張仲斌 1 , 高凱 1 , 劉慶祝 2 , 周家蓬 3 , 李溪遠 4 , 郎娜 3 , 劉明 1 , 王天爽 1 , 張捷 1 , 王惠 5 , 董穎 5 , 季濤云 1,2 , 王爽 1,2 , 劉曉燕 1,2 , 姜玉武 1,2 , 蔡立新 2 , 吳曄 1,2
  • 1. 北京大學第一醫(yī)院 兒科（北京 100035）;
  • 2. 北京大學第一醫(yī)院 兒童癲癇中心（北京 100035）;
  • 3. 湖南師范大學 生命科學學院（長沙 410081）;
  • 4. 中國科學院計算技術研究所（北京 100190）;
  • 5. 北京大學第一醫(yī)院 病理科（北京 100035）;

引用本文： 張仲斌, 高凱, 劉慶祝, 周家蓬, 李溪遠, 郎娜, 劉明, 王天爽, 張捷, 王惠, 董穎, 季濤云, 王爽, 劉曉燕, 姜玉武, 蔡立新, 吳曄. 局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良 II 型腦組織中新候選基因的體細胞變異. 癲癇雜志, 2020, 6(4): 385-386. doi: 復制

版權信息： ?四川大學華西醫(yī)院華西期刊社《癲癇雜志》版權所有，未經(jīng)授權不得轉(zhuǎn)載、改編

背景　局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良（Focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD）是大腦發(fā)育過程中局部神經(jīng)元增殖及分化異常而導致的皮質(zhì)發(fā)育畸形，是兒童藥物難治性癲癇的常見病因，也是兒童癲癇外科癲癇病灶切除術的主要病理類型。其中 FCD II 型占比最高，其病理主要表現(xiàn)為皮質(zhì)分層異常，存在異形神經(jīng)元，伴或不伴氣球樣細胞，進一步分為 FCD IIa 和 FCD IIb。近十余年來，利用手術切除 FCD II 型腦組織樣本進行深度二代測序，并與患者自身外周血或唾液細胞對照，在 10%～63% 的 FCD II 型患者的病灶腦組織中檢測到體細胞突變，突變基因所編碼的蛋白都位于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin，mTOR）通路及其調(diào)控通路上，包括 MTOR、PIK3CA、TSC1、TSC2、AKT3、RHEB 和 DEPDC5 等，在病灶組織中突變等位基因頻率為 0.93%～33.5%，突變均導致 PI3K-AKT-mTOR 通路上調(diào)。然而，既往研究中仍有約半數(shù) FCD II 型腦組織樣本中基因檢測陰性。本研究旨在發(fā)現(xiàn) FCD II 型腦組織中新的候選基因。

方法　收集 17 例藥物難治性癲癇患兒手術切除的 FCDII 型病灶區(qū)腦組織、灶旁區(qū)腦組織及外周血樣本，其中包括 FCD IIa 4 例、FCD IIb 13 例。分別對上述 3 類樣本提取的 DNA 進行全外顯子組測序（Whole exome sequencing，WES）（測序深度≥200×）。為了得到病灶組織中的可能有害變異（Potentially deleterious somatic variants，PDSVs），WES 數(shù)據(jù)進一步根據(jù)如下策略逐層進行篩選：① 篩選出 FCD II 型病灶中獨有的體細胞變異（灶旁腦組織及外周血均未檢測到變異）：病灶組織 DNA 中≥4 個獨立變異 reads，灶旁及外周血 DNA 變異 read 為 0；② 篩選出腦內(nèi)表達基因：根據(jù) GTEx V7 數(shù)據(jù)庫，設定腦內(nèi)平均表達量>1 作為 cut-off 值；③ 篩選出可疑有害變異：首先將非剪切位點內(nèi)含子變異及同義變異剔除，然后保留符合下述任何一條的變異：a. 錯義變異（PolyPhen2、SIFT、MutationTaster，≥2 個致病性預測為有害）；b. 無義變異；c. 終止密碼子丟失變異；d. 插入缺失變異；e. 剪切位點變異；f. 收錄在 ClinVar、HGMD 和 Cosmic70 數(shù)據(jù)庫的變異，最后將保留下的變異中最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）>0.05 的變異剔除；④ 為了將 WES 假陽性結(jié)果最小化：將變異等位基因頻率<1% 的變異剔除；⑤ 進一步利用擴增子測序方法（讀取深度≥8000×）對 WES 數(shù)據(jù)篩選出的 PDSVs 進行驗證。最終保留 WES 和擴增子測序變異變異等位基因頻率均≥1% 的變異作為最終 PDSVs。并利用 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫進一步進行通路富集分析。為了確定我們發(fā)現(xiàn)的胰島素受體底物 1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）基因體細胞變異的致病意義，我們利用 HEK293T 細胞及 FCD II 型腦組織進行了體外功能研究。

