引用本文： 李妍, 韩锋锋, 李艳利, 於海洋, 罗勇, 徐卫国. 自噬-溶酶体系统在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎缩中的作用机制. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(6): 534-540. doi: 10.7507/1671-6205.2015132 复制
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是全球范围内普遍危害成人健康的全身性疾病之一，其发病率和死亡率均较高，慢阻肺是由多种危险因素共同参与、多种生物机制同时介导的全身多系统性、慢性炎症反应性疾病，而不只是局限于气道和肺部的疾病[1-2]。慢阻肺患者常并发营养不良，发生率可高达70%，主要表现为骨骼肌消耗与萎缩，患者可发生严重的骨骼肌肌力和耐力下降，严重影响其生活质量及预后，加重自身和社会的经济负担[3]。目前认为严重骨骼肌营养不良的本质在于蛋白质降解和合成之间的失平衡[4]。我们的前期研究发现慢阻肺大鼠全身骨骼肌总蛋白明显降解，骨骼肌肌纤维蛋白消耗尤为显著[5]；慢阻肺患者骨骼肌肌纤维萎缩，肌纤维截面积减小；骨骼肌肌纤维类型改变，运动神经元功能减弱，并有末梢运动神经受损的表现[6-7]。因此，对慢阻肺患者骨骼肌蛋白高分解代谢的研究具有重要意义。骨骼肌细胞蛋白降解途径主要包括泛素-蛋白酶体途径、自噬-溶酶体途径和Ca2+依赖性途径[8]。本研究拟检测慢阻肺大鼠模型中骨骼肌组织FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA及蛋白表达，探讨自噬-溶酶体系统在慢阻肺大鼠骨骼肌萎缩中的作用机制，进一步探索骨骼肌萎缩的机制。
材料与方法
一 材料
1.实验动物：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠24只，6周龄，体重150～200 g，动物反应良好，性情温和，毛色均匀，无脱毛、断尾现象，由上海交通大学医学院附属新华医院实验动物房提供。购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002，使用许可证号：SYXK(沪)2003-0031。
2.主要试剂和仪器：大前门香烟(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，烟气碱含量14 mg，购自上海烟草公司)，逆转录试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，Real time PCR试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，一抗(Abcam，美国)，一抗稀释液(CST，美国)，二抗(碧云天，中国),化学发光剂(Millipore，美国)，大鼠白细胞介素6 (IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(达科为，中国)，大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(达科为，中国)。
二 方法
1.模型制备与分组：采用随机数字表方法分为两组：对照组(12只)和实验组(12只)。每箱6只大鼠饲养，实验组采用熏香烟法：实验组大鼠每天被动吸烟2次，间隔至少2 h，每次4个循环，每个循环4支大前门香烟，燃尽后开始下一个循环，每周6 d，持续12周。对照组吸入正常空气。所有大鼠均普通饮食饲养，自由进食、进水。12周后，应用小动物肺功能仪(BUXCO，美国)测定两组大鼠肺功能情况。测定以下数据：吸气量(IC)，肺活量(VC)，用力肺活量(FVC)，功能残气量(FRC)，肺总量(TLC)，第1秒用力呼气容积(FEV1)，第2秒用力呼气容积(FEV2)，用力呼气中段流量(FEF25、FEF50及FEF75)。肺功能检测结束后，用戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，暴露胸腔心脏抽血致死，尽量去除外周血，收集血液，离心(3 000 r/min，15 min)收集上清。死亡15 min内，无创游离双侧趾长伸肌，沿肌束方向取1 mm×2 mm×1 mm肌肉组织放于戊二醛中固定留作电镜，其余组织放入冻存管中，液氮冻存，留做以下实验。结扎右肺，自环状软骨至剑突处剪开，充分暴露气管。在环状软骨处气管剪一“V”型切口，预先穿过一根丝线，将静脉留置针插入气管至气管隆突处，适度扎紧。静脉留置针连接一5 mL注射器，先抽尽左肺内的剩余气体，再用PBS液灌洗肺组织，每次约3 mL，回抽BALF 1～2 mL，共3次，回收灌洗液大约1.5 mL。离心(1 500 r/min，10 min)收集上清，置于-80 ℃保存。于右肺矢状面最大周径处取肺组织，浸入4%多聚甲醛中固定，6 h内包埋，另取1 mm×1 mm×1 mm肺组织放于戊二醛中固定留作电镜。
