【摘 要】 目的 通過引入內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES），構建帶有hVEGF165 及
hBMP-7 雙基因的重組腺相關病毒載體（adeno-associated virus，AAV），并對其進行鑒定。 方法 以AAV 腺相關病毒
包裝系統(tǒng)（helper-free system）為基礎，將真核表達質(zhì)粒pIRES 中的IRES 片段定向克隆至腺相關病毒骨架質(zhì)粒pAAVMCS
中，形成含有IRES 序列及上、下游多克隆位點的重組骨架質(zhì)粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR 擴增hVEGF165 和
hBMP-7 基因，先后亞克隆入重組腺相關病毒骨架質(zhì)粒IRES 序列上、下游的多克隆位點，獲得重組質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-
IRES-hBMP-7。將其和包裝質(zhì)粒pAAV-RC、輔助質(zhì)粒pHelper 三質(zhì)粒共轉染AAV-293 細胞，包裝重組腺相關病毒rAAVhVEGF165-IRES-hBMP-7，同時包裝含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的重組病毒rAAV-IRES-GFP作平行對照。熒光顯微鏡下監(jiān)測病毒包裝效率，收獲重組病毒后感染AAV-HT1080 細胞測定病毒滴度，并通過病毒基因
組外源基因擴增鑒定重組病毒的包裝是否成功。 結果 重組腺相關病毒骨架質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 經(jīng)
雙酶切鑒定正確。熒光顯微鏡下觀察三質(zhì)粒共轉染AAV-293 細胞72 h 后，病毒包裝效率達95% ～ 100%，收獲的重組病
毒具有較高濃度及活性，感染AAV-HT1080 效率達90%，熒光計數(shù)法測定病毒感染滴度達5.5 × 1011 vp/mL。提取重組病
毒基因組成功擴增出外源目的基因hVEGF165 及hBMP-7 片段，重組病毒包裝成功。 結論 成功構建帶有hVEGF165 及
hBMP-7 雙基因的重組腺相關病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收獲的病毒具有較高滴度，為今后利用腺相關病毒載體
進行hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達影響骨修復的體外及體內(nèi)研究提供實驗基礎。
引用本文： 黃向輝,時志斌,王坤正,黨曉謙,楊佩,余鵬博. hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達腺相關病毒載體的構建及鑒定. 中國修復重建外科雜志, 2008, 22(7): 807-813. doi: 復制