結(jié)果　在 6 例 FCDII 患兒（6/17，35.3%）的病灶腦組織中發(fā)現(xiàn)了 7 個基因中的 7 個 PDSVs，包括 2 個移碼變異及 5 個錯義變異，變異等位基因頻率 1.29%～5.5%。7 個 PDSVs 分別為：MTOR（c.C5930A，p.Thr1977Lys，NM_004958.4）、TSC2（c.C5227T，p.Arg1743Trp，NM_000548.5）、IRS1 （c.1791dupG，p.His598Ala fs*13，NM_005544.2）、RAB6B （c.C383T，p.Thr128Met，NM_016577.4）、RALA （c.G482A，p.Arg161Gln，NM_005402.4）、HTR6 （c.G469A，p.Ala157Thr，NM_000871.3） 和 ZNF337 （c.692_693del；p.Thr231Arg fs*45，NM_001290261.1）。其中 IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA 和 HTR6 尚未報道與任何皮質(zhì)發(fā)育畸形相關。IRS1 和 HTR6 的 PDSVs 已在 COSMIC 數(shù)據(jù)庫中報道，提示上述 2 個體細胞變異在其他腫瘤樣本中曾被發(fā)現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn) PDSVs 的 6 例 FCD 病灶中，5 例僅檢測到 1 個 PDSV，1 例（病例 1）病灶中同時檢測到 2 個基因（IRS1 和 ZNF337）的 2 個 PDSVs。

經(jīng)過通路分析發(fā)現(xiàn)，IRS1、RAB6B、RALA 和 HTR6 均與 mTOR 通路存在相互作用。由于 IRS1 恰位于 PI3K-AKT-mTOR 通路上游，本研究選擇 IRS1 進行了進一步的功能研究。通過檢測轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1（c.1791dupG）HEK293T 細胞的 IRS1 蛋白表達，發(fā)現(xiàn) IRS1 c.1791dupG 導致蛋白截短，蛋白表達量無顯著變化。利用免疫印跡法及免疫熒光染色檢測病例 1（檢測到 IRS1 變異的患者）的病灶及灶旁腦組織 S6 磷酸化水平，證實該患兒病灶腦組織較灶旁組織的 mTOR 通路激活水平明顯升高，且主要分布在病灶組織的神經(jīng)元（包括異形神經(jīng)元）和氣球樣細胞中。進一步通過檢測轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1 的 HEK293T 細胞 S6 磷酸化水平，證實 IRS1 變異可導致 mTOR 通路異常激活。

結(jié)論　17 例 FCD II 型患兒中，6 例病灶腦組織檢測到 7 個基因的 7 個 PDSVs，其中 5 個基因（IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA、HTR6）尚未報道與皮質(zhì)發(fā)育畸形相關。體外功能研究證實 IRS 基因變異可導致 mTOR 通路的過度激活。盡管需要進一步功能學實驗來證實上述 PDSVs 在 FCD II 型中的作用，但本研究結(jié)果為 FCD II 型發(fā)生機制提供了新的候選基因。

摘譯自：Zhang Z，Gao K，Liu Q， et al. Somatic variants in new candidate genes identified in focal cortical dysplasia type II. Epilepsia，2020，https://doi.org/10.1111/epi.16481.

背景　局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良（Focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD）是大腦發(fā)育過程中局部神經(jīng)元增殖及分化異常而導致的皮質(zhì)發(fā)育畸形，是兒童藥物難治性癲癇的常見病因，也是兒童癲癇外科癲癇病灶切除術的主要病理類型。其中 FCD II 型占比最高，其病理主要表現(xiàn)為皮質(zhì)分層異常，存在異形神經(jīng)元，伴或不伴氣球樣細胞，進一步分為 FCD IIa 和 FCD IIb。近十余年來，利用手術切除 FCD II 型腦組織樣本進行深度二代測序，并與患者自身外周血或唾液細胞對照，在 10%～63% 的 FCD II 型患者的病灶腦組織中檢測到體細胞突變，突變基因所編碼的蛋白都位于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of rapamycin，mTOR）通路及其調(diào)控通路上，包括 MTOR、PIK3CA、TSC1、TSC2、AKT3、RHEB 和 DEPDC5 等，在病灶組織中突變等位基因頻率為 0.93%～33.5%，突變均導致 PI3K-AKT-mTOR 通路上調(diào)。然而，既往研究中仍有約半數(shù) FCD II 型腦組織樣本中基因檢測陰性。本研究旨在發(fā)現(xiàn) FCD II 型腦組織中新的候選基因。

