目的 構(gòu)建hBMP-7 基因真核表達(dá)載體，觀察其在兔脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的表達(dá)，并觀察其對ADSCs 向成骨細(xì)胞分化的影響。 方法 3 月齡清潔級健康日本大耳白兔，雌雄不限，體重3 ～ 4 kg。取兔皮下脂肪約5 mL，采用膠原酶消化離心貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng) ADSCs，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行實驗；CD44、CD49d、CD106 免疫熒光染色鑒定ADSCs。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hBMP-7，經(jīng)鑒定后利用LipofectamineTM 2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染ADSCs，免疫組織化學(xué)染色檢測hBMP-7 在ADSCs 中的表達(dá)；ALP 定量測定、Ⅰ型膠原免疫熒光檢測hBMP-7 基因轉(zhuǎn)染對ADSCs 向成骨細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察示ADSCs 呈梭形、多角形分布；表面抗原標(biāo)志CD44、CD49d 呈陽性表達(dá)，CD106 呈陰性表達(dá)。成功構(gòu)建pcDNA3.1-hBMP-7 真核表達(dá)載體，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法成功導(dǎo)入ADSCs 中，免疫組織化學(xué)染色提示hBMP-7 能在ADSCs 中表達(dá)。ALP 定量測定示，轉(zhuǎn)染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7 轉(zhuǎn)染組（實驗組）ALP 活性明顯高于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染組（對照組），差異有統(tǒng)計意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后7、14 d，實驗組Ⅰ型膠原表達(dá)量均高于對照組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hBMP-7 可在兔ADSCs中表達(dá)，且轉(zhuǎn)染后的ADSCs ALP 定量測定、成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原的表達(dá)均高于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為開展以干細(xì)胞為載體的局部基因治療奠定了基礎(chǔ)。
目的 通過體外實驗探討hVEGF165 和hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adenoassociated virus，rAAV）體外生物學(xué)活性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 分別采用rAAVhVEGF165-內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實驗組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的rAAV-IRES-GFP（對照組）轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，于轉(zhuǎn)染后1、2、3、7 及14 d 應(yīng)用ELISA 法及轉(zhuǎn)染后14 d 應(yīng)用Western blot 法鑒定兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)；轉(zhuǎn)染后14 d 行細(xì)胞免疫熒光染色觀察hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)一致性。應(yīng)用第3 代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）管狀血管形成實驗檢測hVEGF165 蛋白活性。取第3 代BMSCs 行誘導(dǎo)成骨實驗，Gomori 鈣鈷法ALP 染色及茜素紅法鈣鹽染色檢測hBMP-7 蛋白活性。 結(jié)果 ELISA 檢測示隨轉(zhuǎn)染時間延長，兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)逐漸升高；實驗組各時間點hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)量均明顯高于對照組（P lt; 0.05）。Western blot 檢測示實驗組可見hVEGF165 和hBMP-7表達(dá)，對照組未見陽性表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色觀察示實驗組hVEGF165 和hBMP-7 染色呈陽性，表達(dá)部位和強度具有較好一致性；對照組未見陽性表達(dá)。HUVEC 管狀血管形成實驗示實驗組HUVEC 拉長變形、出芽且相互交聯(lián)成管狀樣結(jié)構(gòu)；與對照組相比，管狀血管數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。ALP 染色見實驗組細(xì)胞出現(xiàn)深染顆粒，對照組細(xì)胞內(nèi)淺著色；與對照組相比，礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7體外具有良好的生物學(xué)活性。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adeno-associated virus，rAAV）介導(dǎo)基因表達(dá)的時效性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用熒光細(xì)胞計數(shù)法測定rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs 的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。分別采用rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實驗組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記平行對照rAAV-IRES-GFP（對照組）在最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)條件下轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs。于不同時間點分別行GFP 表達(dá)檢測、RT-PCR 檢測、Western blot 檢測明確rAAV 體外介導(dǎo)基因表達(dá)的時效性關(guān)系。將實驗組及對照組病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs 以5 × 106 個/ mL 密度，分別注射至9 只2 月齡純種雄性新西蘭大耳白兔制備的肌袋模型內(nèi)各1 mL（實驗組1 及對照組1），于不同時間點分別行GFP表達(dá)檢測、Western blot 檢測及ELISA 檢測明確rAAV 體內(nèi)介導(dǎo)基因表達(dá)的時效性關(guān)系。 結(jié) 果 rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為5 × 104 v.g/cell。通過體外檢測顯示rAAV 轉(zhuǎn)染BMSCs 后1 d 即有目的基因表達(dá)，14 d 時表達(dá)強度明顯增強，至28 d 時仍維持較強表達(dá)。通過體內(nèi)檢測顯示體內(nèi)轉(zhuǎn)染2 周可檢測到目的基因表達(dá)，6 周時表達(dá)強 度增強，8 周時仍維持較高水平。ELISA 法檢測實驗組1 細(xì)胞培養(yǎng)上清中hVEGF165 和hBMP-7 含量分別為（248.67 ± 75.58）pg/mL 和（4.80 ± 0.61） ng/ mL， 對照組1 分別為（32.28 ± 8.42）pg/mL 和（0.64 ± 0.42）ng/mL，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 具有較好的轉(zhuǎn)染時效性。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的活性，為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head，ANFH）的AAV 基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 取體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，分別采用以下4 種病毒轉(zhuǎn)染并分為4 組：rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）-hBMP-7（A 組）、rAAV-hVEGF165- 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（B 組）、rAAV- hBMP-7-GFP（C 組）及rAAV-IRES-GFP（D 組）。取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作后肢缺血模型，并隨機分為4 組（n=6），于股骨肌肉內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用超聲影像學(xué)檢測兔后肢脛前動脈血流量，行CD34 免疫組織化學(xué)染色檢測微血管生成。另取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作股骨肌袋模型，并隨機分為4 組（n=6），于肌袋內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用X 線片檢測兔后肢原位骨化，行von Kossa 鈣鹽染色檢測肌肉組織成骨礦化。 結(jié)果 病毒注射后動物未出現(xiàn)局部或全身毒性反應(yīng)。病毒注射后8 周，A 組兔后肢脛前動脈血流百分比及CD34 陽性微血管數(shù)均高于其他3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；B 組高于C、D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。病毒注射后8 周，A、C 組兔后肢肌袋內(nèi)出現(xiàn)可被X 線檢測到的原位骨化，von Kossa 肌肉組織鈣鹽染色可見大量鈣鹽沉積，且A 組原位骨化及鈣鹽沉積程度均較C 組強；B 組及D 組均未見明顯原位骨化及鈣鹽沉積形成。 結(jié)論 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 載體具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的生物學(xué)活性。