2.肺组织病理切片的制备：按已固定好的肺组织矢状面中外1/3取材，标本常规脱水、石蜡包埋、二甲苯脱蜡、经各级乙醇至水洗，然后经苏木素、伊红染色，常规脱水，透明，封片，显微镜下观察。
3.透射电镜观察：将已用戊二醛固定2 h以上的组织标本，1%锇酸固定2 h，丙酮逐级脱水，618环氧树脂包埋，半薄切片定位，切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色。电镜下观察。
4.ELISA测定大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表达：按照ELISA试剂盒厂家所提供的操作指南进行操作，将不同浓度的标准品和样品加入相应的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根过氧化物酶工作液、标准色液、终止液，用自动酶标仪处在30 min内读取光密度值(OD)。根据标准曲线计算待测样品的IL-6、TNF-α含量。
5.实时定量-PCR检测大鼠趾长伸肌组织中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA表达：取相同质量50 mg的趾长伸肌放入匀浆器内，加入1 mL Trizol提取RNA，用分光光度计测定RNA的浓度和OD260/280比值。各样本均按1 μg RNA相对应的体积(nμL)根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录，转录体系为20 μL体系，将混合好的液体放置在PCR仪中，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。将经过逆转录得到的cDNA按照Real time PCR说明书进行半定量PCR，使用ABI7500进行反应，反应条件为95 ℃ 30 s 1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s为40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s 1个循环，内参为GAPDH，引物序列见表 1。Real time PCR得到的相应的Ct值用2-ΔΔCt法进行分析。
表1
引物序列
6.Western blot测定大鼠趾长伸肌组织中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的蛋白表达：用RIPA裂解液提取大鼠趾长伸肌组织中的样品总蛋白，然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定大鼠趾长伸肌组织中的样品总蛋白浓度。将所提取总蛋白样品与5×上样缓冲液按比例混合，沸水浴变性10 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后蛋白电转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，再放入含有适量稀释后的一抗(用一抗稀释液以1∶1 000稀释)，4 ℃振荡过夜。洗涤。敷二抗(用5%脱脂奶粉溶液以1∶3 000稀释)，室温振荡1 h，洗涤，最终使用化学发光剂显影成像。结果经Image LabTM软件进行灰度值分析。
三 统计学处理
应用GraphPad Prism5统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以
结果
一 体重变化
烟熏0周和烟熏4周时实验组和对照组大鼠的平均体重差异不具有统计学意义，烟熏8周时实验组大鼠体重明显低于对照组大鼠体重，但尚未达到营养不良的标准。烟熏12周时实验组大鼠体重明显低于对照组大鼠体重(P<0.01)，且体重下降已超过预计值的10%，出现营养不良改变。结果见图 1。
图1
大鼠体重变化
与对照组比较，*
二 肺功能变化
两组肺功能各项指标实验组较对照组下降(P<0.01)。结果见表 2。
表2
两组大鼠肺功能结果(三 肺组织形态学改变
肺组织石蜡切片HE染色，光学显微镜下可见：对照组大鼠肺泡结构正常，无炎症细胞聚集，无支气管扩张；实验组大鼠肺泡破裂、融合形成肺大疱，炎症细胞浸润，支气管扩张，呈细支气管慢性炎及肺气肿的典型改变。结果见图 2。
