目的 研究嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）培養(yǎng)液對(duì)正常及損傷脊髓神經(jīng)元的影響，進(jìn)一步探討OECs 促進(jìn)及保護(hù)脊髓神經(jīng)元的作用機(jī)制。 方法 取成年SD 大鼠OECs 制備OECs 培養(yǎng)液（OEC culturemedium，OECCM），倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，行兔抗大鼠低親和力神經(jīng)生長因子受體p75 抗體（nerve growth factorreceptor p75，NGFR p75）細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察及純度計(jì)算。取孕15 ～ 17 d SD 大鼠制備脊髓神經(jīng)元，并以H2O2 制備損傷模型。觀察OECCM 對(duì)正常胚胎SD 大鼠脊髓神經(jīng)元生長發(fā)育的影響實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（A 組）和實(shí)驗(yàn)組（B 組）， OECCM 對(duì)H2O2 致脊髓神經(jīng)元損傷模型的影響實(shí)驗(yàn)也分為對(duì)照組（C 組）和實(shí)驗(yàn)組（D 組）。A、C 組每孔加200 μL 完全培養(yǎng)基，B、D 組每孔加100 μL OECCM 和100 μL 完全培養(yǎng)基。4 組細(xì)胞均作活性MTT 比色分析。 結(jié)果 OECs 培養(yǎng)6 ～ 9 d 后，細(xì)胞多呈雙極形或梭形；脊髓神經(jīng)元胞體較大，多呈圓形，培養(yǎng)5 ～ 7 d 后，突起明顯生長，多為雙突起。NGFRp75 細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色觀察示OECs 細(xì)胞膜棕色深染，胞體清晰，呈梭性或三角形；OECs 純度 gt; 90%。培養(yǎng)6 ～ 9 d 后，與A 組相比，B 組細(xì)胞生長旺盛，密度較高，胞體明顯增大。A 組胞體平均直徑、單個(gè)神經(jīng)元突起數(shù)目及細(xì)胞突起長度分別為（33.38 ± 6.80）D/μm、（1.67 ± 0.80）個(gè)和（91.19 ± 62.64）L/μm，B 組分別為（37.39 ± 7.28）D/μm、（1.76 ± 0.82）個(gè)和（121.33 ± 81.13） L/μm，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。A 組MTT 比色法所測(cè)吸光度（A）值為0.402 0 ±0.586 9，B 組為0.466 0 ± 0.479 0，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。損傷后2 h，C、D 組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，存活的神經(jīng)元胞體皺縮、胞膜不清楚，細(xì)胞突起明顯回縮或斷裂。C 組MTT 比色法所測(cè)A 值為0.149 0 ± 0.030 0，D 組為0.184 0 ±0.052 0，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 OECCM 可促進(jìn)正常脊髓神經(jīng)元生長，對(duì)損傷脊髓神經(jīng)元有一定保護(hù)作用，OECs 分泌的促神經(jīng)生長因子是OECs 發(fā)揮脊髓神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制之一。
目的 椎間盤退行性變的生物學(xué)治療方法是骨科學(xué)研究熱點(diǎn)，尋找一種有效誘導(dǎo)BMSCs 向椎間盤細(xì)胞分化的方法成為應(yīng)用細(xì)胞移植治療椎間盤退變的必要前提。探討重組質(zhì)粒 pcDNA3.1IE-SOX9Flag 體外轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)兔BMSCs 向類髓核細(xì)胞分化的影響。 方法 構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1IE-SOX9Flag。取1 月齡新西蘭大白兔骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，體外誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化并鑒定；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記。將第3 代BMSCs 隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-SOX9Flag 重組質(zhì)粒，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1IE-SOX9Flag 轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs，72 h 后加入濃度為500 mg/L 的G418 篩選7 d 后，改為濃度200 mg/L 的G418 維持篩選壓力并培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。