目的 設(shè)計(jì)、構(gòu)建并篩選出轉(zhuǎn)染至人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，對(duì)c-myc 沉默效果最佳的復(fù)制缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測(cè)定其滴度。 方法 設(shè)計(jì)有shRNA 結(jié)構(gòu)的3 對(duì)單鏈寡核苷酸（ss oligos），經(jīng)變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測(cè)序正確后，經(jīng)LipofectamineTM2000 陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)入人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對(duì)c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質(zhì)粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細(xì)胞包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，觀察其細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測(cè)定病毒滴度。 結(jié) 果 電泳驗(yàn)證后的ds oligos 插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測(cè)序結(jié)果提示構(gòu)建的pENTR/U6-shRNA 質(zhì)粒正確。從3 對(duì)ds oligos 通過(guò)RT-PCR 方法篩選出對(duì)c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構(gòu)建了介導(dǎo)c-myc-shRNA 復(fù)制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現(xiàn)象 3 d 開(kāi)始出現(xiàn)，6 d 更加明顯。采用VP法測(cè)定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經(jīng)3 ～ 4 代擴(kuò)增后可達(dá)2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實(shí)病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結(jié)論 通過(guò)RNA 干擾技術(shù)，體外成功構(gòu)建了介導(dǎo)shRNA-c-myc 復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
檢測(cè)人腰椎間盤組織中的細(xì)胞密度、細(xì)胞凋亡率以及Bax 和半胱氨酸蛋白酶蛋白3（Caspase-3）的表達(dá)，為深入了解人腰椎間盤退變的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為將來(lái)通過(guò)生物學(xué)方法延緩腰椎間盤退變提供新的思路。 方法 實(shí)驗(yàn)組30 個(gè)椎間盤標(biāo)本（L2 ～ S1）來(lái)自27 例行后路腰椎間盤切除椎間融合手術(shù)自愿捐贈(zèng)的患者，男18 例，女9 例；年齡30 ～ 72 歲，平均51.09 歲。所有病變節(jié)段均經(jīng)MRI 證實(shí)，患者術(shù)前均未接受椎間盤造影、膠原酶髓核溶解或椎間盤激光汽化術(shù)。對(duì)照組20 個(gè)標(biāo)本（L2 ～ S1）來(lái)自5 例青年男性意外死亡者新鮮尸檢腰椎間盤；年齡24 ～ 37 歲，平均30.83 歲。采用HE 染色觀察凋亡軟骨細(xì)胞、凋亡小體和細(xì)胞密度，TUNEL 染色法檢測(cè)人腰椎間盤中的凋亡細(xì)胞率，用SP 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bax 及Caspase-3 表達(dá)，圖像分析Bax 及Caspase-3 的平均灰度值。 結(jié)果 HE 染色示對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組軟骨終板和髓核內(nèi)的平均細(xì)胞密度分別為（17.16 ± 1.22）、（12.41 ± 0.95）個(gè)/HP，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt;0.01）。TUNEL染色觀察示對(duì)照組的軟骨終板與髓核內(nèi)的平均凋亡細(xì)胞率為6.97% ± 0.92%，低于實(shí)驗(yàn)組的12.59% ± 0.95%（P lt; 0.01）。SP 免疫組織化學(xué)染色示對(duì)照組髓核內(nèi)Bax 、Caspase-3 染色陽(yáng)性細(xì)胞率分別為11.02% ± 1.18% 和9.01% ±1.00%，均低于實(shí)驗(yàn)組的19.29% ± 1.18% 和15.07% ± 0.97%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。對(duì)照組腰椎間盤髓核內(nèi)Bax、Caspase-3 的平均灰度值分別為187.33 ± 7.88 和185.68 ± 3.26，實(shí)驗(yàn)組分別為124.98 ± 6.69 和160.13 ± 4.37，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。將全部腰椎間盤標(biāo)本進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腰椎間盤凋亡細(xì)胞率與細(xì)胞密度間成負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 分別為－ 0.88 和－ 0.93（P lt; 0.01）；兩組髓核內(nèi)Bax、Caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞率與凋亡細(xì)胞率之間成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 分別為 0.83 和 0.91（P lt; 0.01）。 結(jié)論 細(xì)胞密度下降參與了人腰椎間盤的退變過(guò)程，Bax和Caspase-3 的表達(dá)上調(diào)在人腰椎間盤髓核細(xì)胞的凋亡過(guò)程中有一定作用。