图2
大鼠肺组织病理检查像(HE ×100) a.对照组,大鼠肺泡结构正常，无炎症细胞聚集，无支气管扩张；b.实验组,大鼠肺泡破裂、融合形成肺大疱，炎症细胞浸润，支气管扩张
四 大鼠趾长伸肌及肺组织的电镜观察结果
透射电镜下可见，对照组大鼠趾长伸肌组织胞浆内未发现自噬溶酶体(图 3a)，实验组大鼠趾长伸肌组织胞浆内发现自噬溶酶体增多(图 3b)；对照组肺组织未发现明显异常(图 3c)，实验组肺组织电镜下发现纤维化和炎症细胞增多(图 3d)。
图3
大鼠趾长伸肌组织和肺组织的透射电镜检查像(×24 500) a.对照组大鼠趾长伸肌组织,胞浆内未发现自噬溶酶体；b.实验组大鼠趾长伸肌组织,自噬溶酶体(黑箭)增多；c.对照组肺组织,肺组织未发现明显异常；d.实验组肺组织,纤维化和炎症细胞(黑箭)增多
五 大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表达
实验组与正常对照组相比，肺泡灌洗液上清和血清中的炎症因子IL-6显著升高(P<0.05)；在肺泡灌洗液上清中炎症因子TNF-α实验组较对照组显著升高(P<0.01)，血清中TNF-α在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图 4。
图4
大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6(a)、TNF-α(b)的表达
与对照组比较，*
六 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表达变化
Real time PCR分析结果显示，大鼠趾长伸肌组织中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA表达实验组显著高于对照组(P<0.05，其中Bnip3两组对照P<0.01)。MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的mRNA表达两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图 5。
图5
大鼠趾长伸肌内FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表达
与对照组比较，*
七 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5蛋白表达变化
Western blot分析结果显示，FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ 及Atg5的蛋白表达实验组显著高于对照组(P<0.05，其中Bnip3、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1两组对照P<0.01)。结果见图 6和图 7。
图6
大鼠趾长伸肌内Atg5、Bnip3及MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达 a. Western blot检测像； b.蛋白相对表达量比较
与对照组比较，*
图7
大鼠趾长伸肌内Beclin1、p62及FOXO的蛋白表达 a.Western blot检测像；b.蛋白相对表达量比较
与对照组比较，*
讨论
慢阻肺患者骨骼肌萎缩引起骨骼肌功能障碍，导致骨骼肌肌力及耐力下降，直接影响疾病的进展和预后，加重患者和社会的经济负担[3, 9]。慢阻肺患者发生的骨骼肌萎缩是一种多因素、多机制共同参与的复杂过程，其最终归结为骨骼肌蛋白降解和合成之间的不平衡，蛋白降解增加大于蛋白合成，导致骨骼肌萎缩[10]。骨骼肌细胞蛋白降解途径主要包括泛素-蛋白酶体途径、自噬-溶酶体途径和Ca2+依赖性途径[8]。
泛素-蛋白酶体系统主要由泛素、泛素相关酶(包括E1、E2S、E3S等)和蛋白酶体三部分组成，在多种蛋白质降解的过程中发挥重要作用，是骨骼肌蛋白降解的主要途径[11-12]。Ottenheijm等[13]于2006年首次报道了慢阻肺患者膈肌20s蛋白酶体水平升高。我们前期的研究发现慢阻肺大鼠膈肌组织和伸趾长肌中泛素和E2-14K的mRNA和蛋白表达明显高于正常对照组[14-15]；慢阻肺大鼠骨骼肌中泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA和蛋白表达均显著增强[16]，提示慢阻肺的骨骼肌消耗和营养不良与泛素-蛋白酶体系统的过度激活有关。体外研究资料显示，E3连接酶的两个肌肉萎缩特异性指标——atrogin-1(muscle atrophy F-box)和MuRF-1(muscle ring finger 1)，通过泛素连接肌肉细胞从而降解肌肉细胞中蛋白质，被称为泛素连接酶[17-18]。我们前期的研究发现慢阻肺大鼠骨骼肌atrogin-1和MuRF-1的基因和蛋白表达明显上调，并受AKT/FOXO信号通路调控，说明AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF-l信号通路参与慢阻肺骨骼肌消耗和萎缩机制[6]。
