目的 觀察不同細(xì)胞密度的微囊化人內(nèi)皮抑素/293（hES/293）細(xì)胞生物學(xué)性狀及其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增生的抑制作用。方法 采用聚電解質(zhì)絡(luò)合法制作不同密度微囊化hES/293細(xì)胞，分為1×104個/ml組（A組）、1×106個/ml組（B組）、1×108個/ml組（C組）；同時將微囊內(nèi)不包裹hES/293細(xì)胞者設(shè)為對照組（D組）；每組6個樣本。培養(yǎng)后1、3、7、14、35 d，錐蟲藍(lán)染色計數(shù)微囊囊內(nèi)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)和存活率；噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測各組微囊化hES/293細(xì)胞的生長情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測微囊化hES/293細(xì)胞囊外內(nèi)皮抑素（ES）蛋白釋放量。取生長狀態(tài)良好的HUVEC分別與A、B、C、D組微囊化hES/293細(xì)胞共同培養(yǎng)。于共同培養(yǎng)后24、72、120 h，MTT比色法檢測微囊化hES/293細(xì)胞對HUVEC增生的抑制作用。結(jié)果 A、B、C組微囊囊內(nèi)hES/293細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)均隨時間延長而增多，囊內(nèi)細(xì)胞存活率于培養(yǎng)后3 d最高。A、B、C組微囊化hES/293細(xì)胞生長速率比較，培養(yǎng)后1 d時組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)后3 d，A組較B、C組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；培養(yǎng)后7、14、35 d，B組較A、C組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A、B、C組微囊化hES/293細(xì)胞囊外ES蛋白釋放量比較，培養(yǎng)后1、14 d時組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)后3 d，A組較B、C組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；培養(yǎng)后7、35 d，B組較A組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。共同培養(yǎng)后24 h，A、B、C組對HUVEC均未表現(xiàn)出抑制作用（P＞0.05）；共同培養(yǎng)后72、120 h，A、B、C組均明顯抑制HUVEC增生，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論細(xì)胞密度為1×106個/ml的微囊化hES/293細(xì)胞生長穩(wěn)定、存活率較高，可持續(xù)穩(wěn)定的釋放ES蛋白。不同密度的微囊化hES/293細(xì)胞均可抑制HUVEC增生。
目的 建立能穩(wěn)定分泌人內(nèi)皮抑素(hES)的基因工程細(xì)胞系，觀察內(nèi)皮抑素（ES）蛋白和hES的表達(dá)。方法 以hES重組質(zhì)粒pcDNA3.0（pcDNA3-Endo）為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增獲得hES基因片段，且在基因前加信號肽序列，將其定向插入真核表達(dá)載體綠色熒光蛋白（pEGFP-N1)）質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ES；利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染到人胚胎腎細(xì)胞(HeK-293)細(xì)胞中, G418 篩選后得到陽性克隆hES/293，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中ES蛋白的表達(dá)；用海澡酸鈉殼聚糖(ACA)微囊包裹hES/293細(xì)胞，分別收集培養(yǎng)3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，Western blot法檢測包裹后培養(yǎng)液上清中hES的表達(dá)。結(jié)果 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ES經(jīng)限制性核對內(nèi)切酶HindⅢ和限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ雙酶切得到4700堿基對(bp)和600 bp 2條帶；PCR擴(kuò)增出600 bp條帶；測序結(jié)果與NCBI上序列比對軟件（BLAST）比對，同源性達(dá)到100%。pEGFP-N1-ES轉(zhuǎn)染HeK-293細(xì)胞，經(jīng)G418 篩選后獲得陽性克隆，選取篩選的10株單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行Western blot分析，在相對分子質(zhì)量為20times;103 處出現(xiàn)蛋白條帶。在ACA微囊內(nèi)hES/293細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞團(tuán)逐漸長大，充滿整個囊內(nèi)空間。培養(yǎng)3、7、21、35 d時，在相對分子質(zhì)量為20times;103處出現(xiàn)蛋白條帶。結(jié)論 重組pEGFP-N1-ES真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染HeK-293細(xì)胞后可有效的表達(dá)hES蛋白，并能分泌到細(xì)胞外；微囊化hES/293細(xì)胞產(chǎn)生的ES蛋白可以自由擴(kuò)散出微囊膜外，并呈持續(xù)性表達(dá)。