引用本文： 杜敏, 魏维, 周光红, 黄静, 王玉霞, 龙怀聪. Th2倾向型典型哮喘与咳嗽变异性哮喘外周血单个核细胞基因表达谱的差异性研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2023, 22(6): 395-402. doi: 10.7507/1671-6205.202304060 复制
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性气道炎症性疾病，常见症状包括咳嗽、喘息、胸闷和呼吸短促[1]。哮喘的患病率在全球范围内呈上升趋势，目前全球哮喘患者已超过3亿，每年约有38万人死于哮喘[2]。大约4000万中国人患有哮喘，我国一项横断面研究显示，从2010年—2012年，成年人哮喘患病率从1.24%上升到4.2%[3]。尽管成人哮喘控制率从2008年的28.7%上升到2019年的39.2%[4]，但一些哮喘患者仍然没有得到充分的诊断和治疗。哮喘已成为严重危害患者健康的公共卫生问题，给患者带来巨大的心理和经济负担[5]。咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是哮喘常见的表型之一。约30%～40%未经标准治疗的CVA患者会在3～4年内发展为典型哮喘（classical asthma，CA），因此CVA被认为是哮喘[6]的早期阶段。研究发现CVA的发病机制与CA相似，两者均涉及多种细胞的慢性气道炎症，似乎有共同的炎症模式[7]，CVA发展为CA也被认为是一个自然过程[8]。大多数关于哮喘和CVA的研究都集中在气道炎症、气道功能和治疗方面，很少有在基因表达水平上研究两者的差异。我们推测，对CA和CVA的差异基因表达研究对进一步明确哮喘的发病机制有重要意义。在本研究中，我们收集了门诊的CA和CVA患者，通过全长转录组测序技术检测患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） mRNA的基因表达谱，筛选差异基因，并进一步进行RT-PCR验证。通过差异基因分析，预测可能与CVA发展为CA相关的基因和途径。
1 资料与方法
1.1 临床资料
采用横断面研究，收集2018年6月1日—2019年12月31日在四川省人民医院呼吸与危重症医学科门诊就诊的CA和CVA患者。健康对照组从我院体检中心招募。收集受试者年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、呼出气一氧化氮分数（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）、血清IgE和呼气峰值流量（peak expiratory flow，PEF）等临床特征。CA的诊断标准来自2018年版全球哮喘防治创议[9]。CVA的诊断标准为：咳嗽为唯一症状或主要症状，无典型哮喘表现如气喘、胸闷等；通常表现为干咳或咳出少量清痰，主要在夜间发生；气道高反应性测试阳性；排除其他原因的咳嗽。纳入标准：年龄在20～65岁；符合CA和CVA诊断标准；无吸烟史；4周内未口服或静脉注射糖皮质激素，未采用免疫疗法和生物疗法；4周内无急性呼吸道感染史；同意参与这项研究。排除标准：重度哮喘患者；合并内分泌代谢性疾病、高血压等与遗传相关的疾病和其他呼吸道疾病（如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺结核等）；妊娠、哺乳期。本研究得到了四川省人民医院伦理委员会批准（批准文号：2017年103号），所有参与者签署书面知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 炎症表型
采用血清IgE和FeNO评估患者气道炎症。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb[10-12]为条件进一步筛选CA或CVA患者，并将其定义为Th2倾向型哮喘。
1.2.2 PBMC分离和RNA提取
乙二胺四乙酸抗凝管（6 mL）收集外周血。用淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque，北京康为世纪生物科技有限公司）在2 h内分离出PBMC。总RNA提取按照生产厂家（北京康为世纪生物科技有限公司）的说明书使用Trizol试剂进行。用Nanodrop检测提取RNA的纯度，RNA储存在–80 ℃的冰箱中，以便进一步分析。
1.2.3 全长转录组测序和数据分析
基因全长转录组测序分析由北京百迈客生物科技有限公司协助完成。P<0.05和fold change（FC）≥1.5被认为是差异表达基因（ differentially expressed genes，DEGs），利用基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对生物过程进行分析并筛选差异基因。将筛选的差异基因输入STRING数据库，确定差异基因对应蛋白之间可能存在的相互作用关系，构建蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络结构图。应用Cytoscope中的CytoNCA插件对中间中心进行排序为标准，选择前1/4个基因，通过MCODE插件Cytoscope识别PPI网络中最关键的模块。
