引用本文： 相隗文殊, 徐煜宸, 吳曄, 包新華, 張?jiān)氯A, 袁宏杰, 姜玉武. GRIN2D 相關(guān)發(fā)育性癲癇腦病的臨床表型及突變功能異質(zhì)性. 癲癇雜志, 2020, 6(1): 78-79. doi: 復(fù)制
版權(quán)信息： ?四川大學(xué)華西醫(yī)院華西期刊社《癲癇雜志》版權(quán)所有，未經(jīng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、改編
背景 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體是一類重要的離子型谷氨酸受體，主要表達(dá)于神經(jīng)元的突觸后膜，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞中的慢鈣電流成分，與學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性等生理功能及癲癇、發(fā)育遲緩、精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病有關(guān)。GRIN2D 主要表達(dá)于胎兒時(shí)期及生后早期，其編碼的 GluN2D 亞基既往曾報(bào)道與早發(fā)癲癇性腦?。‥arly infantile epileptic encephalopathy，EIEE）高度相關(guān)，但目前 GRIN2D 變異的相關(guān)功能研究較少、致病機(jī)制尚不明確。
方法 收集特發(fā)性癲癇伴智力障礙/發(fā)育遲緩患者及其父母的血液，采用二代測(cè)序靶向捕獲或全外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè) DNA 序列的變化，獲取患者可疑的致病性基因變異，利用 Sanger 測(cè)序進(jìn)行家系驗(yàn)證；采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建 GRIN2D 突變載體，體外合成 cRNA，顯微注射表達(dá)于非洲爪哇蟾蜍卵母細(xì)胞，同時(shí)使用 cDNA 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞系，利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)突變受體的功能變化；采用 β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因，檢測(cè)受體蛋白表達(dá)量變化；利用帶有 GFP 標(biāo)簽的載體，轉(zhuǎn)染大鼠原代神經(jīng)元并使用 NMDA 受體抑制劑 Memantine 進(jìn)行處理，利用免疫熒光觀察 GRIN2D 突變對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致功能增強(qiáng)的變異，檢測(cè)其對(duì)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的 NMDA 受體抑制劑的敏感性。
結(jié)果 研究共收集了來自中國(guó)、美國(guó)、歐洲及中東等地區(qū)的 8 例攜帶 GRIN2D 基因變異的患者，年齡為 9 個(gè)月～34 歲，男性、女性患者各 4 例，均無明確神經(jīng)系統(tǒng)疾病家族史及圍產(chǎn)期病史。87.5% 的患者癲癇起病年齡在 1 歲以內(nèi)，均為藥物難治性癲癇，發(fā)作形式以痙攣發(fā)作為主，部分患者隨著病情發(fā)展逐漸出現(xiàn)其他發(fā)作形式，如局灶發(fā)作伴泛化、失張力發(fā)作、肌陣攣發(fā)作等。所有患者均有不同程度的智力障礙/發(fā)育遲滯，部分患者出現(xiàn)肌張力異常、運(yùn)動(dòng)障礙、喂養(yǎng)困難、睡眠障礙及早亡。8 例患者共攜帶 7 種不同的 GRIN2D 變異位點(diǎn)，包括 S573F、L670F、V667I、A675T、A678D、S1271L 及 R1313W。除 V667I 為既往已報(bào)道的功能獲得型變異外，其余均為既往未見報(bào)道的新變異。對(duì)基因的保守性及變異頻率進(jìn)行分析，71%（5/7）的突變位于突變高度不耐受區(qū)域，S573F 位于 GluN2D 蛋白的 pre-M1 功能域，L670F、V667I、A675T 及 A678D 位于 M3 功能域，均直接參與 NMDA 受體通道孔的形成；S1271L 和 R1313W 位于 GluN2D 蛋白的胞內(nèi)段，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體上膜直接相關(guān)。膜片鉗的結(jié)果顯示，L670F、A675T 及 A678D 對(duì) NMDA 受體激動(dòng)劑谷氨酸、甘氨酸及 D-絲氨酸的 EC50 下降 2.8～19 倍，NMDA 受體抑制劑氫離子的敏感性降低至野生型的 1/3～1/2，提高通道開放率 29～52 倍，導(dǎo)致受體功能增強(qiáng)。