自噬是一种不同于凋亡的程序性细胞死亡方式，指细胞受到刺激后吞噬自身细胞器或细胞质并最终在溶酶体内降解吞噬物的过程，自噬-溶酶体系统是真核细胞内的另一蛋白降解系统。按吞噬物进入溶酶体的方式,可将细胞自噬分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬[19-21]。最新发现，多种疾病所致的骨骼肌萎缩，其骨骼肌中自噬-溶酶体系统上调，抑制自噬可改善骨骼肌萎缩，提示自噬激活可促进骨骼肌萎缩的发生[22]。Lecker等[21]通过对癌症、禁食、糖尿病及尿毒症的动物模型的骨骼肌进行基因检测，发现泛素-蛋白酶体系统的标志物atrogin-1和MuRF-1以及自噬-溶酶体系统的标志物GABAA受体相关蛋白相似蛋1(Gabarapl 1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Bcl2/腺病毒E1B结合蛋白3(Bnip3)、组织蛋白酶L(Cathepsin I)上调。随后的多项研究发现，不同病因所致的骨骼肌萎缩模型及临床相关疾病的骨骼肌标本中均存在着活跃的自噬-溶酶体系统[21-27]。骨骼肌中自噬的调控机制较为复杂，多种调节自噬的分子可通过直接或间接与Atg的作用调节自噬。p62蛋白与LC3(哺乳动物中Atg8的同源蛋白)可直接作用，介导多泛素样蛋白经ALS降解[28]，第三类磷脂酰肌醇3激酶(class Ⅲ PI3)与Beclin l(Atg6的同源蛋白)相互作可形成class Ⅲ PI3-Beclin l复合体，调节骨骼肌细胞自噬途径[29]。其中FOXO转录因子是十分关键的自噬调控因子[30]，可通过Bnip3促进自噬小体形成[22]，并引起自体吞噬基因包括LC3、VPs34、Bnip3和溶酶体组织蛋白酶L的表达上调[31]，并且这种作用不受蛋白酶体抑制剂的影响，说明FOXO可独立的调控骨骼肌中的两条降解途径，即泛素-蛋白酶体途径、自噬-溶酶体途径[22]。有研究发现在慢阻肺患者和暴露于香烟或香烟萃取物的小鼠的肺组织中，存在自噬作用增强的证据[32-33]，而吸烟是慢阻肺的最常见的原因。因此，我们推测在慢阻肺的发生、发展中自噬作用发挥了相当重要的作用，同时其也受到慢阻肺发病中其他机制或过程的调节。但自噬系统在慢阻肺骨骼肌萎缩中的作用及调控目前尚未有报道。
在本研究中我们检测了慢阻肺大鼠模型中骨骼肌组织中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、P62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA及蛋白表达，结果显示：烟熏12周的实验组大鼠趾长伸肌FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA及蛋白表达量显著高于对照组。透射电镜下，我们也观察到，与对照组比较，实验组大鼠趾长伸肌组织中自噬溶酶体增多，肺组织中出现肺组织纤维化和炎症细胞增多，说明慢阻肺大鼠趾长伸肌组织内自噬-溶酶体系统被激活。结合我们的前期研究结果，可得出结论：在慢阻肺大鼠模型的骨骼肌萎缩中，两条降解途径泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统均被激活，可能是慢阻肺大鼠模型中骨骼肌萎缩的机制之一。
泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统长期以来一直被认作是完全独立的系统，然而越来越多的证据显示两者是功能相关的分解代谢过程：最初发现单泛素化可作为胞吞关键信号，随后又有一系列证据显示泛素可作为选择性自噬的特异信号[34-35]，这两条降解系统分享某些调节分子和底物，表现为协同作用，在某些背景下又显示补偿功能。在接下来的实验中，我们将着重探讨泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统之间的相互关系，为慢阻肺患者骨骼肌萎缩的治疗提供新的理论依据。