1.2.4 RT-PCR验证差异基因表达
选择DEGs并设计相应引物，利用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测差异基因mRNA表达。使用Aidlab的TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit进行反转录，获得cDNA，并将其作为模板，使用实时PCR仪（analytikjena-Easycycl，德国）根据PCR扩增试剂盒说明书对PBMC的mRNA样本进行扩增。PCR反应参数为：95 ℃，3 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，连续39个循环，样品设置3个平行重复孔。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参，用2–△△Ct计算各靶点的相对基因表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 23.0统计软件。计量资料符合正态分布的以均数±标准差（
±s）表示，正态分布的数据组间比较采用单因素方差分析，利用Bonferroni进行校正，多重比较中检验水准α=0.05/比较次数。不符合正态分布的数据采用中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用非参数独立样本Kruskal-Wallis H检验；计数资料采用例数表示，组间比较采用χ2检验。利用Wallenius非中心超几何分布的GOseq R包（4.3版本）进行DEGs的基因本体富集分析，应用KOBAS[13]软件对差异基因进行KEGG统计富集分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
31例哮喘患者和7例HC的临床特征见表1。31例哮喘患者中，CA组20例，CVA组11例。CA、CVA和HC组在性别、年龄、BMI和PEF均无显著差异（P>0.05）。CA和CVA组IgE、FeNO水平明显高于HC组（P<0.05），而CA组与CVA组间差异无统计学意义（P>0.05）。CA组血液嗜酸性粒细胞计数高于HC组，但CVA与HC和CA组间无明显差异（P>0.05）。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb为条件筛选出Th2倾向型CA患者9例，Th2倾向型CVA患者5例。
表1
受试者入组时的临床特征［（
）/例/M（P25，P75）］
2.2 差异基因分析
在基因表达水平上，CA组和CVA组之间有177个DEGs，其中上调基因94个，下调基因83个。CA组与HC组之间共存在949个DEGs，其中上调基因478个，下调基因471个。CVA组与HC组比较，有532个DEGs，其中290个基因上调，242个基因下调。进一步分组分析，Th2倾向型CA组与Th2倾向型CVA组之间共存在300个差异表达，其中155个（52%）基因相对上调，145个（48%）基因相对下调。与HC组相比，Th2倾向型CA组有832个DEGs，其中385个（46%）相对上调，447个（51%）相对下调。与HC组相比，Th2倾向型CVA组有275个（48%）基因相对表达上调，296个（52%）基因相对表达下调。结果见图1。
图1
三组间DEGs火山图
a. Th2倾向型CA组与Th2倾向型CVA组；b. Th2倾向型CA组与HC组；c. Th2倾向型CVA组与HC组。红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示无差异基因。
2.3 GO富集分析
基因差异表达的GO注释主要包括生物过程、细胞组分和分子功能。HC与Th2倾向型CA之间生物过程DEGs主要富集于有机氮化合物合成、主动脉发育和药物反应；细胞组分DEGs主要富集在细胞质中；分子功能DEGs主要富集在ATP结合等活性分子功能中。在Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间的生物过程中，DEGs主要富集在药物反应和氮化合物生物合成；细胞组分DEGs主要富集在细胞质基质、细胞质等部位；分子功能DEGs主要富集在蛋白结合、ATP结合等活性分子功能中。在HC和Th2倾向型CVA生物过程DEGs主要富集在上皮细胞迁移和药物反应的正向调控中，细胞组分的DEGs主要富集在细胞质中；分子功能DEGs主要富集在活性分子功能中，如ATP结合分子功能。结果如图2所示。
图2
三组间GO注释图比较
