目的 以去細(xì)胞肌肉生物支架（acellular muscle bioscaffolds，AMBS）接種BMSCs，同種異體移植修復(fù)大鼠脊髓半切損傷，觀察兩者聯(lián)合移植對脊髓損傷的修復(fù)作用。 方法取8周齡雌性SD大鼠，采用改良化學(xué)方法制備AMBS，并進行復(fù)合冷滅菌；密度梯度離心法提取、貼壁法培養(yǎng)BMSCs，取第3代細(xì)胞用Hoechst 33342熒光標(biāo)記，采用注射法制備BMSCs-AMBS復(fù)合支架，14 d后掃描電鏡及熒光顯微鏡觀察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠48只，制備T9～11脊髓半切損傷模型后隨機分為4組（n=12），A組于缺損處移植BMSCs-AMBS復(fù)合支架，B組單獨移植BMSCs，C組單獨移植AMBS，D組注射PBS作為空白對照組，分別于術(shù)后1、2、3、4周行運動功能評分，術(shù)后4周行HE染色觀察及免疫熒光檢測。 結(jié)果Masson染色及HE染色示AMBS內(nèi)部呈平行結(jié)構(gòu)，主要為膠原纖維，幾乎無肌纖維。BMSCs-AMBS復(fù)合培養(yǎng)14 d后熒光顯微鏡觀察示Hoechst 33342標(biāo)記BMSCs大量存活，掃描電鏡可見BMSCs貼附于支架內(nèi)表面生長。術(shù)后2～4周，大鼠BBB評分A組均高于其余3組（P lt; 0.05），D組明顯低于其余3組（P lt; 0.05）；術(shù)后4周B組明顯高于C組（t=10.352，P=0.000）。術(shù)后4周，HE染色示脊髓空洞面積A組明顯小于其余3組，免疫熒光染色示A 組神經(jīng)絲蛋白200、巢蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)量高于其余3組，神經(jīng)膠質(zhì)原酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）則明顯低表達(dá)。A、B組熒光示蹤的BMSCs移植到體內(nèi)后主要遷移至對側(cè)灰質(zhì)前角，部分分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。A、B、C、D組GFAP熒光半定量分析積分吸光度（IA）值分別為733.01 ± 202.04、926.42 ± 59.46、1 069.37 ± 33.42、1 469.46 ± 160.53，A組明顯低于其余3組，D組高于其余3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論AMBS具有相對規(guī)則的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，與BMSCs有良好生物相容性，能抑制膠質(zhì)瘢痕，促進BMSCs存活、遷徙、分化，是細(xì)胞移植理想的天然載體。兩者聯(lián)合移植修復(fù)大鼠脊髓損傷能發(fā)揮協(xié)同作用，促進運動功能恢復(fù)。
目的 研究殼聚糖 - 藻酸鹽支架復(fù)合 BMSCs 構(gòu)建組織工程脊髓，橋接大鼠脊髓半橫斷損傷斷端，促進急性脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）修復(fù)的作用。? 方法? 取 1 只成年雄性 SD 大鼠骨髓，分離、培養(yǎng) BMSCs。采用冷凍干燥法制備殼聚糖 - 藻酸鹽支架，掃描電鏡觀察結(jié)構(gòu)，用浸提液實驗檢測毒性。將支架材料與第 2 代 BMSCs 以細(xì)胞密度 1 × 106個 /mL 體外復(fù)合培養(yǎng)制備組織工程脊髓，于培養(yǎng)后 1、 3、 5 d 掃描電鏡觀察其生物相容性。取成年雌性 SD 大鼠40 只制備急性脊髓 T9 半橫斷損傷模型，根據(jù)修復(fù)方法不同隨機將大鼠分為 4 組（n=10）。A 組于損傷區(qū)植入組織工程脊髓， B 組植入單純支架， C 組植入 20 μL 1 × 107個 /mL BMSCs， D 組直接縫合硬膜作為空白對照。術(shù)后 1、 2、 4、 6 周采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分評價大鼠后肢運動功能；術(shù)后 6 周取材行麥芽凝集素 - 辣根過氧化物酶（wheat germ agglutinin-horseradish peroxidase，WGA-HRP）神經(jīng)逆行示蹤檢測、 HE 染色和免疫熒光染色檢測。? 結(jié)?果 掃描電鏡觀察示殼聚糖 - 藻酸鹽支架呈三維多孔海綿樣結(jié)構(gòu)。浸提液實驗顯示支架材料的細(xì)胞毒性等級為 0 ～ 1 級。掃描電鏡觀察示 BMSCs 與支架材料復(fù)合培養(yǎng) 3 d 后即可黏附于支架材料表面，細(xì)胞呈一定方向排列。術(shù)后 2、 4、 6 周 A 組 BBB 評分均明顯高于其余各組，D 組明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）； B 組術(shù)后 4、6 周高于 C 組（P lt; 0.05）。術(shù)后 6 周，各組 WGA-HRP 神經(jīng)逆行示蹤檢測示陽性神經(jīng)纖維均未能穿過脊髓斷端。HE 染色與免疫熒光染色顯示 A 組宿主脊髓與組織工程脊髓連接緊密，損傷區(qū)內(nèi)無明顯瘢痕組織長入，有較多神經(jīng)絲蛋白 200（neuroflament 200，NF-200）陽性細(xì)胞發(fā)生的神經(jīng)纖維及神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specifc enolase， NSE）陽性神經(jīng)元樣細(xì)胞； B 組支架植入外周可見成纖維細(xì)胞形成的瘢痕組織以及少量侵入尚未降解的支架材料；交界區(qū)可見少量 NSE、NF-200 陽性細(xì)胞； C、D 組脊髓斷端見瘢痕組織填充， D組脊髓損傷周邊有空洞形成，兩組均未見明顯NSE、 NF-200陽性神經(jīng)元樣細(xì)胞。? 結(jié)?論 殼聚糖-藻酸鹽支架與 BMSCs 復(fù)合構(gòu)建的組織工程脊髓對大鼠急性 SCI 修復(fù)有促進作用，是一種具有潛在應(yīng)用前景的支架材料。
