目的 構(gòu)建同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報(bào)告基因和人類Nel1 型蛋白[homo sapiens NEL-like 1，NELL1）] 基因的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-NELL1，并轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，觀察其表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究NELL1 蛋白的成骨作用提供理論基礎(chǔ)。 方法 設(shè)計(jì)特異性引物從NELL1 質(zhì)粒中擴(kuò)增NELL1，將測(cè)序正確的片段用XhoI/BglII 酶切處理，定向插入至pShuttle-GFP-CMV（-）TEMP 重組穿梭載體，然后將驗(yàn)證正確的重組穿梭質(zhì)粒中的插入片段轉(zhuǎn)移至pAdxsi 載體構(gòu)建重組腺病毒載體質(zhì)粒，用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，擴(kuò)增純化重組腺病毒，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量法測(cè)定重組腺病毒滴度。培養(yǎng)大鼠BMSCs，采用流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物，并行成骨、成脂誘導(dǎo)鑒定。用構(gòu)建的pAdxsi-GFP-NELL1 及空病毒pAdxsi-GFP（作為對(duì)照）轉(zhuǎn)染鑒定正確的BMSCs，RT-PCR 檢測(cè)NELL1 的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)GFP 基因及NELL1 的表達(dá)情況，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 成功構(gòu)建同時(shí)表達(dá)NELL1 和GFP 基因的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1），純化后獲得滴度達(dá)1 × 1011 pfu/mL 的重組腺病毒。成功分離獲得大鼠BMSCs 并傳代、純化，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物及成骨、成脂誘導(dǎo)鑒定為BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1 轉(zhuǎn)染BMSCs 后，RT-PCR 檢測(cè)示NELL1 mRNA 陽(yáng)性表達(dá)，熒光顯微鏡觀察示細(xì)胞爬片GFP 陽(yáng)性表達(dá)，NELL1 抗體免疫熒光觀察示NELL1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)。CCK-8 法鑒定顯示轉(zhuǎn)染后對(duì)BMSCs生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 結(jié)論 構(gòu)建并純化后的重組腺病毒載體（pAdxsi-GFP-NELL1）可高效轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達(dá)NELL1 和GFP 兩種基因，為進(jìn)一步研究新的成骨基因NELL1 的作用，追蹤其在體內(nèi)、體外表達(dá)情況提供了新工具。
目的 對(duì)鎳鈦（NiTi）記憶合金植入物進(jìn)行表面修飾是屏蔽Ni 離子釋放的有效方法，鈦鈮（TiNb）合金作為涂層材料不會(huì)影響NiTi 的超彈性和記憶效應(yīng)。對(duì)TiNb 涂層的NiTi 記憶合金植入體植入骨組織后的骨組織生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 對(duì)直徑4 mm、長(zhǎng)12 mm 的NiTi 記憶合金圓柱體采用磁控濺射技術(shù)分別進(jìn)行Ti 涂層和TiNb 涂層，另一組僅表面拋光清洗不進(jìn)行涂層。取成年雜種犬15 只，體重（15 ± 2）kg，隨機(jī)分為3 組，每組5 只，分別為NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組。制備犬雙側(cè)股骨干假體植入模型，垂直股骨外側(cè)皮質(zhì)分別植入NiTi 無(wú)涂層、Ti 涂層和TiNb 涂層記憶合金圓柱體，每只犬植入10 枚，間距1.0 ～ 1.5 cm。術(shù)后12 個(gè)月處死動(dòng)物取材，X 線片觀察植入體植入方向，未與股骨皮質(zhì)垂直的植入體標(biāo)本作為無(wú)效標(biāo)本放棄，其余有效標(biāo)本一部分（NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組標(biāo)本數(shù)分別為12、10 和14 枚）進(jìn)行生物力學(xué)推出實(shí)驗(yàn)，計(jì)算最大剪切強(qiáng)度；另一部分（NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組標(biāo)本數(shù)分別為8、5 和10 枚）行不脫鈣切片用于組織學(xué)觀察和計(jì)算骨性結(jié)合率。 結(jié)果 Ti 涂層組和TiNb 涂層組的剪切強(qiáng)度分別為（95.10 ± 10.03）、（91.20 ± 15.42）MPa，明顯高于NiTi 組的（71.60 ± 14.24）MPa（P lt; 0.01）； 2 個(gè)涂層組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。Giemsa 染色示3 組植入體周圍均未見明顯巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，偶爾可見少量淋巴細(xì)胞。NiTi 組、Ti 涂層組和TiNb 涂層組的骨性結(jié)合率分別為21.30% ± 0.23%、32.50% ± 0.31%和38.60% ± 0.58%，3 組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 各植入體和骨組織均具有良好的生物相容性；Ti 涂層和TiNb 涂層的骨生物相容性相近，但從骨性結(jié)合率結(jié)果分析，TiNb 涂層的骨組織生物相容性更佳。
【摘 要】 目的 探討脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架的制備方法以及將其應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程的可行性。 方法 取天然人軟骨粉碎后，采用梯度離心法取100 nm ～ 5 μm 軟骨微絲，脫細(xì)胞處理后制備為質(zhì)量體積比為3%的懸液，采用冷凍凍干法制備脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架。254 nm 紫外線和碳化二亞胺/ N- 羥基琥珀酰亞胺對(duì)支架進(jìn)行交聯(lián)。冷凍凍干后，對(duì)支架材料進(jìn)行組織學(xué)及掃描電鏡觀察，測(cè)定支架孔徑和孔隙率、吸水率，并采用MTT 法分析支架浸提液毒性。分離培養(yǎng)犬BMSCs，用TGF-β1 成軟骨誘導(dǎo)后種植至支架，倒置顯微鏡、電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)、分化情況。 結(jié)果 組織學(xué)觀察顯示，三維多孔支架中無(wú)軟骨細(xì)胞碎片殘留，甲苯胺藍(lán)染色、番紅O 染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色均呈陽(yáng)性。掃描電鏡顯示支架內(nèi)孔洞相互連通，孔徑為（155 ± 34）μm，孔隙率為91.3% ± 2.0%，吸水率為451% ± 155%。MTT 法顯示不同濃度支架浸提液與對(duì)照DMEM 培養(yǎng)液吸光度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），支架無(wú)細(xì)胞毒性。倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞在支架上黏附良好；掃描電鏡下細(xì)胞在支架上均勻分布，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，并有基質(zhì)分泌。 結(jié)論 制備的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架去細(xì)胞徹底，保留了軟骨ECM 主要成分，無(wú)毒，具備合適的孔徑和孔隙率，生物相容性良好，是軟骨組織工程良好的支架載體。