a. Th2倾向型CA组和Th2倾向型CVA组；b. Th2倾向型CA组和HC组；c. Th2倾向型CVA组和HC组。直方图颜色表示GO功能分类，红色代表生物过程，黄色代表细胞组分，蓝色代表分子功能；y轴为GO项；x轴表示–log10（KS），KS是Kolmogorov-Smirnov检验（KS test）得到的
2.4 KEGG通路分析
KEGG分析显示，Th2倾向型CA与Th2倾向型CVA的DEGs主要富集在2-氧羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路中，Th2倾向型CA与HC的DEGs主要富集在血管平滑肌收缩等信号通路中，Th2倾向型CVA与HC的DEGs主要富集在其他类型的o-聚糖生物合成中。结果如图3所示。
图3
三组间DEGsKEGG通路富集散点图比较
a. Th2倾向型CA组与Th2倾向型CVA组；b. Th2倾向型CA组与HC组；c. Th2倾向型CVA组与HC组。图中每一个圆表示一个KEGG通路，纵坐标表示通路名称，横坐标为富集因子，表示差异基因中注释到某通路的基因比例与所有基因中注释到该通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示DEGs在该通路中的富集水平越显著。圆圈的颜色代表
2.5 PPI 网络分析
将差异基因输入STRING数据库（版本11.5），构建中等置信度（相互作用得分0.40）的PPI网络，删除边缘处的非相互作用蛋白。PPI网络分析结果表明，不同基因之间存在复杂的相互关系，不同基因之间存在广泛的蛋白质相互作用。不同基因相关的关键模块包括GZMB、TBX21、RUNX3、IL2RB、B3GAT1、PPBP、IFIT1、IFIT3、IFIT4、IFIT2、TNFSF10、TLR2、CCR2、CD69、XAF1、CCRL2、PRF1基因（图4）。结合GO、KEGG、PPI分析，筛选出高表达、显著富集的差异基因和蛋白–蛋白相互作用密集的基因，从中筛选了10个DEGs（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）作为候选基因，通过后续实时PCR进行验证，引物设计见表2。
图4
PPI分析图
a. 顺序基于Betweenness Centralit值，红色表示Betweenness Centralit值的前四分之一；b. . PPI网络分析中最关键的模块，包括17个节点和60边。
表2
10个候选基因实时PCR检测引物列表
2.6 候选DEGs的RT-PCR验证
RT-PCR结果显示，PBMC中CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X的表达在Th2倾向型CA组和Th2倾向型CVA组，以及Th2倾向型CA组和HC组之间存在显著差异（P<0.05），表达量上调。PF4在PBMC中的表达仅在Th2倾向型CA组和HC组之间差异有统计学意义（P<0.05）。HLA-A、DUSP2、CCR2在Th2倾向型CA组、Th2倾向型CVA组和HC组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。
表3
各组候选基因相对表达量比较（
）
3 讨论
哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，本质上是慢性气道炎症。哮喘的生理特征主要表现为气道高反应性和气道重塑。近几十年来，人们进行了大量的基础和临床研究，以发现哮喘发生发展的原因和潜在机制，但其发病机制尚未明确，哮喘发病率居高不下。研究表明哮喘是一种表型不同的异质性疾病，Th2型哮喘是哮喘最重要的表型之一，占成人哮喘的60%以上[14]。CVA是一种非典型哮喘，其发病机制与CA相似，可能受Th2细胞的影响，Th1/Th2免疫失衡也与CVA的发生有关[15]。CVA被认为是哮喘的早期阶段，30%～40%的CVA病例未经标准化治疗会在3～4年内发展为CA，但其发病机制尚不清楚，环境因素和遗传因素可促进哮喘的发生。
在本研究中，我们使用三代全长转录组测序分析，发现Th2倾向型CA、Th2倾向型CVA和HC的PBMC基因表达谱存在显著差异。Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间共筛选出300个DEGs，其中155个相对表达水平上调，145个相对表达水平下调。GO功能富集分析表明，Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA的DEGs与药物反应、氮化合物生物合成、细胞质基质、细胞质、蛋白质结合、ATP结合等生物学过程密切相关。KEGG通路主要富集在2-羟基羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等信号通路中。通过GO、KEGG和PPI分析筛选出10个候选基因（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）。我们通过RT-PCR验证候选基因的结果，发现CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X在Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间存在显著差异，且在Th2倾向型CA表达水平上调明显高于Th2倾向型CVA。