目的 觀察經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔不同次數(shù)移植的 BMSCs 在 Wistar 大鼠損傷脊髓內(nèi)的存活、遷移及對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）修復(fù)的作用，探討 BMSCs 移植的最佳次數(shù)。? 方法 8 只 2 月齡 Wistar 大鼠，體重約120 g。取股骨骨髓體外分離培養(yǎng)第 2 代 BMSCs，用 Hoechst 33342 標(biāo)記。另取 75 只成年 Wistar 大鼠體重約 220 g，采用改良Allen法制備T9、 10 SCI模型。隨機分為5組（n=15）， A組經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔置管移植1次1 × 107個/mL BMSCs懸液0.1 mL（術(shù)后 1 周）， B 組 2 次（術(shù)后 1、 3 周）， C 組 3 次（術(shù)后 1、 3、 5 周）， D 組 5 次（術(shù)后 1、 3、 5、 7、 9 周）， E 組于術(shù)后 1、 3、 5、 7、9 周各注入 0.2 mL PBS 作為空白對照。SCI 術(shù)后不同時間點行大鼠后肢 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分評價神經(jīng)功能狀況，并行熒光顯微鏡、 HE 染色、免疫組織化學(xué)染色觀察 BMSCs 在體內(nèi)遷移、存活及分化情況。? 結(jié)果 術(shù)后 3 周，A ～ D 組 BBB 評分均有明顯增加，與 E 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。術(shù)后 7、9、12 周，C、D 組 BBB 評分均明顯高于 A、B 組（P lt; 0.01），B 組高于 A 組（P lt; 0.01）。各時間點 C、D 組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。熒光顯微鏡觀察示術(shù)后 3 周，移植的 BMSCs 存活于損傷脊髓邊緣， A 組細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰；隨后 A 組細(xì)胞數(shù)逐漸減少， B、 C、 D 組分別于術(shù)后5、 7、 7周細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰后逐漸下降。12周C、 D組存活細(xì)胞數(shù)顯著多于A、 B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；各時間點C、 D組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 HE染色示術(shù)后3周損傷脊髓形成的空洞A、 B、 C、 D組逐漸減小，12 周 C、 D 組空洞最小， A、 B 組次之， E 組最大。免疫組織化學(xué)染色示神經(jīng)絲蛋白 200（neuroflament 200， NF-200）細(xì)胞數(shù)變化趨勢與 BMSCs 存活細(xì)胞數(shù)類似。術(shù)后 12 周 NF-200 陽性細(xì)胞數(shù)在 C、D 組表達(dá)較 A、B 組明顯；神經(jīng)元樣細(xì)胞發(fā)出的神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)在C、 D組最明顯， A、 B組較少。 ? 結(jié)論 多次移植BMSCs更有利于SCI修復(fù)，移植以3次為最好。
目的 脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）能分化成神經(jīng)元促進脊髓愈合，但其分子機制尚不清楚。研究三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/ 信號轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路在 SCI 中的生理和病理機制。? 方法 取 96 只健康成年雌性 SD 大鼠，體重 250 ～ 300 g，隨機分為 4 組（n=24）： A、 B、 C 組用改良 Allen 重物打擊法制作 T8 ～ 10 SCI 模型后， A 組以 ATP（40 mg/kg）、 B 組以等量生理鹽水、 C 組以 ATP（40 mg/ kg）加雷帕霉素（3 mg/kg）分別治療 7 d； D 組僅行椎板切除術(shù)，不損傷脊髓，等量生理鹽水治療 7 d。術(shù)后1、2、3、4 周采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法評估大鼠后肢運動功能恢復(fù)情況，各時間點取材行免疫組織化學(xué)、Western blot、實時熒光定量 PCR 檢測脊髓細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specifc enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)（glial fbrillary acidic protein， GFAP）和通路因子mTOR、 STAT3的表達(dá)。? 結(jié)果 術(shù)后 1 ～ 4 周，A 組大鼠 BBB 評分呈持續(xù)升高趨勢，均高于 B、C 組，低于 D 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。