而 S573F、S1271L 及 R1313W 的谷氨酸、甘氨酸和 D-絲氨酸的效能降低 1.5～3 倍，氫離子敏感性與野生型相比并無顯著改變，通道開放率降低 2.2～4.3 倍，導(dǎo)致受體功能下降。6 種新變異均會(huì)導(dǎo)致 HEK293 細(xì)胞中 GluN2D 亞基的表達(dá)量下降。為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療，本研究還在爪哇蟾蜍卵上針對(duì)導(dǎo)致受體電生理功能增強(qiáng)的 3 個(gè)突變 L670F、A675T 和 A678D 進(jìn)行了 FDA 批準(zhǔn)上市的受體阻滯劑（Memantine、Dextromethorphan、Dextrorphan 和 Ketamine）的效能評(píng)估。全部 4 種 NMDA 受體通道阻滯劑均能在不同程度上抑制野生型及突變型的 GluN2D 受體。但 4 種藥物對(duì) L670F 和 A675T 突變受體的敏感性與野生型相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示 4 種藥物如用于突變患者，所需劑量將遠(yuǎn)高于未突變患者；A678D 突變受體除 Memantine 外的 3 種藥物的敏感性及最大劑量下的電流抑制率與野生型受體相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示如常規(guī)抗癲癇藥物無法控制 A678D 突變患者的癲癇發(fā)作，則 Dextromethorphan 及 Ketamine 可作為其臨床個(gè)體化治療的備選藥物。
結(jié)論 GRIN2D 基因變異可直接影響 GluN2D 亞基的電生理特性及通道表達(dá)，導(dǎo)致受體功能增強(qiáng)或功能降低，影響腦網(wǎng)絡(luò)的興奮和抑制平衡，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育性癲癇腦病表型的產(chǎn)生。針對(duì)突變進(jìn)行 FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)上市的 NMDA 受體激動(dòng)劑或阻滯劑的篩選將為突變相關(guān)患者臨床個(gè)體化治療提供依據(jù)。
摘譯自 XiangWei WX，Kannan V，Xu YC，et al. Heterogeneous clinical and functional features of GRIN2D-related developmental and epileptic encephalopathy. Brain，2019，142（10）：3009-3027.
背景 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體是一類重要的離子型谷氨酸受體，主要表達(dá)于神經(jīng)元的突觸后膜，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞中的慢鈣電流成分，與學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性等生理功能及癲癇、發(fā)育遲緩、精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病有關(guān)。GRIN2D 主要表達(dá)于胎兒時(shí)期及生后早期，其編碼的 GluN2D 亞基既往曾報(bào)道與早發(fā)癲癇性腦?。‥arly infantile epileptic encephalopathy，EIEE）高度相關(guān)，但目前 GRIN2D 變異的相關(guān)功能研究較少、致病機(jī)制尚不明確。
方法 收集特發(fā)性癲癇伴智力障礙/發(fā)育遲緩患者及其父母的血液，采用二代測(cè)序靶向捕獲或全外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè) DNA 序列的變化，獲取患者可疑的致病性基因變異，利用 Sanger 測(cè)序進(jìn)行家系驗(yàn)證；采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建 GRIN2D 突變載體，體外合成 cRNA，顯微注射表達(dá)于非洲爪哇蟾蜍卵母細(xì)胞，同時(shí)使用 cDNA 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞系，利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)突變受體的功能變化；采用 β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因，檢測(cè)受體蛋白表達(dá)量變化；利用帶有 GFP 標(biāo)簽的載體，轉(zhuǎn)染大鼠原代神經(jīng)元并使用 NMDA 受體抑制劑 Memantine 進(jìn)行處理，利用免疫熒光觀察 GRIN2D 突變對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致功能增強(qiáng)的變異，檢測(cè)其對(duì)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的 NMDA 受體抑制劑的敏感性。