病理生理改变如支气管炎、平滑肌痉挛和气道黏液分泌增加已在Th2型哮喘中显示出来，通常由Th2细胞释放的白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13引起。IL-5参与嗜酸性粒细胞进入气道的激活和迁移，并引发嗜酸性气道炎症[16]。IL-13在黏液高分泌和气道高反应性中起主要作用。IL-4诱导B细胞IgE同型转换，上调靶细胞表面高亲和IgE受体（FcεRI）。肥大细胞在质膜表面的FcεRI结合IgE的过敏诱导交联后被激活。肥大细胞释放组胺和其他介质，导致过敏症状[17]。Th2免疫应答是哮喘病理生理的主要因素，也受多种信号通路的调控，如PGD2-CRTH2、Wnt/β-catenin-FAM13A和JNK-Gal-7[18]。先天淋巴细胞在免疫应答中起保护作用，NK细胞是先天淋巴细胞家族的成员，NK细胞在调节过敏性气道炎症中起关键作用，NK细胞的数量与哮喘的严重程度相关，NK细胞可以通过两种不同的途径介导其细胞毒活性[19]。它们可以释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒颗粒，或在病变细胞表面分别表达TRAIL或Fas配体与TRAIL-r1/-R2或CD95/Fas结合，诱导死亡受体介导的凋亡[20]。研究发现哮喘患者与健康对照组的痰代谢谱存在差异，这些不同的代谢物主要涉及甘油磷脂代谢、2-氧羧酸代谢和氨基酸生物合成等代谢途径[21]。在本研究中，我们发现Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间的DEGs主要富集在2-氧羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒信号转导通路中，提示上述信号通路可能与其差异有关。
簇集蛋白（clusterin，CLU）是一种敏感的氧化应激细胞生物传感器，广泛参与免疫调节、细胞粘附、细胞-细胞相互作用、细胞分化和转化调节、细胞周期调节、DNA修复等重要生物活动，被认为是氧化应激的指标。既往研究表明，哮喘患者的血清和痰中CLU水平升高[22]。血清CLU水平与哮喘严重程度呈正相关，哮喘越严重，血清CLU水平越高；CLU也被认为是哮喘患者哮喘严重程度和氧化应激的生物标志物[23]。本研究中，与Th2倾向型CVA相比，Th2倾向型CA的CLU表达明显上调，Th2倾向型CVA的CLU表达较HC组增加。Th2倾向型CA的发病机制可能与CLU有关，为CVA在遗传水平上是哮喘的早期阶段提供了有利的证据。PTGS1基因位于染色体9q32-q33.3上，全长约22 kb，编码环氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）。环氧化酶是一种催化前列腺素生物合成的关键酶，也是哮喘炎症的重要中介因子。研究表明，PTGS1基因变异与哮喘之间存在关联[24]。颗粒酶B（granzyme B，GZMB）是一种28 kDa丝氨酸蛋白酶，被认为局限于淋巴系，是颗粒介导的细胞毒性的主要效应物[25]。GZMB和IL-13能够同时诱导嗜碱性粒细胞，并且发现支气管肺泡灌洗液中的两种介质在哮喘过敏性反应晚期患者中高度相关。GZMB被认为是一种新的嗜碱性粒细胞来源的过敏性炎症介质[25]。穿孔蛋白1（pore forming protein，PRF1）属于膜攻击复合物/PRF（MACPF）蛋白家族，主要参与细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的颗粒依赖性杀伤活性，可作为具有杀伤能力的免疫细胞的明确标志物[26]。PRF1参与免疫和炎症介导疾病的发病机制。TMSB4X基因编码一种肌动蛋白螯合蛋白，该蛋白在调节肌动蛋白聚合中起作用，也参与细胞增殖、迁移和分化[27]，目前还没有研究表明其与哮喘有关。
我们的研究存在以下局限性：（1）因目前对Th2型炎症未形成统一的诊断标准，故本文查阅文献筛选出了二个节点值定义为Th2型倾向型；（2）因为CVA患者通常很少，导致本研究中Th2倾向型CVA亚组样本量相对较小；（3）虽然我们使用FeNO等指标来区分气道炎症，但没有使用诱导痰检查来进一步鉴别气道炎症的亚型。