方法　收集 17 例藥物難治性癲癇患兒手術切除的 FCDII 型病灶區(qū)腦組織、灶旁區(qū)腦組織及外周血樣本，其中包括 FCD IIa 4 例、FCD IIb 13 例。分別對上述 3 類樣本提取的 DNA 進行全外顯子組測序（Whole exome sequencing，WES）（測序深度≥200×）。為了得到病灶組織中的可能有害變異（Potentially deleterious somatic variants，PDSVs），WES 數(shù)據(jù)進一步根據(jù)如下策略逐層進行篩選：① 篩選出 FCD II 型病灶中獨有的體細胞變異（灶旁腦組織及外周血均未檢測到變異）：病灶組織 DNA 中≥4 個獨立變異 reads，灶旁及外周血 DNA 變異 read 為 0；② 篩選出腦內(nèi)表達基因：根據(jù) GTEx V7 數(shù)據(jù)庫，設定腦內(nèi)平均表達量>1 作為 cut-off 值；③ 篩選出可疑有害變異：首先將非剪切位點內(nèi)含子變異及同義變異剔除，然后保留符合下述任何一條的變異：a. 錯義變異（PolyPhen2、SIFT、MutationTaster，≥2 個致病性預測為有害）；b. 無義變異；c. 終止密碼子丟失變異；d. 插入缺失變異；e. 剪切位點變異；f. 收錄在 ClinVar、HGMD 和 Cosmic70 數(shù)據(jù)庫的變異，最后將保留下的變異中最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）>0.05 的變異剔除；④ 為了將 WES 假陽性結(jié)果最小化：將變異等位基因頻率<1% 的變異剔除；⑤ 進一步利用擴增子測序方法（讀取深度≥8000×）對 WES 數(shù)據(jù)篩選出的 PDSVs 進行驗證。最終保留 WES 和擴增子測序變異變異等位基因頻率均≥1% 的變異作為最終 PDSVs。并利用 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫進一步進行通路富集分析。為了確定我們發(fā)現(xiàn)的胰島素受體底物 1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）基因體細胞變異的致病意義，我們利用 HEK293T 細胞及 FCD II 型腦組織進行了體外功能研究。

結(jié)果　在 6 例 FCDII 患兒（6/17，35.3%）的病灶腦組織中發(fā)現(xiàn)了 7 個基因中的 7 個 PDSVs，包括 2 個移碼變異及 5 個錯義變異，變異等位基因頻率 1.29%～5.5%。7 個 PDSVs 分別為：MTOR（c.C5930A，p.Thr1977Lys，NM_004958.4）、TSC2（c.C5227T，p.Arg1743Trp，NM_000548.5）、IRS1 （c.1791dupG，p.His598Ala fs*13，NM_005544.2）、RAB6B （c.C383T，p.Thr128Met，NM_016577.4）、RALA （c.G482A，p.Arg161Gln，NM_005402.4）、HTR6 （c.G469A，p.Ala157Thr，NM_000871.3） 和 ZNF337 （c.692_693del；p.Thr231Arg fs*45，NM_001290261.1）。其中 IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA 和 HTR6 尚未報道與任何皮質(zhì)發(fā)育畸形相關。IRS1 和 HTR6 的 PDSVs 已在 COSMIC 數(shù)據(jù)庫中報道，提示上述 2 個體細胞變異在其他腫瘤樣本中曾被發(fā)現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn) PDSVs 的 6 例 FCD 病灶中，5 例僅檢測到 1 個 PDSV，1 例（病例 1）病灶中同時檢測到 2 個基因（IRS1 和 ZNF337）的 2 個 PDSVs。

經(jīng)過通路分析發(fā)現(xiàn)，IRS1、RAB6B、RALA 和 HTR6 均與 mTOR 通路存在相互作用。由于 IRS1 恰位于 PI3K-AKT-mTOR 通路上游，本研究選擇 IRS1 進行了進一步的功能研究。通過檢測轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1（c.1791dupG）HEK293T 細胞的 IRS1 蛋白表達，發(fā)現(xiàn) IRS1 c.1791dupG 導致蛋白截短，蛋白表達量無顯著變化。利用免疫印跡法及免疫熒光染色檢測病例 1（檢測到 IRS1 變異的患者）的病灶及灶旁腦組織 S6 磷酸化水平，證實該患兒病灶腦組織較灶旁組織的 mTOR 通路激活水平明顯升高，且主要分布在病灶組織的神經(jīng)元（包括異形神經(jīng)元）和氣球樣細胞中。進一步通過檢測轉(zhuǎn)染野生型或突變型 IRS1 的 HEK293T 細胞 S6 磷酸化水平，證實 IRS1 變異可導致 mTOR 通路異常激活。

結(jié)論　17 例 FCD II 型患兒中，6 例病灶腦組織檢測到 7 個基因的 7 個 PDSVs，其中 5 個基因（IRS1、RAB6B、ZNF337、RALA、HTR6）尚未報道與皮質(zhì)發(fā)育畸形相關。體外功能研究證實 IRS 基因變異可導致 mTOR 通路的過度激活。盡管需要進一步功能學實驗來證實上述 PDSVs 在 FCD II 型中的作用，但本研究結(jié)果為 FCD II 型發(fā)生機制提供了新的候選基因。

摘譯自：Zhang Z，Gao K，Liu Q， et al. Somatic variants in new candidate genes identified in focal cortical dysplasia type II. Epilepsia，2020，https://doi.org/10.1111/epi.16481.