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是全球范围内普遍危害成人健康的全身性疾病之一，其发病率和死亡率均较高，慢阻肺是由多种危险因素共同参与、多种生物机制同时介导的全身多系统性、慢性炎症反应性疾病，而不只是局限于气道和肺部的疾病[1-2]。慢阻肺患者常并发营养不良，发生率可高达70%，主要表现为骨骼肌消耗与萎缩，患者可发生严重的骨骼肌肌力和耐力下降，严重影响其生活质量及预后，加重自身和社会的经济负担[3]。目前认为严重骨骼肌营养不良的本质在于蛋白质降解和合成之间的失平衡[4]。我们的前期研究发现慢阻肺大鼠全身骨骼肌总蛋白明显降解，骨骼肌肌纤维蛋白消耗尤为显著[5]；慢阻肺患者骨骼肌肌纤维萎缩，肌纤维截面积减小；骨骼肌肌纤维类型改变，运动神经元功能减弱，并有末梢运动神经受损的表现[6-7]。因此，对慢阻肺患者骨骼肌蛋白高分解代谢的研究具有重要意义。骨骼肌细胞蛋白降解途径主要包括泛素-蛋白酶体途径、自噬-溶酶体途径和Ca2+依赖性途径[8]。本研究拟检测慢阻肺大鼠模型中骨骼肌组织FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA及蛋白表达，探讨自噬-溶酶体系统在慢阻肺大鼠骨骼肌萎缩中的作用机制，进一步探索骨骼肌萎缩的机制。
材料与方法
一 材料
1.实验动物：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠24只，6周龄，体重150～200 g，动物反应良好，性情温和，毛色均匀，无脱毛、断尾现象，由上海交通大学医学院附属新华医院实验动物房提供。购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002，使用许可证号：SYXK(沪)2003-0031。
2.主要试剂和仪器：大前门香烟(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，烟气碱含量14 mg，购自上海烟草公司)，逆转录试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，Real time PCR试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，一抗(Abcam，美国)，一抗稀释液(CST，美国)，二抗(碧云天，中国),化学发光剂(Millipore，美国)，大鼠白细胞介素6 (IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(达科为，中国)，大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(达科为，中国)。
二 方法
1.模型制备与分组：采用随机数字表方法分为两组：对照组(12只)和实验组(12只)。每箱6只大鼠饲养，实验组采用熏香烟法：实验组大鼠每天被动吸烟2次，间隔至少2 h，每次4个循环，每个循环4支大前门香烟，燃尽后开始下一个循环，每周6 d，持续12周。对照组吸入正常空气。所有大鼠均普通饮食饲养，自由进食、进水。12周后，应用小动物肺功能仪(BUXCO，美国)测定两组大鼠肺功能情况。测定以下数据：吸气量(IC)，肺活量(VC)，用力肺活量(FVC)，功能残气量(FRC)，肺总量(TLC)，第1秒用力呼气容积(FEV1)，第2秒用力呼气容积(FEV2)，用力呼气中段流量(FEF25、FEF50及FEF75)。肺功能检测结束后，用戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，暴露胸腔心脏抽血致死，尽量去除外周血，收集血液，离心(3 000 r/min，15 min)收集上清。死亡15 min内，无创游离双侧趾长伸肌，沿肌束方向取1 mm×2 mm×1 mm肌肉组织放于戊二醛中固定留作电镜，其余组织放入冻存管中，液氮冻存，留做以下实验。结扎右肺，自环状软骨至剑突处剪开，充分暴露气管。在环状软骨处气管剪一“V”型切口，预先穿过一根丝线，将静脉留置针插入气管至气管隆突处，适度扎紧。静脉留置针连接一5 mL注射器，先抽尽左肺内的剩余气体，再用PBS液灌洗肺组织，每次约3 mL，回抽BALF 1～2 mL，共3次，回收灌洗液大约1.5 mL。离心(1 500 r/min，10 min)收集上清，置于-80 ℃保存。于右肺矢状面最大周径处取肺组织，浸入4%多聚甲醛中固定，6 h内包埋，另取1 mm×1 mm×1 mm肺组织放于戊二醛中固定留作电镜。
2.肺组织病理切片的制备：按已固定好的肺组织矢状面中外1/3取材，标本常规脱水、石蜡包埋、二甲苯脱蜡、经各级乙醇至水洗，然后经苏木素、伊红染色，常规脱水，透明，封片，显微镜下观察。