综上所述，我们发现6个关键基因CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1和TMSB4X在Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间存在差异表达，这些DEGs主要富集在2-氧羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路中。本研究发现的基因可能预测哮喘分子水平的亚型变化，并与CVA向CA的进展有关，但CVA向CA进展的具体机制尚需进一步阐明。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的慢性气道炎症性疾病，常见症状包括咳嗽、喘息、胸闷和呼吸短促[1]。哮喘的患病率在全球范围内呈上升趋势，目前全球哮喘患者已超过3亿，每年约有38万人死于哮喘[2]。大约4000万中国人患有哮喘，我国一项横断面研究显示，从2010年—2012年，成年人哮喘患病率从1.24%上升到4.2%[3]。尽管成人哮喘控制率从2008年的28.7%上升到2019年的39.2%[4]，但一些哮喘患者仍然没有得到充分的诊断和治疗。哮喘已成为严重危害患者健康的公共卫生问题，给患者带来巨大的心理和经济负担[5]。咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是哮喘常见的表型之一。约30%～40%未经标准治疗的CVA患者会在3～4年内发展为典型哮喘（classical asthma，CA），因此CVA被认为是哮喘[6]的早期阶段。研究发现CVA的发病机制与CA相似，两者均涉及多种细胞的慢性气道炎症，似乎有共同的炎症模式[7]，CVA发展为CA也被认为是一个自然过程[8]。大多数关于哮喘和CVA的研究都集中在气道炎症、气道功能和治疗方面，很少有在基因表达水平上研究两者的差异。我们推测，对CA和CVA的差异基因表达研究对进一步明确哮喘的发病机制有重要意义。在本研究中，我们收集了门诊的CA和CVA患者，通过全长转录组测序技术检测患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） mRNA的基因表达谱，筛选差异基因，并进一步进行RT-PCR验证。通过差异基因分析，预测可能与CVA发展为CA相关的基因和途径。
1 资料与方法
1.1 临床资料
采用横断面研究，收集2018年6月1日—2019年12月31日在四川省人民医院呼吸与危重症医学科门诊就诊的CA和CVA患者。健康对照组从我院体检中心招募。收集受试者年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、呼出气一氧化氮分数（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）、血清IgE和呼气峰值流量（peak expiratory flow，PEF）等临床特征。CA的诊断标准来自2018年版全球哮喘防治创议[9]。CVA的诊断标准为：咳嗽为唯一症状或主要症状，无典型哮喘表现如气喘、胸闷等；通常表现为干咳或咳出少量清痰，主要在夜间发生；气道高反应性测试阳性；排除其他原因的咳嗽。纳入标准：年龄在20～65岁；符合CA和CVA诊断标准；无吸烟史；4周内未口服或静脉注射糖皮质激素，未采用免疫疗法和生物疗法；4周内无急性呼吸道感染史；同意参与这项研究。排除标准：重度哮喘患者；合并内分泌代谢性疾病、高血压等与遗传相关的疾病和其他呼吸道疾病（如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺结核等）；妊娠、哺乳期。本研究得到了四川省人民医院伦理委员会批准（批准文号：2017年103号），所有参与者签署书面知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 炎症表型
采用血清IgE和FeNO评估患者气道炎症。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb[10-12]为条件进一步筛选CA或CVA患者，并将其定义为Th2倾向型哮喘。
1.2.2 PBMC分离和RNA提取
乙二胺四乙酸抗凝管（6 mL）收集外周血。用淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque，北京康为世纪生物科技有限公司）在2 h内分离出PBMC。总RNA提取按照生产厂家（北京康为世纪生物科技有限公司）的说明书使用Trizol试剂进行。用Nanodrop检测提取RNA的纯度，RNA储存在–80 ℃的冰箱中，以便进一步分析。
1.2.3 全长转录组测序和数据分析
基因全长转录组测序分析由北京百迈客生物科技有限公司协助完成。P<0.05和fold change（FC）≥1.5被认为是差异表达基因（ differentially expressed genes，DEGs），利用基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对生物过程进行分析并筛选差异基因。将筛选的差异基因输入STRING数据库，确定差异基因对应蛋白之间可能存在的相互作用关系，构建蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络结构图。应用Cytoscope中的CytoNCA插件对中间中心进行排序为标准，选择前1/4个基因，通过MCODE插件Cytoscope识别PPI网络中最关键的模块。
