目的 人Ⅰ型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）對(duì)體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有抑制膠原合成作用，擬進(jìn)一步探討Col Ⅰ A1 ASODN 對(duì)裸鼠移植模型體內(nèi)的人增生性瘢痕的膠原合成作用。 方法 SPF 級(jí)BALB/c-nunu 品系6 ～ 8 周齡雌性裸鼠60 只，體重約20 g；取行瘢痕切除手術(shù)患者自愿捐贈(zèng)的瘢痕組織塊去表皮后，移植至裸鼠背部肩胛內(nèi)側(cè)皮下，每只裸鼠移植1 塊，制備人增生性瘢痕裸鼠移植模型。將58 只成功制備模型的裸鼠根據(jù)處理方法不同，隨機(jī)分成3 組，于瘢痕移植2 周根據(jù)分組行經(jīng)皮穿刺瘢痕內(nèi)注射。A 組（n=20）：5 μL 濃度為3 mmol/L Col Ⅰ A1 ASODN、3 μL 脂質(zhì)體、92 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；B 組（n=20）： 3 μL 脂 質(zhì)體、97 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；C 組（n=18）：100 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)最初2 周每天注射1 次，之后隔天1 次，至實(shí)驗(yàn)取材。注射后2、4、6 周，對(duì)存活裸鼠進(jìn)行瘢痕硬度測(cè)量后，處死裸鼠取瘢痕組織行膠原染色組織學(xué)觀察以及透射電鏡觀察；提取細(xì)胞總RNA 后行RT-PCR 測(cè)定Col Ⅰ A1 mRNA 相對(duì)含量；ELISA 法行Col Ⅰ A1 蛋白定量分析。 結(jié)果 注射后6 周內(nèi)17 只裸鼠死亡；共41 只裸鼠40 塊瘢痕組織符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，納入實(shí)驗(yàn)；A、B、C 組各14、13、14 只。注射后2 周，3 組間瘢痕硬度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；4、6 周時(shí)A 組與B、C 組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。隨時(shí)間延長，組織學(xué)觀察示3 組Ⅲ型膠原表達(dá)上升，A 組最明顯，Ⅰ型膠原排列規(guī)則。透射電鏡觀察示A 組成纖維細(xì)胞退化，膠原纖維排列更趨于一致；B、C 組膠原纖維排列也逐漸規(guī)則。注射后2、4 周3 組間Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；6 周時(shí)A 組與B、C 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 在人增生性瘢痕裸鼠移植模型的瘢痕內(nèi)注射Col Ⅰ A1 ASODN 可抑制Col Ⅰ A1 mRNA 及Ⅰ型膠原表達(dá)，促進(jìn)瘢痕組織成熟、軟化，脂質(zhì)體可促進(jìn)該抑制效果。
探討陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)Ⅰ 型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）轉(zhuǎn)染對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Col Ⅰ A1 表達(dá)的影響。 方法 取患者自愿捐贈(zèng)瘢痕組織，采用組織塊法培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞并傳代。于6 孔板內(nèi)按32.25 × 104 個(gè)/ 孔的密度接種第4 代細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染液不同分為4 組：A 組為脂質(zhì)體加Col Ⅰ A1 ASODN，B 組為Col Ⅰ A1 ASODN，C 組為脂質(zhì)體，D 組為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后8 h，1、2、3、4 d 分別提取細(xì)胞總RNA，行RT-PCR 后測(cè)定Col Ⅰ A1 mRNA 表達(dá)量；胃酶消化法提取ECM 中Col Ⅰ A1 蛋白，ELISA 測(cè)定其濃度。 結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶清晰，無雜帶、明顯的引物二聚體及拖尾現(xiàn)象。Col Ⅰ A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量：轉(zhuǎn)染后8 h，A 組小于B、C、D 組，B、C 組小于D 組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；B、C 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后1 d，A、B 組小于C、D 組（P lt; 0.05），A、B 組間和C、D 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05） ；轉(zhuǎn)染后2 d，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后3、4 d，A 組小于B、C、D 組，B 組小于C、D 組（P lt; 0.05），C、D 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。Col Ⅰ蛋白濃度：轉(zhuǎn)染后8 h，A組小于B、C、D 組，B、C 組小于D 組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PP gt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后1 d，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后2、3、4 d，A、B 組小于C、D 組，C 組小于D 組（P lt; 0.05），A、B 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 Col Ⅰ A1 ASODN 抑制Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達(dá)；陽離子脂質(zhì)體作為載體有增強(qiáng)效果，促進(jìn)ASODN 進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)分布。
【摘 要】 目的 探討毛乳頭細(xì)胞對(duì)表皮干細(xì)胞與同種異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建的組織工程皮膚血管化的影響。 方法 取門診包皮環(huán)切術(shù)患者皮膚，用于表皮細(xì)胞培養(yǎng)；取孕19、20 周引產(chǎn)胎兒頭部皮膚，用于毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)；患者及家屬均知情同意。以中性蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶消化、分離表皮細(xì)胞，Ⅳ型膠原黏附法分選表皮干細(xì)胞；以Ⅰ型膠原酶消化法分離毛乳頭，常規(guī)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。以同種異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為支架，在真皮基質(zhì)的真皮乳頭側(cè)種植毛乳頭細(xì)胞，基底膜側(cè)種植表皮干細(xì)胞構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組組織工程皮膚替代物；對(duì)照組組織工程皮膚替代物不種植毛乳頭細(xì)胞。取6 ～ 8 周齡BALB/C-nu 裸鼠60 只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（n=30）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部制造1 cm × 1 cm 大小全層皮膚缺損模型，將兩組組織工程皮膚替代物移植修復(fù)創(chuàng)面，2 周后觀察移植皮膚成活率。術(shù)后2、4 周，取移植皮膚替代物標(biāo)本，行HE 及免疫組織化學(xué)染色，觀察移植皮膚替代物CD31 表達(dá)水平，并計(jì)算兩組標(biāo)本血管密度。 結(jié)果 Ⅳ型膠原分選后表皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)角蛋白19、β1 整合素，提示為表皮干細(xì)胞。由毛乳頭培養(yǎng)出的細(xì)胞表達(dá)α 平滑肌肌動(dòng)蛋白，提示為毛乳頭細(xì)胞。動(dòng)物移植術(shù)后2 周，實(shí)驗(yàn)組移植皮膚成活率為93.3%（28/30），對(duì)照組為80.0%（24/30），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.31，P=0.00）。HE 染色觀察示實(shí)驗(yàn)組表皮層達(dá)12 層，表皮細(xì)胞體積較大；對(duì)照組表皮層達(dá)4 ～ 6 層，表皮細(xì)胞體積較小。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2、4 周，血管密度分別為（38.56 ± 2.49）個(gè)/mm2 和（49.12 ± 2.39）個(gè)/mm2，對(duì)照組分別為（25.16 ± 3.73） 個(gè) / mm2 和（36.26 ± 3.24） 個(gè) / mm2，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 毛乳頭細(xì)胞可促進(jìn)移植皮膚替代物血管形成，利于表皮層重建，提高組織工程皮膚移植成活率。