目的構(gòu)建DPC4基因重組質(zhì)粒以研究DPC4對人胰腺癌細(xì)胞的抑制作用。方法應(yīng)用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增出野生型DPC4基因全長cDNA，然后用分子克隆技術(shù)構(gòu)建其真核表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體法將DPC4基因?qū)氲饺艘认侔㏄C3細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選獲得可穩(wěn)定表達(dá)DPC4的人胰腺癌細(xì)胞，觀察DPC4基因?qū)θ艘认侔┘?xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果獲得了野生型DPC4真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1DPC4，野生型DPC4的導(dǎo)入可引起胰腺癌G1期細(xì)胞的增加和S期細(xì)胞相應(yīng)減少，同時抑制細(xì)胞生長。結(jié)論野生型DPC4基因具有調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞增殖的功能，可作為胰腺癌基因治療的靶基因。
目的 研究角蛋白17（keratin 17，K-17）對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響，了解K-17 在血管生成過程中的作用。 方法 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法向HUVEC 中分別加入K-17- 小分子干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）- 轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）混合液（實驗組）、siRNA- 轉(zhuǎn)染試劑混合液（陰性對照組），使siRNA 終濃度為50 nmol/L；對照組加相同體積僅含載體（脂質(zhì)體Lipofectamine 2000）的培養(yǎng)基，采用RT-PCR 和Western blot 法檢測K-17-siRNA 沉默效果。于培養(yǎng)后36 h 采用細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖能力；培養(yǎng)后30 h，分別采用24 孔板Millicell小室檢測細(xì)胞遷移能力以及膠原纖維凝膠實驗法檢測細(xì)胞分化成管能力。另取未經(jīng)siRNA 處理的HUVEC 分別在含10%FBS 的培養(yǎng)基（A 組）、含2%FBS 的培養(yǎng)基（B 組）和含2%FBS 及10 ng/mL bFGF 的培養(yǎng)基（C 組）中培養(yǎng)24 h，檢測HUVEC K-17 的表達(dá)。 結(jié)果 實驗組K-17-siRNA 作用于HUVEC 30 h 后，RT-PCR 檢測示細(xì)胞內(nèi)K-17 mRNA 的表達(dá)為0.09 ± 0.01，較陰性對照組0.35 ± 0.07 和對照組0.34 ± 0.06 均降低了約74%（P lt; 0.01）；Western blot 檢測示實驗組K-17-siRNA 作用于HUVEC 30 h 后，細(xì)胞內(nèi)K-17 蛋白表達(dá)為0.19 ± 0.01，較陰性對照組0.52 ± 0.01 和對照組0.55 ± 0.02分別降低了63% 和65%（P lt; 0.01）；陰性對照組和對照組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。K-17-siRNA 作用HUVEC 36 h 后，實驗組細(xì)胞增殖能力與陰性對照組和對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。HUVEC 轉(zhuǎn)染K-17-siRNA 30 h 后，實驗組HUVEC 24 h 穿過Millicell 小室上室膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)為（3 719.0 ± 319.0）個，明顯低于陰性對照組（7 356.3 ± 795.7）個和對照組（7 437.5 ± 212.0）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01），陰性對照組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。實驗組、陰性對照組和對照組HUVEC 24 h 分化形成的管數(shù)分別為（1.1 ± 0.5）、（3.6 ± 0.5）和（3.2 ±0.6）管/ 視野，實驗組與陰性對照組、對照組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01），陰性對照組和對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。A、B、C 組HUVEC K-17 的表達(dá)分別為0.25 ± 0.02、0.08 ± 0.01 和0.72 ± 0.03，3 組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 K-17 對HUVEC 增殖無影響，但增強(qiáng)其遷移能力，有利于血管生成。