1.2.4 RT-PCR验证差异基因表达
选择DEGs并设计相应引物，利用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测差异基因mRNA表达。使用Aidlab的TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit进行反转录，获得cDNA，并将其作为模板，使用实时PCR仪（analytikjena-Easycycl，德国）根据PCR扩增试剂盒说明书对PBMC的mRNA样本进行扩增。PCR反应参数为：95 ℃，3 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，连续39个循环，样品设置3个平行重复孔。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参，用2–△△Ct计算各靶点的相对基因表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 23.0统计软件。计量资料符合正态分布的以均数±标准差（±s）表示，正态分布的数据组间比较采用单因素方差分析，利用Bonferroni进行校正，多重比较中检验水准α=0.05/比较次数。不符合正态分布的数据采用中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用非参数独立样本Kruskal-Wallis H检验；计数资料采用例数表示，组间比较采用χ2检验。利用Wallenius非中心超几何分布的GOseq R包（4.3版本）进行DEGs的基因本体富集分析，应用KOBAS[13]软件对差异基因进行KEGG统计富集分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料
31例哮喘患者和7例HC的临床特征见表1。31例哮喘患者中，CA组20例，CVA组11例。CA、CVA和HC组在性别、年龄、BMI和PEF均无显著差异（P>0.05）。CA和CVA组IgE、FeNO水平明显高于HC组（P<0.05），而CA组与CVA组间差异无统计学意义（P>0.05）。CA组血液嗜酸性粒细胞计数高于HC组，但CVA与HC和CA组间无明显差异（P>0.05）。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb为条件筛选出Th2倾向型CA患者9例，Th2倾向型CVA患者5例。
表1
受试者入组时的临床特征［（）/例/M（P25，P75）］
2.2 差异基因分析
在基因表达水平上，CA组和CVA组之间有177个DEGs，其中上调基因94个，下调基因83个。CA组与HC组之间共存在949个DEGs，其中上调基因478个，下调基因471个。CVA组与HC组比较，有532个DEGs，其中290个基因上调，242个基因下调。进一步分组分析，Th2倾向型CA组与Th2倾向型CVA组之间共存在300个差异表达，其中155个（52%）基因相对上调，145个（48%）基因相对下调。与HC组相比，Th2倾向型CA组有832个DEGs，其中385个（46%）相对上调，447个（51%）相对下调。与HC组相比，Th2倾向型CVA组有275个（48%）基因相对表达上调，296个（52%）基因相对表达下调。结果见图1。
图1
三组间DEGs火山图
a. Th2倾向型CA组与Th2倾向型CVA组；b. Th2倾向型CA组与HC组；c. Th2倾向型CVA组与HC组。红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示无差异基因。
2.3 GO富集分析
基因差异表达的GO注释主要包括生物过程、细胞组分和分子功能。HC与Th2倾向型CA之间生物过程DEGs主要富集于有机氮化合物合成、主动脉发育和药物反应；细胞组分DEGs主要富集在细胞质中；分子功能DEGs主要富集在ATP结合等活性分子功能中。在Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间的生物过程中，DEGs主要富集在药物反应和氮化合物生物合成；细胞组分DEGs主要富集在细胞质基质、细胞质等部位；分子功能DEGs主要富集在蛋白结合、ATP结合等活性分子功能中。在HC和Th2倾向型CVA生物过程DEGs主要富集在上皮细胞迁移和药物反应的正向调控中，细胞组分的DEGs主要富集在细胞质中；分子功能DEGs主要富集在活性分子功能中，如ATP结合分子功能。结果如图2所示。
图2
三组间GO注释图比较
a. Th2倾向型CA组和Th2倾向型CVA组；b. Th2倾向型CA组和HC组；c. Th2倾向型CVA组和HC组。直方图颜色表示GO功能分类，红色代表生物过程，黄色代表细胞组分，蓝色代表分子功能；y轴为GO项；x轴表示–log10（KS），KS是Kolmogorov-Smirnov检验（KS test）得到的
