四川大學華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室/腎病研究室邵振華研究員團隊于2019年11月在“Nature Chemical Biology”（影響因子12.15）發(fā)表文章"Structure of an allosteric modulator bound to the CB1 cannabinoid receptor"（長按下方二維碼即可閱讀全文）。
大麻素受體CB1屬于GPCR（G蛋白偶聯受體）Class A類家族，在人類神經系統(tǒng)中高度表達，大麻素類藥物通過激活該類受體進而調節(jié)體內的生理反應。CB1受體主要分布于中樞神經系統(tǒng)中，是疼痛、癲癇、肥胖癥、抑郁癥、肝纖維化或多發(fā)性硬化癥的治療靶點。CB1的激動劑和拮抗劑配體識別受體的正位位點，分別調節(jié)信號通路的開和關。除了正位配體外（激動劑和拮抗劑），其別構調節(jié)劑不僅影響大麻素類激動劑的結合，而且同樣具有調節(jié)信號轉導的能力。理解別構調節(jié)劑的分子機制將有助于我們更好地理解GPCR信號轉導的復雜機理。
CB1的別構調控分子最早在2005年由Price等人報道。他們發(fā)現化合物ORG27569不僅能增強CB1的正向激動劑CP55940的結合，更有趣的是，該化合物抑制了下游Gi 蛋白的信號途徑。為了更好地理解ORG27569作為CB1受體負向別構調節(jié)劑（NAM）的分子機理，我們用X射線晶體學的方法解析了CB1受體-激動劑CP55940-ORG27569三元復合物的三維結構，為該類受體的新型藥物開發(fā)和篩選提供了新的思路。
圖1 CB1配體的二維結構 （a）THC，（b）CBD，（c）CP55940和（d）ORG27569
從我們獲得的CB1與激動劑和NAM的三元復合物整體結構來看，CP55940占據正位結合位點，而ORG27569結合至膜內的螺旋外位點（圖2a，b），主要與受體的TM4互作，并且沿著面向脂質的疏水表面延伸以接觸TM2（圖2b）。CB1在G蛋白結合位點處于非活性構象（圖2c），TM5和TM6向核心區(qū)域位移，從而導致識別和結合G蛋白的區(qū)域大幅度減少。這就解釋了CB1受體在激動劑作用下，ORG27569抑制Gi信號通路的原因。
圖2 CB1結合CP55940和ORG27569的整體結構 （a）從膜平面內觀看，CB1（藍色）。 紅色球形為CP55940激動劑，黃色球形結構為ORG27569。（b）CB1的靜電表面圖。（c）膜的細胞內側觀察視角
CB1受體中的兩個芳香環(huán)殘基（F2003.36和W3566.48）構象變化決定了受體的激活與否，被稱為該受體的雙撥動開關。在具有ORG27569和CP55940的復合物中，雙撥動開關采用的無效'off'構型（圖3a），類似于在taranabant（反向激動劑）識別的結構，兩個殘基形成π-π疏水作用，將受體TM3和TM6鎖定在類似失活的構象。與激動劑結構（圖3b）和激動劑-Gi復合物（圖3c）形成對比，其中F2003.36側鏈從TM5旋轉140°并與TM2接觸。這種變化伴隨著另一個扳動開關殘基W3566.48遠離激動劑的運動，伴隨著TM6的向外運動，兩個殘基間的作用力被破壞，使其受體處于激活構象（圖3b，c）。總之，在我們的研究中，發(fā)現ORG27569和CP55940結合的CB1三元復合物處于一種中間構象，在該構象中，正位口袋在活動狀態(tài)下會收縮以適合激動劑（圖3b）；然而，撥動開關未觸發(fā)（圖3a），阻礙了TM6的移動。進一步在結構基礎上揭示了別構調節(jié)劑對CB1受體的調節(jié)作用。
圖3 CB1受體在不同狀態(tài)下的雙撥動開關（F2003.36和W3566.48）（a）CP55940 / ORG27569結合的CB1和taranabant結合的CB1的疊加（PDB 5U09）。（b）CP55940 / ORG27569結合的CB1和AM11542結合的CB1（PDB 5XRA）的疊加。（c）CP55940 / ORG27569結合的CB1和Fubinaca / Gibound的CB1（PDB 6N4B）的疊加
最重要的是，我們在研究中發(fā)現了一個全新的GPCR別構調節(jié)位點，這與之前發(fā)現的GPCR別構調節(jié)位點不同。ORG27569的氯吲哚基團緊靠W2414.50的吲哚側鏈，而酰胺鍵聯的哌啶基苯基鏈則延伸穿過受體外部，緊靠T2424.51和I2454.54（圖4a）。W2414.50殘基是A類GPCR中最保守的殘基之一（圖4c），該位點為GPCR別構調節(jié)位點和藥物設計提供了依據和結構基礎。
圖４ 別構調節(jié)劑ORG27569與CB1受體識別細節(jié) （a）ORG27569配體（黃色）在4.5?以內的接觸殘基（藍色）。（b）與激動劑結合的CB1（PDB 5XRA）與膽固醇在同一口袋的等效位點。（c）來自不同A類GPCR的TM4的多序列比對，顯示色氨酸（W）在4.50位保守。（d）在ORG27569結合位點上，CP55940結合的CB1（藍色）、Taranabant結合的CB1（PDB 5U09，灰色）和Fubinaca結合的CB1（PDB 6N4B，橙色）的結構重疊