結(jié)果 研究共收集了來自中國(guó)、美國(guó)、歐洲及中東等地區(qū)的 8 例攜帶 GRIN2D 基因變異的患者，年齡為 9 個(gè)月～34 歲，男性、女性患者各 4 例，均無明確神經(jīng)系統(tǒng)疾病家族史及圍產(chǎn)期病史。87.5% 的患者癲癇起病年齡在 1 歲以內(nèi)，均為藥物難治性癲癇，發(fā)作形式以痙攣發(fā)作為主，部分患者隨著病情發(fā)展逐漸出現(xiàn)其他發(fā)作形式，如局灶發(fā)作伴泛化、失張力發(fā)作、肌陣攣發(fā)作等。所有患者均有不同程度的智力障礙/發(fā)育遲滯，部分患者出現(xiàn)肌張力異常、運(yùn)動(dòng)障礙、喂養(yǎng)困難、睡眠障礙及早亡。8 例患者共攜帶 7 種不同的 GRIN2D 變異位點(diǎn)，包括 S573F、L670F、V667I、A675T、A678D、S1271L 及 R1313W。除 V667I 為既往已報(bào)道的功能獲得型變異外，其余均為既往未見報(bào)道的新變異。對(duì)基因的保守性及變異頻率進(jìn)行分析，71%（5/7）的突變位于突變高度不耐受區(qū)域，S573F 位于 GluN2D 蛋白的 pre-M1 功能域，L670F、V667I、A675T 及 A678D 位于 M3 功能域，均直接參與 NMDA 受體通道孔的形成；S1271L 和 R1313W 位于 GluN2D 蛋白的胞內(nèi)段，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體上膜直接相關(guān)。膜片鉗的結(jié)果顯示，L670F、A675T 及 A678D 對(duì) NMDA 受體激動(dòng)劑谷氨酸、甘氨酸及 D-絲氨酸的 EC50 下降 2.8～19 倍，NMDA 受體抑制劑氫離子的敏感性降低至野生型的 1/3～1/2，提高通道開放率 29～52 倍，導(dǎo)致受體功能增強(qiáng)。而 S573F、S1271L 及 R1313W 的谷氨酸、甘氨酸和 D-絲氨酸的效能降低 1.5～3 倍，氫離子敏感性與野生型相比并無顯著改變，通道開放率降低 2.2～4.3 倍，導(dǎo)致受體功能下降。6 種新變異均會(huì)導(dǎo)致 HEK293 細(xì)胞中 GluN2D 亞基的表達(dá)量下降。為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療，本研究還在爪哇蟾蜍卵上針對(duì)導(dǎo)致受體電生理功能增強(qiáng)的 3 個(gè)突變 L670F、A675T 和 A678D 進(jìn)行了 FDA 批準(zhǔn)上市的受體阻滯劑（Memantine、Dextromethorphan、Dextrorphan 和 Ketamine）的效能評(píng)估。全部 4 種 NMDA 受體通道阻滯劑均能在不同程度上抑制野生型及突變型的 GluN2D 受體。但 4 種藥物對(duì) L670F 和 A675T 突變受體的敏感性與野生型相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示 4 種藥物如用于突變患者，所需劑量將遠(yuǎn)高于未突變患者；A678D 突變受體除 Memantine 外的 3 種藥物的敏感性及最大劑量下的電流抑制率與野生型受體相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示如常規(guī)抗癲癇藥物無法控制 A678D 突變患者的癲癇發(fā)作，則 Dextromethorphan 及 Ketamine 可作為其臨床個(gè)體化治療的備選藥物。
結(jié)論 GRIN2D 基因變異可直接影響 GluN2D 亞基的電生理特性及通道表達(dá)，導(dǎo)致受體功能增強(qiáng)或功能降低，影響腦網(wǎng)絡(luò)的興奮和抑制平衡，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育性癲癇腦病表型的產(chǎn)生。針對(duì)突變進(jìn)行 FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)上市的 NMDA 受體激動(dòng)劑或阻滯劑的篩選將為突變相關(guān)患者臨床個(gè)體化治療提供依據(jù)。
摘譯自 XiangWei WX，Kannan V，Xu YC，et al. Heterogeneous clinical and functional features of GRIN2D-related developmental and epileptic encephalopathy. Brain，2019，142（10）：3009-3027.