 × 10-2、0.162 00 × 10-2、0.810 00 ×10-2 μg/g NGF 的生理鹽水0.3 mL,每天1 次,連續(xù)注射7 d;E 組注射等量生理鹽水。各組分別于術(shù)后2、4、6 周各處死5只大鼠,并于骨折部位取材行大體、X 線片觀察、生化檢測及組織學(xué)觀察。處死大鼠前取大鼠眼球球后動、靜脈血液行血清ALP 活性測定。 結(jié)果 術(shù)后各時間點,大體觀察表明A、B、C、D 組局部新生硬組織大小、硬度、骨折斷端骨痂生長逐漸遞增,D 組明顯優(yōu)于A、B、C、E 組。X 線片示A、B、C、D 組骨折線逐漸模糊,鈣化面積逐漸增大,D 組骨痂鈣化明顯快于A、B、C 組和E 組。組織學(xué)觀察示D 組骨小梁質(zhì)量及成熟度明顯優(yōu)于A、B、C 組和E 組。D 組術(shù)后4、6 周成骨區(qū)灰度值、骨痂鈣含量,2、4 周骨痂組織濕重及2 周血清ALP 含量均顯著高于A、B、C 組和E 組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。術(shù)后2、4 周,骨組織形態(tài)計量分析顯示各組新生骨骨小梁表面成骨細(xì)胞指數(shù)、骨小梁面積百分比和骨小梁寬度隨時間延長而減小;同一時間點A、B、C、D 組依次增大,均大于E 組,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P lt; 0.05)。 結(jié)論 局部應(yīng)用NGF 對大鼠骨折愈合有促進作用,高濃度的NGF(0.810 00 × 10-2 μg/g)對骨折愈合有顯著促進作用。
為了解神經(jīng)生長因子(NGF)對損傷的脊髓組織的作用,采用Alen氏WD裝置,以10g沖擊棒自2.5cm高度下落撞擊SD大鼠T8脊髓,并于蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)置入導(dǎo)管。術(shù)后,實驗組經(jīng)導(dǎo)管注入NGF溶液;對照組則注入生理鹽水。術(shù)后4,8及24h,取脊髓損傷段標(biāo)本,分別經(jīng)干濕法、原子吸收光譜法測量水、鈣含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):損傷脊髓段組織鈣含量明顯增高,組織水腫嚴(yán)重;脊髓損傷后,應(yīng)用NGF可顯著改善這些變化。這一實驗結(jié)果證實NGF對受傷的脊髓有明顯的保護作用,其保護作用與穩(wěn)定鈣離子水平有關(guān)。
目的探討以濃度梯度方式負(fù)載NGF的周圍神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損的效果。 方法采用聚己內(nèi)酯-丙交酯嵌段共聚物制備周圍神經(jīng)導(dǎo)管。取10 μg NGF溶解于1 mL 3%絲蛋白溶液中,采用直接浸泡或用微量注射泵按3.2 μL/min注入方式,分別制備均勻負(fù)載及濃度梯度負(fù)載NGF的周圍神經(jīng)導(dǎo)管。采用ELISA試劑盒檢測兩種導(dǎo)管12周NGF累積釋放量。取雄性成年SD大鼠24只,體重220~250 g,制備右側(cè)坐骨神經(jīng)14 mm缺損模型。根據(jù)修復(fù)方法不同,隨機分為4組(n=6):A、B、C、D組分別采用單純周圍神經(jīng)導(dǎo)管、均勻負(fù)載NGF的周圍神經(jīng)導(dǎo)管、濃度梯度負(fù)載NGF的周圍神經(jīng)導(dǎo)管、自體神經(jīng)修復(fù)缺損。術(shù)后觀察大鼠一般情況,12周取材行大體觀察、電生理檢測、組織學(xué)觀察及透射電鏡觀察,分析神經(jīng)再生情況。 結(jié)果濃度梯度負(fù)載及均勻負(fù)載NGF的周圍神經(jīng)導(dǎo)管12周內(nèi)NGF累積釋放量分別為(14.2±1.4)、(13.7±1.3)ng/mg,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.564,P=0.570)。大鼠均存活至實驗完成,術(shù)后4 d出現(xiàn)足底部潰瘍,12周時基本愈合;其中C、D組大鼠愈合情況優(yōu)于A、B組。術(shù)后12周,A組復(fù)合肌肉動作電位顯著低于B、C、D組,B組顯著低于C、D組(P<0.05);C、D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組織學(xué)及透射電鏡觀察示,C組軸突密度顯著高于A、B、D組(P<0.05);D組軸突總數(shù)、軸突直徑及肌纖維橫截面積顯著高于A、B、C組,C組高于A、B組(P<0.05);C、D組髓鞘厚度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均優(yōu)于A、B組(P<0.05)。 結(jié)論負(fù)載濃度梯度NGF的周圍神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損效果與自體神經(jīng)修復(fù)接近,可促進坐骨神經(jīng)再生、再生神經(jīng)纖維排列規(guī)律化、提高再生神經(jīng)髓鞘化、加速再生神經(jīng)功能重建。
目的構(gòu)建攜帶NGF及髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)基因序列的雙基因共表達腺病毒(adenovirus expressing NGF and MAG,Ad-NGF-MAG),探討其在大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。 方法將NGF和MAG共同克隆至5型腺病毒穿梭質(zhì)粒pCA13,并在HEK293細(xì)胞中包裝得到重組腺病毒Ad-NGF-MAG并測序鑒定。取雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量180~200 g;隨機分成4組(n=8):對照組(正常對照)、空病毒組(Ad組)、單獨表達NGF組(Ad-NGF組)和共表達NGF、MAG組(Ad-NGF-MAG組)。Ad組、AdNGF組和Ad-NGF-MAG組大鼠制備右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷模型后,分別于術(shù)側(cè)腓腸肌注射空腺病毒、Ad-NGF及AdNGF-MAG(1×108 PFU),隔天1次,共3次。對照組僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)后關(guān)閉切口,術(shù)后對應(yīng)時間點注射生理鹽水10 μL。術(shù)后31 d,分別行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve function index,SFI)、神經(jīng)電生理檢測;切取坐骨神經(jīng)標(biāo)本,行RT-PCR及Western blot檢測NGF及MAG mRNA及蛋白表達水平,以及組織學(xué)觀察。 結(jié)果實驗成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG。32只大鼠術(shù)后均成活,切口Ⅰ期愈合。Ad-NGF-MAG組SFI、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、誘發(fā)電位波幅、潛伏期均明顯優(yōu)于Ad-NGF組和Ad組,但未達對照組水平,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ad-NGF-MAG組內(nèi)MAG mRNA和蛋白表達最高,NGF mRNA和蛋白表達高于對照組和Ad組,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)觀察顯示,對照組神經(jīng)連續(xù)性好,Ad組神經(jīng)纖維層次混亂,Ad-NGF組神經(jīng)纖維層次結(jié)構(gòu)清晰,局部斷端再生良好,但神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂;Ad-NGF-MAG組神經(jīng)纖維生長有序,神經(jīng)直徑較Ad-NGF組粗,神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)良好。 結(jié)論坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)過程中,腺病毒介導(dǎo)NGF與MAG共表達,既可促進神經(jīng)纖維生長,又可抑制神經(jīng)異常分支形成,促進神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)。