總之，該論文解釋了ORG27569作為CB1受體負向別構調節(jié)劑的分子機制，為理解CB1受體的作用機理打開了新的“一扇窗”，同時為該類受體的新型藥物開發(fā)和篩選提供了新的思路。
專家點評
楊勝勇教授：大麻作為藥用價值已有幾千年的歷史，主要通過作用到大麻素受體進而調節(jié)體內信號轉導途徑，達到疾病治療的目的。人體內源大麻素受體有CB1和CB2兩種。其中， CB1受體主要位于腦、脊髓與外周神經系統(tǒng)中，具有GPCR經典的7次跨膜螺旋結構，被稱中樞型大麻素受體。CB1的激活可以降低神經遞質的釋放，如多巴胺和GABA，從而調節(jié)人體的新陳代謝、食欲、疼痛、記憶和學習、神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等諸多方面。因此，CB1受體是疼痛、肥胖、藥物成癮和神經退行性等疾病的直接藥物靶標。目前針對該受體的上市藥物主要來自于植物大麻的天然提取物。相對于天然產物，目前化學合成類的CB1靶向藥物副作用較大，高效低毒的藥物發(fā)展較慢，主要原因是CB1受體介導的信號轉導非常復雜，人們尚未完全闡明其調控機制，因而限制了創(chuàng)新藥物的研發(fā)。
此前的研究表明CB1具有高度保守的正位結合口袋，為結構導向的藥物設計帶來了一些困擾，導致傳統(tǒng)藥物具有較低的選擇性和特異性，副作用較高。有趣的是，CB1 受體也被發(fā)現存在別構調節(jié)位點，且與激動劑配體協同效應，更好地調控信號轉導，也表現出疾病治療的潛力。相比于保守的正位結合位點，GPCR的別構調節(jié)位點具有一定的優(yōu)勢：1.亞型的選擇性和特異性；2. 與正位配體協同作用調節(jié)GPCR信號轉導，因此更適合靶向設計和發(fā)展藥物。
近期，邵振華研究員與合作者通過解析CB1受體與負向別構調節(jié)劑的三維結構，發(fā)現了CB1受體中新的負向別構調節(jié)劑識別位點，這與之前發(fā)現的GPCR別構調節(jié)位點不同。GPCR家族別構調節(jié)位點的多變性和非保守性的特點，為設計高選擇性的潛在藥物提供了新的策略，尤其在受體多種亞型間。該論文一方面有助于我們更系統(tǒng)地了解CB1受體的信號轉導機制；更重要的是，別構調節(jié)劑與激動劑的協同效應為CB1受體的藥物開發(fā)也提供了新的思路，應用前景廣泛。
楊勝勇，博士、四川大學華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室教授，教育部長江學者、國家杰出青年科學基金獲得者、百千萬人才工程國家級人選、教育部創(chuàng)新團隊帶頭人。分別于1990年、1993年和1999年在四川大學獲學士、碩士和博士學位。1999-2001年，香港科技大學化學系博士后。2002-2005年，加拿大Calgary大學Research Scientist。2005年10月至今，四川大學生物治療國家重點實驗室工作。主要從事小分子靶向藥物研究。至今已在本領域頂級或重要刊物發(fā)表SCI論文260余篇。申請專利80余項，獲授權專利30余項，包括12項國際專利。研發(fā)的6個候選新藥已轉讓到國內大型制藥公司，其中兩個已進入臨床試驗。以第一完成人獲國家自然科學二等獎、教育部自然科學一等獎、藥明康德生命化學研究學者獎等。
作者投稿心得
大麻素受體是我們一直研究的對象，我們曾在2016年解析了大麻素受體CB1與拮抗劑藥物的晶體結構（Shao Z., et al Nature. 2016），該研究進一步拓展了科學界對CB1受體的認識。投稿過程比較順利，在初期，我們是以letter的形式投稿和送審，后來得到了雜志編輯和審稿人的高度評價，編輯要求終稿以研究長文（Articles）的形式發(fā)表，此外，編輯把該論文故事作為雜志封面（cover image）的候選，但沒有入選。帶著這點小遺憾，同時作為勉勵，我們課題組將繼續(xù)探索大麻素等受體的作用機理和藥物開發(fā)。
第一作者
邵振華，博士，四川大學華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室/腎病研究室研究員。研究方向是重要藥物靶標G蛋白偶聯受體（GPCR）的結構藥理學。GPCR家族是人類中最大的膜蛋白受體家族,是很多藥物的重要靶點，目前，約50%的上市藥物直接作用于GPCR。課題組綜合運用冷凍電鏡技術（Cryo-EM）、X-射線晶體學、及藥理學等技術手段研究GPCR的結構與藥物開發(fā)，為疾病治療提供新思路。近年來先后在Nature、Nature Chemical Biology等國際高水平學術期刊發(fā)表論文。目前承擔了科技部重點專項“蛋白質機器與生命過程調控”及國家自然科學基金等項目，并入選國家“千人計劃”青年項目、四川省“千人計劃”青年項目。
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本文編輯：汪文靜
本文排版：陳紅梅 張洪雪