四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室陳俐娟研究員團(tuán)隊(duì)2016年6月發(fā)表于Nature Communications的文章"Pironetin reacts covalently with cysteine-316 of a-tubulin to destabilize microtubule"（影響因子：12.353）（長(zhǎng)按下方二維碼即可閱讀原文）。

微管（Microtubule）是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。微管是“細(xì)胞骨架”的主要成分之一，在許多細(xì)胞重要事件中起著關(guān)鍵作用。微管是由α-和β-微管蛋白(Tubulin)異二聚體可逆地組裝而成的線(xiàn)性管裝結(jié)構(gòu)（圖 1a）。

圖1　微管和微管蛋白的結(jié)構(gòu)。（a）微管蛋白二聚體從頭到尾排列形成微管，其構(gòu)象由彎曲變直，二聚體之間同時(shí)縱向和橫向接觸。（b-e）微管與已知 5 個(gè)位點(diǎn)之間的相互結(jié)合圖：（b）長(zhǎng)春堿和秋水仙堿結(jié)合于 β-tubulin 的具體位點(diǎn)；（c）微管聚合劑Laulimalide 在 β-tubulin 上的結(jié)合位點(diǎn)；（d）微管抑制劑美登木素在 β-tubulin 上的結(jié)合位點(diǎn)；（e）微管聚合劑在 β-tubulin 上的結(jié)合位點(diǎn)。蛋白由 cartoon 形式表示，小分子用球形模式表示

天然產(chǎn)物長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、紫杉醇、laulimalide 和美登素都與 β-微管蛋白結(jié)合并干擾其正常動(dòng)力學(xué)過(guò)程從而抑制微管蛋白的聚合或解聚：長(zhǎng)春堿、秋水仙堿和美登素抑制微管蛋白異二聚體聚合形成微管，而紫杉醇和 laulimalide 促進(jìn)聚合和穩(wěn)定微管。結(jié)構(gòu)生物學(xué)詳細(xì)描述了這五種天然化合物如何結(jié)合并改變 β-微管蛋白的構(gòu)象從而改變微管和微管之間的動(dòng)力學(xué)特征（如圖 1b-e）。 這些工作使得新一代理性設(shè)計(jì)微管抑制劑成為可能，極大地有助于微管藥物的開(kāi)發(fā)。紫杉醇代表了最成功的一類(lèi)在臨床使用的抗腫瘤藥物，目前其全球銷(xiāo)售額已經(jīng)超過(guò)300億美元。但是，在病人進(jìn)行治療時(shí)， βIII-微管蛋白的表達(dá)會(huì)增加，這種微管蛋白與紫杉醇的結(jié)合很弱，這種突變的微管蛋白能夠抵抗紫杉醇的治療從而產(chǎn)生耐藥性。

Pironetin是一個(gè)天然小分子，是目前報(bào)道的唯一與α-微管蛋白相互作用的小分子。其展示了良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性，同時(shí)在多藥耐藥細(xì)胞上同樣有效。日本的研究人員通過(guò)詳盡的實(shí)驗(yàn)方法證明Pironetin結(jié)合于α-微管蛋白的352位賴(lài)氨酸。在他們的研究中明確說(shuō)明了Pironetin不會(huì)與半胱氨酸結(jié)合。但不幸的是，基于 K352 的Pironetin結(jié)合模型給Pironetin衍生物的設(shè)計(jì)帶來(lái)了困難，多數(shù)研究都顯示，改造以后Pironetin活性明顯下降。因此，鑒于 Pironetin衍生物的修飾合成沒(méi)有取得進(jìn)展, Piroentin 衍生物的設(shè)計(jì)就此被擱置了。但是，開(kāi)發(fā)靶向 α-微管蛋白的藥物仍然具有巨大開(kāi)發(fā)價(jià)值。這種新型的靶向α-微管蛋白的藥物很可能不受 β-微管蛋白的突變及 βIII-微管蛋白的高表達(dá)所影響，從而其在耐藥細(xì)胞上也會(huì)有效。四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室陳俐娟課題組一直從事抗微管藥物研發(fā)，為了推進(jìn)靶向 α-tubulin 抑制劑的開(kāi)發(fā),該課題組對(duì)Pironetin與微管蛋白的相互作用進(jìn)行深入的研究，獲得了與之前的研究完全不同的結(jié)果。通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)及質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Pironetin 確實(shí)是結(jié)合在α-微管蛋白上，但是其共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)為 316 位半胱氨酸，而不是 352 位賴(lài)氨酸（圖2）。