實時熒光定量 PCR 檢測顯示，術(shù)后 1 ～ 4 周 A 組 mTOR、STAT3、NSE mRNA 表達(dá)持續(xù)升高，Nestin mRNA 表達(dá)逐漸降低，但各時間點均高于 B、C、D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；而 A 組 GFAP mRNA 表達(dá)持續(xù)升高，但各時間點均低于 B、C組，高于 D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；各時間點 B、C 組各指標(biāo) mRNA 表達(dá)與 D 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01），?B、C 組間 mTOR、P-mTOR、STAT3、P-STAT3 mRNA 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05），余指標(biāo)表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。Western blot蛋白檢測結(jié)果與mRNA變化相似。? 結(jié)論 在大鼠體內(nèi)ATP能激活mTOR/STAT3通路，誘導(dǎo)內(nèi)源性 NSCs 增殖、分化為神經(jīng)元，有助于 SCI 愈合。
【摘 要】 目的 探討傳統(tǒng)中藥紅景天苷誘導(dǎo)大鼠BMSCs 向膽堿能神經(jīng)細(xì)胞分化的作用及影響，以期為紅景天苷應(yīng)用于干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。 方法 取4 ～ 6 周齡Wistar 大鼠（體重約120 g）2 只分離、培養(yǎng)BMSCs，并采用流式細(xì)胞儀鑒定。取第2 代細(xì)胞，根據(jù)誘導(dǎo)方法不同將實驗分為紅景天苷誘導(dǎo)組（A 組）、維甲酸誘導(dǎo)組（B 組）和空白對照組（C 組），A、B 組BMSCs 分別采用紅景天苷（20 μg/mL）和維甲酸（5 μmol/mL）誘導(dǎo)培養(yǎng)1、3、6、9 d，MTT 法檢測細(xì)胞增殖活力；細(xì)胞免疫熒光染色檢測神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志分子神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specificenolase，NSE）、神經(jīng)微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）、β- 微管蛋白Ⅲ（β-Tubulin Ⅲ）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、乙酰膽堿（Acetylcholine, Ach）及NGF 的表達(dá)；RT-PCR 檢測NSE、β-Tubulin Ⅲ、GFAP、γ- 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、 腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF） mRNA 的表達(dá)；ELISA 法測定培養(yǎng)液中BDNF 和NGF 含量；Western blot 檢測NGF 蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測顯示，CD90 和CD106 陽性，CD34 和CD45 陰性，實驗細(xì)胞為BMSCs。A、B 組誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d 和9 d，細(xì)胞增殖活力較C 組明顯增強（P lt; 0.05）。RT-PCR 檢測示，A 組誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d，NSE、BDNF、β-Tubulin Ⅲ、GFAP mRNA 表達(dá)豐度上調(diào)至峰值。B 組誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d，NSE mRNA 表達(dá)豐度上調(diào)至峰值；1 d 時BDNF mRNA 表達(dá)豐度上調(diào)，6 d 時達(dá)峰值；3 d 時β-Tubulin Ⅲ mRNA 表達(dá)豐度上調(diào)至峰值；1 d 時 GFAP mRNA 表達(dá)豐度達(dá)峰值，與其余各時間點及C 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。各組各時間點均未見GABA mRNA 表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色示，誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，A、B 組NSE、MAP2、β-Tubulin Ⅲ和GFAP 陽性率與C 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；A、B 組誘導(dǎo)培養(yǎng) 3、6、9 d，Ach 陽性率均高于誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d 時及C 組陽性率（P lt; 0.01）；A、B 組各時間點NGF 陽性率均顯著高于C 組（P lt; 0.01）。ELISA 法檢測顯示，A、B 組誘導(dǎo)培養(yǎng) 1、3、6、9 d 時，BDNF、NGF 表達(dá)水平均較C 組上調(diào)（P lt; 0.01），各時間點A、B 組間BDNF 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。Western blot 檢測顯示，A 組誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d、B 組誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d 時 NGF 蛋白表達(dá)最高。 結(jié)論 紅景天苷能定向誘導(dǎo)大鼠BMSCs 分化為膽堿能神經(jīng)細(xì)胞。