目的觀察嚴(yán)重增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)患者玻璃體腔注射雷珠單抗后玻璃體細(xì)胞因子的變化。 方法臨床檢查確診的嚴(yán)重PDR患者80例80只眼納入研究。依照非主動(dòng)隨機(jī)方法將患眼分為單純玻璃體切割手術(shù)組(A組)、玻璃體腔注射雷珠單抗聯(lián)合玻璃體切割手術(shù)組(B組),均為40只眼。兩組間性別(χ2=0.05)、年齡(t=0.59)、糖尿病病程(t=0.36)、HbA1c(t=0.13)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組平均眼壓,B組注藥前、玻璃體切割手術(shù)前平均眼壓比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.81,P>0.05)。A組患眼行玻璃體切割手術(shù)時(shí)抽取玻璃體液0.4 ml。B組患眼玻璃體腔注射雷珠單抗0.05 ml(含雷珠單抗0.5 mg);注藥后7 d行玻璃體切割手術(shù),抽取玻璃體液0.4 ml。雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定玻璃體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素(IL)-6、IL-8、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)濃度。 結(jié)果玻璃體VEGF、ICAM-1濃度B組分別為(10.70±3.60)、(224.64±90.32)pg/L,A組分別為(72.38±23.59)、(665.61±203.34)pg/L。兩組玻璃體VEGF、ICAM-1濃度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.34、12.53,P<0.001);玻璃體IL-6、IL-8濃度B組分為(210.64±80.27)、(156.00±57.74)pg/L,A組分別為(45.78±33.82)、(41.07±13.82)pg/L。兩組玻璃體IL-6、IL-8濃度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.97、12.24,P<0.001)。A、B組玻璃體CTGF濃度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.39,P>0.05)。B組CTGF/VEGF較A組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.75,P<0.001)。 結(jié)論玻璃體腔注射雷珠單抗1周后VEGF、ICAM-1明顯下降;IL-6、IL-8明顯升高;CTGF濃度無明顯變化,但CTGF/VEGF明顯升高。
體外分離培養(yǎng)豬滑膜源性MSCs（synovium-derived MSCs，SMSCs），探討其在體外多向分化潛能。 方法 2 月齡長(zhǎng)楓雜交豬3 頭，雌雄不限，體重8 ～ 10 kg。取豬膝關(guān)節(jié)滑膜組織分離SMSCs 并行原代及傳代培養(yǎng)，待第3 代SMSCs 長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，吸去基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別加入特定培養(yǎng)液進(jìn)行成軟骨、成骨、成脂誘導(dǎo)分化，作為實(shí)驗(yàn)組；以基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì)照組。成軟骨誘導(dǎo)21 d 后行甲苯胺藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)；成骨誘導(dǎo)10 d 后行ALP 染色檢測(cè)，21 d 后行茜素紅染色檢測(cè)；成脂誘導(dǎo)21 d 后行油紅O 染色檢測(cè)。 結(jié)果 SMSCs 培養(yǎng)24 h后細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)或呈多角形；48 h 后細(xì)胞數(shù)量增多；72 h 后可見大量紡錘形細(xì)胞，其間散在分布少許小圓形細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組成軟骨誘導(dǎo)21 d 后甲苯胺藍(lán)染色呈陽性，細(xì)胞外有蛋白多糖（Aggrecan）形成；免疫組織化學(xué)染色示特異軟骨基質(zhì)Col Ⅱ表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。成骨誘導(dǎo)10 d 后ALP 染色陽性，21d 后茜素紅染色陽性，有鈣結(jié)節(jié)形成。成脂誘導(dǎo)21 d 后油紅O 染色示細(xì)胞內(nèi)有脂滴形成。對(duì)照組除ALP 染色觀察呈弱陽性外，余染色均呈陰性。 結(jié)論 豬膝關(guān)節(jié)滑膜組織可分離獲取SMSCs，其在體外具有向成軟骨、成骨、成脂多向分化潛能，有望成為組織工程種子細(xì)胞來源。
構(gòu)建含人IL-1 受體拮抗蛋白（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體（PLXRNIL-1Ra），體外轉(zhuǎn)染人骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）軟骨細(xì)胞，研究其相關(guān)特性。 方法 利用細(xì)菌內(nèi)同源重組技術(shù)快速構(gòu)建PLXRN-IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)染PT67 細(xì)胞，包裝成為重組PLXRN-IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒，并使用小鼠腎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3 對(duì)病毒進(jìn)行滴度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)分為3 組：未轉(zhuǎn)染組（A 組）、PLXRN 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（B 組）、PLXRN-IL-1Ra 轉(zhuǎn)染組（C 組），病毒感染人OA 軟骨細(xì)胞后，RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-1Ra 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人IL-1Ra 蛋白表達(dá)。 結(jié)果 酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中含有人IL-1Ra cDNA，測(cè)定包裝的病毒滴度為3 × 104 CFU/mL。原代軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)呈多角形或梭形，甲苯胺藍(lán)染色見細(xì)胞內(nèi)有紫色異染顆粒。RT-PCR 結(jié)果顯示在C 組出現(xiàn)311 bp 人IL-1Ra mRNA 片段，A、B 組未見人IL-1Ra mRNA 的表達(dá)帶，GAPDH 在各組均有表達(dá)。ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C 組細(xì)胞上清有一定量的人IL-1Ra 表達(dá)，蛋白濃度為（60.47 ± 15.13）ng/L，A 組和B 組均無人IL-1Ra 表達(dá)。 結(jié)論 構(gòu)建的IL-1Ra 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體成功地感染人OA 軟骨細(xì)胞，并在體外獲得穩(wěn)定表達(dá)，為將表達(dá)人IL-1Ra 基因的人OA 軟骨細(xì)胞用于OA 基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。