【摘 要】 目的 探討人羊水來源c-kit+ 間充質干細胞（c-kit+ human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells，c-kit+ HAFMSCs）的生物學特征及心肌誘導分化能力。 方法 通過產前診斷或自愿引產獲取50 份孕中期羊水標本，經流式細胞儀分選c-kit+ HAFMSCs，MTT 法觀察細胞增殖情況，并通過流式細胞儀、細胞免疫化學染色觀察行細胞表型鑒定。在體外經成骨及成脂誘導分化，于誘導培養(yǎng)后21 d 采用von Kossa 染色觀察鈣沉積顆粒，油紅O 染色觀察脂滴形成情況。實時熒光定量PCR 檢測細胞經5 氮-2’ 脫氧胞苷心肌誘導前后，NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4 種心肌特異性基因表達情況。 結果 經流式細胞儀分選，人孕中期羊水中c-kit+ HAFMSCs 含量約為貼壁細胞的3.07% ± 1.03%；體外增殖迅速，表達MSCs 表面標志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表達造血干細胞表面標志CD34、CD45；表達人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-ABC，不表達HLA-DR。細胞免疫化學染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4 染色呈陽性，CD34、CD45 染色呈陰性。MTT 檢測示第5、10、15 代c-kit+ HAFMSCs 具有相似的生長曲線。成骨和成脂誘導培養(yǎng)后21 d，細胞內有鈣鹽沉積和脂滴形成。實時熒光定量PCR 檢測示，心肌誘導后14 d， NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4 種心肌特異性基因表達均較誘導前明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結論 通過流式細胞儀分選的c-kit+ HAFMSCs 在體外可以誘導分化為心肌樣細胞，可能成為心肌再生性治療的種子細胞。
【摘 要】 目的 體外分離培養(yǎng)人羊水間充質干細胞（human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells，HAFMSCs），觀察低溫凍存復蘇后HAFMSCs 生物學特征，為進一步研究奠定理論基礎。 方法 取12 份自愿捐贈的孕16 ～ 20 周羊水標本，采用改良兩步法分離培養(yǎng)HAFMSCs，用含量不同的FBS、DMSO 凍存液凍存細胞，液氮凍存12 周后42℃水浴復蘇，錐蟲藍染色檢測細胞存活率，MTT 法檢測細胞增殖速度并繪制生長曲線，流式細胞儀檢測凍存復蘇后HAFMSCs 表型。對凍存復蘇后的HAFMSCs 進行成脂、成骨誘導分化培養(yǎng)，并分別采用油紅O、von Kossa 染色進行鑒定；實時熒光定量PCR 分析細胞凍存前后Oct-4、Nanog mRNA 表達差異。 結果 細胞凍存12 周后，不同的凍存方案對細胞存活率影響有差異，優(yōu)化的凍存方案為DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。凍存復蘇后的HAFMSCs 呈漩渦狀排列，生長曲線呈S 形，與凍存前細胞生長曲線相似。流式細胞儀檢測示凍存復蘇后細胞的MSCs 表型CD29、CD44、CD73、CD90 為陽性，造血干細胞表型CD34、CD45 為陰性。成脂、成骨誘導21 d，油紅O、von Kossa 染色均呈陽性。實時熒光定量PCR 檢測示凍存前后Oct-4、Nanog mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結論 HAFMSCs 具有體外增殖快、分化能力強的優(yōu)勢；并可耐受短期凍存，復蘇后細胞存活率高，生物學特征及分化潛能未發(fā)生明顯變化，凍存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10% 是較好凍存方案。