目的 構(gòu)建攜帶hVEGF165 基因的重組腺病毒載體pAdxsi- 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-hVEGF165 ，體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，觀察轉(zhuǎn)染后hVEGF165 的表達(dá)情況以及對BMSCs 生長增殖的影響，為進(jìn)行血管再生的基因治療奠定實驗基礎(chǔ)。 方法 將hVEGF165 從原始質(zhì)粒切下連接到pShuttle- 巨細(xì)胞病毒-EGFP 重組穿梭載體，并轉(zhuǎn)移至pAdxsi 載體上，獲得重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165 ，進(jìn)行酶切鑒定及基因測序。采用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165 ，并轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293，收獲重組腺病毒，測定病毒滴度。貼壁法培養(yǎng)Wistar 大鼠BMSCs，體外轉(zhuǎn)染攜帶EGFP 基因的重組腺病毒（pAdxsi-EGFP），熒光倒置相差顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)確定最佳病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）。依據(jù)最佳MOI 轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFP-hVEGF165 至BMSCs，采用Western blot、RT-PCR 及ELISA 法檢測轉(zhuǎn)染后hVEGF165 的表達(dá)；MTT 法評價轉(zhuǎn)染后BMSCs 生長增殖情況。 結(jié)果 酶切鑒定及基因測序提示重組腺病毒載體質(zhì)粒含有hVEGF165 cDNA；經(jīng)多輪感染、擴(kuò)增后，病毒滴度可達(dá)1 × 1010 pfu/mL。熒光倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFP 后MOI 為150 pfu/cell 時轉(zhuǎn)染效果最佳，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率約88%。Western blot 和RT-PCR 檢測示，pAdxsi-EGFP-hVEGF165 轉(zhuǎn)染BMSCs 48 h 后在蛋白質(zhì)和基因水平均可有效表達(dá)hVEGF165 ；ELISA 檢測示其含量在7 d 達(dá)高峰，在20 d 時仍有表達(dá)，1、3、5、7、9、11、13、15、20 d 各時間點hVEGF165 含量均顯著高于EGFP 基因轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組（P lt; 0.05）。MTT 結(jié)果顯示，各時間點轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFPhVEGF165的BMSCs 與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的吸光度（A）值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 BMSCs 是一種較理想的基因載體細(xì)胞，成功制備的重組腺病毒載體質(zhì)?？稍贛OI 值為150 時將hVEGF165 基因有效轉(zhuǎn)染至BMSCs；轉(zhuǎn)染后hVEGF165 表達(dá)水平較高、持續(xù)時間較長，且對BMSCs 的生長增殖無明顯影響。