圖2　微管蛋白-RB3-TTL-Pironetin復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。（a）Pironetin-微管蛋白-RB3-TTL的結(jié)構(gòu)。（b）Pironetin在α-微管蛋白單體的口袋中的近視圖。 （c）Pironetin結(jié)合口袋表面的橫截面圖

同時(shí)通過(guò)生物質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)了Pironetin結(jié)合于α-微管蛋白的316位半胱氨酸。如圖3所示，該肽段的二級(jí)質(zhì)譜碎片顯示Pironetin結(jié)合于 Cys316。

圖3　α-微管蛋白的Pironetin共價(jià)修飾的肽段的MS / MS二級(jí)碎裂質(zhì)譜圖

在總體水平上，Pironetin與α2-微管蛋白亞基的結(jié)合導(dǎo)致了 α1β1 異二聚體相對(duì)于α2β2異二聚體之間約2°的旋轉(zhuǎn)（圖4a）。在二級(jí)結(jié)構(gòu)層面造成了明顯的T7 loop環(huán)的偏移（殘基Phe244至Leu259的變化）：Val250的Cα原子移動(dòng)超過(guò)11?，而 Leu252和Gly246已經(jīng)分別偏移了6?和8?（圖 4b）。為了適應(yīng) Pironetin的結(jié)合，Cys316兩側(cè)的殘鏈S8不同側(cè)鏈都有小的位移（圖4c）。Glu254在空白結(jié)構(gòu)中是關(guān)鍵的催化殘基，Glu254與水分子結(jié)合，水分子又與鄰近的 β1-微管蛋白的 Mg²⁺離子結(jié)合（圖4c），而 Mg²⁺ 離子又與 GDP 的磷酸鹽接觸，從而調(diào)控GTP水解。Pironetin導(dǎo)致的Glu254位置的偏移所造成的β-微管蛋白的GTPase活性降低（圖 4c-d）可能是另外的Pironetin抑制微管聚合的機(jī)制。至此作者詳細(xì)地解釋了Pironetin與α-微管蛋白的相互作用，為后續(xù)開(kāi)發(fā)靶向α-微管蛋白的藥物奠定了基礎(chǔ)。

圖4　Pironetin結(jié)合導(dǎo)致微管結(jié)構(gòu)的變化。（a）apo形式和與Pironetin結(jié)合的復(fù)合物中的微管蛋白結(jié)構(gòu)的比較。（b）apo蛋白形式（藍(lán)色）和復(fù)合物形式蛋白中（綠色）H8的主要主鏈變化。（c）α-微管蛋白的催化殘基E254與銜接頭結(jié)合上的F255一起重新定向。（d）Pironetin抑制微管蛋白的GTPase活性，與長(zhǎng)春堿類(lèi)似，與秋水仙堿相反

程偉教授：微管是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，臨床上市的藥物如紫杉醇，長(zhǎng)春堿及艾日布林等均靶向β-微管蛋白，但β-微管蛋白容易突變而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。相對(duì)而言，α-微管蛋白不易突變，是一個(gè)更好的抗腫瘤靶蛋白。因此開(kāi)發(fā)靶向 α-微管蛋白的抗腫瘤藥物具有重要的研究?jī)r(jià)值。但目前為止僅有一個(gè)天然小分子Pironetin被報(bào)道共價(jià)結(jié)合于 α-微管蛋白。但是其結(jié)合位點(diǎn)等相關(guān)機(jī)制仍然不清楚。陳俐娟研究員課題組長(zhǎng)期致力于抗腫瘤微管蛋白抑制劑的研究，成功解析了Pironetin-微管蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了Pironetin的結(jié)合位點(diǎn)為α-微管蛋白的316位半胱氨酸，成功解釋了Pironetin的作用機(jī)制。他們報(bào)道了一個(gè)全新的靶向α-微管蛋白的小分子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于后續(xù)開(kāi)發(fā)靶向α-微管蛋白的新型微管抑制劑具有重要意義。

本文編輯：張　敏

本文排版：陳紅梅　張洪雪