2.4 KEGG通路分析
KEGG分析显示，Th2倾向型CA与Th2倾向型CVA的DEGs主要富集在2-氧羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路中，Th2倾向型CA与HC的DEGs主要富集在血管平滑肌收缩等信号通路中，Th2倾向型CVA与HC的DEGs主要富集在其他类型的o-聚糖生物合成中。结果如图3所示。
图3
三组间DEGsKEGG通路富集散点图比较
a. Th2倾向型CA组与Th2倾向型CVA组；b. Th2倾向型CA组与HC组；c. Th2倾向型CVA组与HC组。图中每一个圆表示一个KEGG通路，纵坐标表示通路名称，横坐标为富集因子，表示差异基因中注释到某通路的基因比例与所有基因中注释到该通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示DEGs在该通路中的富集水平越显著。圆圈的颜色代表
2.5 PPI 网络分析
将差异基因输入STRING数据库（版本11.5），构建中等置信度（相互作用得分0.40）的PPI网络，删除边缘处的非相互作用蛋白。PPI网络分析结果表明，不同基因之间存在复杂的相互关系，不同基因之间存在广泛的蛋白质相互作用。不同基因相关的关键模块包括GZMB、TBX21、RUNX3、IL2RB、B3GAT1、PPBP、IFIT1、IFIT3、IFIT4、IFIT2、TNFSF10、TLR2、CCR2、CD69、XAF1、CCRL2、PRF1基因（图4）。结合GO、KEGG、PPI分析，筛选出高表达、显著富集的差异基因和蛋白–蛋白相互作用密集的基因，从中筛选了10个DEGs（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）作为候选基因，通过后续实时PCR进行验证，引物设计见表2。
图4
PPI分析图
a. 顺序基于Betweenness Centralit值，红色表示Betweenness Centralit值的前四分之一；b. . PPI网络分析中最关键的模块，包括17个节点和60边。
表2
10个候选基因实时PCR检测引物列表
2.6 候选DEGs的RT-PCR验证
RT-PCR结果显示，PBMC中CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X的表达在Th2倾向型CA组和Th2倾向型CVA组，以及Th2倾向型CA组和HC组之间存在显著差异（P<0.05），表达量上调。PF4在PBMC中的表达仅在Th2倾向型CA组和HC组之间差异有统计学意义（P<0.05）。HLA-A、DUSP2、CCR2在Th2倾向型CA组、Th2倾向型CVA组和HC组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。
表3
各组候选基因相对表达量比较（）
3 讨论
哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，本质上是慢性气道炎症。哮喘的生理特征主要表现为气道高反应性和气道重塑。近几十年来，人们进行了大量的基础和临床研究，以发现哮喘发生发展的原因和潜在机制，但其发病机制尚未明确，哮喘发病率居高不下。研究表明哮喘是一种表型不同的异质性疾病，Th2型哮喘是哮喘最重要的表型之一，占成人哮喘的60%以上[14]。CVA是一种非典型哮喘，其发病机制与CA相似，可能受Th2细胞的影响，Th1/Th2免疫失衡也与CVA的发生有关[15]。CVA被认为是哮喘的早期阶段，30%～40%的CVA病例未经标准化治疗会在3～4年内发展为CA，但其发病机制尚不清楚，环境因素和遗传因素可促进哮喘的发生。
在本研究中，我们使用三代全长转录组测序分析，发现Th2倾向型CA、Th2倾向型CVA和HC的PBMC基因表达谱存在显著差异。Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间共筛选出300个DEGs，其中155个相对表达水平上调，145个相对表达水平下调。GO功能富集分析表明，Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA的DEGs与药物反应、氮化合物生物合成、细胞质基质、细胞质、蛋白质结合、ATP结合等生物学过程密切相关。KEGG通路主要富集在2-羟基羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等信号通路中。通过GO、KEGG和PPI分析筛选出10个候选基因（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）。我们通过RT-PCR验证候选基因的结果，发现CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X在Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间存在显著差异，且在Th2倾向型CA表达水平上调明显高于Th2倾向型CVA。
