目的 構(gòu)建人白細胞介素(human interleukin, hIL)-10和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)雙表達腺病毒載體,觀察目的基因在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的表達。方法 以T載體(pUCm-T/hIL-10 cDNA)為模板,PCR擴增hIL-10 cDNA,連入穿梭質(zhì)粒,〖JP2〗卡那霉素抗性篩選,Not Ⅰ、Xhol Ⅰ酶切鑒定,測序,局部序列搜索工具(BLAST)分析序列正確,Pme Ⅰ 酶切,電穿孔單獨轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1,轉(zhuǎn)化XL10-Gold擴增,PacⅠ酶切,AD-293細胞包裝,PCR鑒定,測定病毒滴度,脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染VSMCs,熒光顯微鏡下觀察GFP的表達,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中hIL-10的含量。結(jié)果 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確,同源重組后PacⅠ酶切獲得30 kb和3 kb片段,重組病毒滴度為3×1010 efu/ml,PCR檢測含目的基因,轉(zhuǎn)染的VSMCs可見綠色熒光,hIL-10含量為25 ng/106個細胞。結(jié)論 構(gòu)建的雙表達載體于VSMCs成功表達,為血管內(nèi)膜增生的基因治療打下基礎(chǔ)。