目的 椎間盤退行性變的生物學治療方法是骨科學研究熱點，尋找一種有效誘導BMSCs 向椎間盤細胞分化的方法成為應用細胞移植治療椎間盤退變的必要前提。探討重組質(zhì)粒 pcDNA3.1IE-SOX9Flag 體外轉(zhuǎn)染誘導兔BMSCs 向類髓核細胞分化的影響。 方法 構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1IE-SOX9Flag。取1 月齡新西蘭大白兔骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，體外誘導BMSCs 向成骨細胞分化并鑒定；流式細胞儀檢測細胞表面標記。將第3 代BMSCs 隨機分為轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1IE-SOX9Flag 重組質(zhì)粒，陰性對照組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1，空白對照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1IE-SOX9Flag 轉(zhuǎn)染第3 代BMSCs，72 h 后加入濃度為500 mg/L 的G418 篩選7 d 后，改為濃度200 mg/L 的G418 維持篩選壓力并培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞。取各組BMSCs 采用RT-PCR 檢測SOX9和Ⅱ型膠原基因（Col2al）的mRNA 表達，Western blot 檢測SOX9 蛋白的表達，免疫組織化學染色觀察Ⅱ型膠原的表達。 結(jié)果 BMSCs 成骨誘導7 d 后ALP 染色呈陽性；CD44 表達陽性，CD34 和CD45 表達陰性。成功構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1IE-SOX9Flag。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BMSCs，72 h 后轉(zhuǎn)染效率為34.32% ± 1.75%；轉(zhuǎn)染2 周后BMSCs 形態(tài)改變，呈多角形或橢圓形，細胞體積增大，增殖速度減緩，與椎間盤髓核細胞生長特點十分接近。RT-PCR 鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細胞SOX9 mRNA 和Col2al mRNA 表達陽性，對照組均為陰性。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組SOX9 基因蛋白表達陽性，對照組未見表達。轉(zhuǎn)染組BMSCs 的Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陽性。 結(jié)論 SOX9 基因真核表達載體成功轉(zhuǎn)染兔BMSCs，被轉(zhuǎn)染的干細胞向類髓核細胞分化，為進一步研究應用BMSCs 移植治療椎間盤退行性變奠定了理論基礎(chǔ)。
目的 髓核細胞衰老凋亡是椎間盤退行性變的病理基礎(chǔ)，探討髓核細胞表型分子及延緩髓核細胞衰老退變的機制。 方法 原代培養(yǎng)8 ～ 10 周齡雄性SD 大鼠髓核細胞，免疫細胞化學染色鑒定髓核細胞表型分子低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、HIF-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）及Ⅱ型膠原表達。小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）瞬時轉(zhuǎn)染髓核細胞沉默p53、p21 后行RT-PCR 及Western blot檢測沉默效率，siRNA 轉(zhuǎn)染前后細胞衰老相關(guān)β 半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal）染色檢測髓核細胞衰老變化，流式細胞儀檢測髓核細胞周期變化，MTT 法生長曲線分析髓核細胞增殖變化。 結(jié)果 免疫細胞化學染色顯示髓核細胞表達HIF-1α、HIF-1β、MMP-2 及Ⅱ型膠原。第35 代髓核細胞轉(zhuǎn)染p53、p21 siRNA 后RT-PCR 及Western blot 檢測示p53、p21 表達明顯受到抑制。第35 代髓核細胞SA-β-gal 染色陽性率明顯高于第1 代髓核細胞（P lt; 0.001）；正常第35 代髓核細胞經(jīng)p53 siRNA（p53 轉(zhuǎn)染組）和p21 siRNA（p21 轉(zhuǎn)染組）轉(zhuǎn)染后，SA-β-gal 陽性率明顯低于正常第35 代髓核細胞（正常組）和加入脂質(zhì)體LipofectaminTM 2000 而無siRNA 的第35 代髓核細胞（陰性對照組），差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.001）。細胞周期分析顯示，p53 轉(zhuǎn)染組及p21 轉(zhuǎn)染組G1 期百分比均明顯低于正常組和陰性對照組（P lt; 0.05），S 期百分比明顯高于正常組和陰性對照組（P lt; 0.05）。MTT 生長曲線顯示轉(zhuǎn)染p53、p21 siRNA 后可促進髓核細胞增殖。 結(jié)論 沉默p53、p21 基因可通過調(diào)節(jié)細胞周期而抑制髓核細胞衰老退變，改善椎間盤退變過程；沉默p53、p21基因可能是潛在的治療椎間盤退行性變的方法。