病理生理改变如支气管炎、平滑肌痉挛和气道黏液分泌增加已在Th2型哮喘中显示出来，通常由Th2细胞释放的白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13引起。IL-5参与嗜酸性粒细胞进入气道的激活和迁移，并引发嗜酸性气道炎症[16]。IL-13在黏液高分泌和气道高反应性中起主要作用。IL-4诱导B细胞IgE同型转换，上调靶细胞表面高亲和IgE受体（FcεRI）。肥大细胞在质膜表面的FcεRI结合IgE的过敏诱导交联后被激活。肥大细胞释放组胺和其他介质，导致过敏症状[17]。Th2免疫应答是哮喘病理生理的主要因素，也受多种信号通路的调控，如PGD2-CRTH2、Wnt/β-catenin-FAM13A和JNK-Gal-7[18]。先天淋巴细胞在免疫应答中起保护作用，NK细胞是先天淋巴细胞家族的成员，NK细胞在调节过敏性气道炎症中起关键作用，NK细胞的数量与哮喘的严重程度相关，NK细胞可以通过两种不同的途径介导其细胞毒活性[19]。它们可以释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒颗粒，或在病变细胞表面分别表达TRAIL或Fas配体与TRAIL-r1/-R2或CD95/Fas结合，诱导死亡受体介导的凋亡[20]。研究发现哮喘患者与健康对照组的痰代谢谱存在差异，这些不同的代谢物主要涉及甘油磷脂代谢、2-氧羧酸代谢和氨基酸生物合成等代谢途径[21]。在本研究中，我们发现Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间的DEGs主要富集在2-氧羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒信号转导通路中，提示上述信号通路可能与其差异有关。
簇集蛋白（clusterin，CLU）是一种敏感的氧化应激细胞生物传感器，广泛参与免疫调节、细胞粘附、细胞-细胞相互作用、细胞分化和转化调节、细胞周期调节、DNA修复等重要生物活动，被认为是氧化应激的指标。既往研究表明，哮喘患者的血清和痰中CLU水平升高[22]。血清CLU水平与哮喘严重程度呈正相关，哮喘越严重，血清CLU水平越高；CLU也被认为是哮喘患者哮喘严重程度和氧化应激的生物标志物[23]。本研究中，与Th2倾向型CVA相比，Th2倾向型CA的CLU表达明显上调，Th2倾向型CVA的CLU表达较HC组增加。Th2倾向型CA的发病机制可能与CLU有关，为CVA在遗传水平上是哮喘的早期阶段提供了有利的证据。PTGS1基因位于染色体9q32-q33.3上，全长约22 kb，编码环氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）。环氧化酶是一种催化前列腺素生物合成的关键酶，也是哮喘炎症的重要中介因子。研究表明，PTGS1基因变异与哮喘之间存在关联[24]。颗粒酶B（granzyme B，GZMB）是一种28 kDa丝氨酸蛋白酶，被认为局限于淋巴系，是颗粒介导的细胞毒性的主要效应物[25]。GZMB和IL-13能够同时诱导嗜碱性粒细胞，并且发现支气管肺泡灌洗液中的两种介质在哮喘过敏性反应晚期患者中高度相关。GZMB被认为是一种新的嗜碱性粒细胞来源的过敏性炎症介质[25]。穿孔蛋白1（pore forming protein，PRF1）属于膜攻击复合物/PRF（MACPF）蛋白家族，主要参与细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的颗粒依赖性杀伤活性，可作为具有杀伤能力的免疫细胞的明确标志物[26]。PRF1参与免疫和炎症介导疾病的发病机制。TMSB4X基因编码一种肌动蛋白螯合蛋白，该蛋白在调节肌动蛋白聚合中起作用，也参与细胞增殖、迁移和分化[27]，目前还没有研究表明其与哮喘有关。
我们的研究存在以下局限性：（1）因目前对Th2型炎症未形成统一的诊断标准，故本文查阅文献筛选出了二个节点值定义为Th2型倾向型；（2）因为CVA患者通常很少，导致本研究中Th2倾向型CVA亚组样本量相对较小；（3）虽然我们使用FeNO等指标来区分气道炎症，但没有使用诱导痰检查来进一步鉴别气道炎症的亚型。
综上所述，我们发现6个关键基因CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1和TMSB4X在Th2倾向型CA和Th2倾向型CVA之间存在差异表达，这些DEGs主要富集在2-氧羧酸代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路中。本研究发现的基因可能预测哮喘分子水平的亚型变化，并与CVA向CA的进展有关，但CVA向CA进展的具体机制尚需进一步阐明。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