取各組BMSCs 采用RT-PCR 檢測(cè)SOX9和Ⅱ型膠原基因（Col2al）的mRNA 表達(dá)，Western blot 檢測(cè)SOX9 蛋白的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色觀察Ⅱ型膠原的表達(dá)。 結(jié)果 BMSCs 成骨誘導(dǎo)7 d 后ALP 染色呈陽性；CD44 表達(dá)陽性，CD34 和CD45 表達(dá)陰性。成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1IE-SOX9Flag。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BMSCs，72 h 后轉(zhuǎn)染效率為34.32% ± 1.75%；轉(zhuǎn)染2 周后BMSCs 形態(tài)改變，呈多角形或橢圓形，細(xì)胞體積增大，增殖速度減緩，與椎間盤髓核細(xì)胞生長特點(diǎn)十分接近。RT-PCR 鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SOX9 mRNA 和Col2al mRNA 表達(dá)陽性，對(duì)照組均為陰性。Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組SOX9 基因蛋白表達(dá)陽性，對(duì)照組未見表達(dá)。轉(zhuǎn)染組BMSCs 的Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性。 結(jié)論 SOX9 基因真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染兔BMSCs，被轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化，為進(jìn)一步研究應(yīng)用BMSCs 移植治療椎間盤退行性變奠定了理論基礎(chǔ)。
【摘 要】 目的 建立兔Perthes 病模型并探討Perthes 病程中股骨頭局部VEGF 表達(dá)的變化及意義。 方 法 3 月齡新西蘭大白兔24 只，體重1.6 ～ 1.8 kg。取16 只兔作為實(shí)驗(yàn)組，手術(shù)切斷左側(cè)圓韌帶和股骨頭支持帶血供，建立兔Perthes 病模型；剩余8 只作為對(duì)照組，按照上述程序左側(cè)股骨頭進(jìn)行手術(shù)，但不打開關(guān)節(jié)囊，保持股骨頭正常血供。于術(shù)后1、2、4、8 周分別處死動(dòng)物，取出股骨頭，行大體觀察、X 線片、組織學(xué)、VEGF 免疫組織化學(xué)染色和VEGF mRNA 原位雜交觀察。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型均制備成功，術(shù)后5 d 感染1 例，退出實(shí)驗(yàn)。大體觀察：對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)股骨頭未見壞死改變；實(shí)驗(yàn)組股骨頭隨時(shí)間延長逐漸粗糙、失去光澤，變小，可見塌陷。X 線片觀察：術(shù)后1、2 周，兩組股骨頭無明顯差異；4、8 周，實(shí)驗(yàn)組股骨頭較對(duì)照組密度增高。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)HE 染色均未見股骨頭壞死及修復(fù)改變；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4、8 周可見血管及肉芽組織侵入，新骨形成，參與修復(fù)。免疫組織化學(xué)：對(duì)照組股骨頭骺軟骨中，肥大區(qū)表現(xiàn)出較高的VEGF免疫反應(yīng)性（VEGF immunoreactivity，VEGF-IR），而增殖區(qū)VEGF-IR 卻表現(xiàn)較低水平。術(shù)后1 周，實(shí)驗(yàn)組股骨頭增殖區(qū)VEGF 陽性細(xì)胞率開始高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組股骨頭肥大區(qū)VEGF 陽性細(xì)胞率明顯減少。術(shù)后8 周，實(shí)驗(yàn)組股骨頭整個(gè)骺軟骨區(qū)均表現(xiàn)VEGF-IR，增殖區(qū)VEGF 陽性細(xì)胞率較對(duì)照組明顯增加；壞死股骨頭軟骨內(nèi)骨化中心修復(fù)重建，肥大區(qū)VEGF陽性細(xì)胞率較正常接近。術(shù)后1、2、4、8 周，實(shí)驗(yàn)組骺軟骨增殖區(qū)VEGF 陽性細(xì)胞率與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt;0.01） ；術(shù)后1、2、4 周，實(shí)驗(yàn)組骺軟骨肥大區(qū)VEGF 陽性細(xì)胞率與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。原位雜交觀察結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色觀察相似。缺血性壞死后，實(shí)驗(yàn)組肥大區(qū)VEGF mRNA 表達(dá)喪失，增殖區(qū)VEGF mRNA 表達(dá)升高。軟骨內(nèi)骨化中心修復(fù)重建后，實(shí)驗(yàn)組可見新形成的肥大區(qū)重新表達(dá)VEGF mRNA。 結(jié)論 VEGF 在壞死股骨頭骺軟骨促進(jìn)血管發(fā)生、軟骨內(nèi)骨化中心的修復(fù)重建方面起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。