3.透射电镜观察：将已用戊二醛固定2 h以上的组织标本，1%锇酸固定2 h，丙酮逐级脱水，618环氧树脂包埋，半薄切片定位，切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色。电镜下观察。
4.ELISA测定大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表达：按照ELISA试剂盒厂家所提供的操作指南进行操作，将不同浓度的标准品和样品加入相应的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根过氧化物酶工作液、标准色液、终止液，用自动酶标仪处在30 min内读取光密度值(OD)。根据标准曲线计算待测样品的IL-6、TNF-α含量。
5.实时定量-PCR检测大鼠趾长伸肌组织中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA表达：取相同质量50 mg的趾长伸肌放入匀浆器内，加入1 mL Trizol提取RNA，用分光光度计测定RNA的浓度和OD260/280比值。各样本均按1 μg RNA相对应的体积(nμL)根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录，转录体系为20 μL体系，将混合好的液体放置在PCR仪中，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。将经过逆转录得到的cDNA按照Real time PCR说明书进行半定量PCR，使用ABI7500进行反应，反应条件为95 ℃ 30 s 1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s为40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s 1个循环，内参为GAPDH，引物序列见表 1。Real time PCR得到的相应的Ct值用2-ΔΔCt法进行分析。
表1
引物序列
6.Western blot测定大鼠趾长伸肌组织中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的蛋白表达：用RIPA裂解液提取大鼠趾长伸肌组织中的样品总蛋白，然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定大鼠趾长伸肌组织中的样品总蛋白浓度。将所提取总蛋白样品与5×上样缓冲液按比例混合，沸水浴变性10 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后蛋白电转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，再放入含有适量稀释后的一抗(用一抗稀释液以1∶1 000稀释)，4 ℃振荡过夜。洗涤。敷二抗(用5%脱脂奶粉溶液以1∶3 000稀释)，室温振荡1 h，洗涤，最终使用化学发光剂显影成像。结果经Image LabTM软件进行灰度值分析。
三 统计学处理
应用GraphPad Prism5统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以
结果
一 体重变化
烟熏0周和烟熏4周时实验组和对照组大鼠的平均体重差异不具有统计学意义，烟熏8周时实验组大鼠体重明显低于对照组大鼠体重，但尚未达到营养不良的标准。烟熏12周时实验组大鼠体重明显低于对照组大鼠体重(P<0.01)，且体重下降已超过预计值的10%，出现营养不良改变。结果见图 1。
图1
大鼠体重变化
与对照组比较，*
二 肺功能变化
两组肺功能各项指标实验组较对照组下降(P<0.01)。结果见表 2。
表2
两组大鼠肺功能结果(三 肺组织形态学改变
肺组织石蜡切片HE染色，光学显微镜下可见：对照组大鼠肺泡结构正常，无炎症细胞聚集，无支气管扩张；实验组大鼠肺泡破裂、融合形成肺大疱，炎症细胞浸润，支气管扩张，呈细支气管慢性炎及肺气肿的典型改变。结果见图 2。
图2
大鼠肺组织病理检查像(HE ×100) a.对照组,大鼠肺泡结构正常，无炎症细胞聚集，无支气管扩张；b.实验组,大鼠肺泡破裂、融合形成肺大疱，炎症细胞浸润，支气管扩张
四 大鼠趾长伸肌及肺组织的电镜观察结果
透射电镜下可见，对照组大鼠趾长伸肌组织胞浆内未发现自噬溶酶体(图 3a)，实验组大鼠趾长伸肌组织胞浆内发现自噬溶酶体增多(图 3b)；对照组肺组织未发现明显异常(图 3c)，实验组肺组织电镜下发现纤维化和炎症细胞增多(图 3d)。
图3
大鼠趾长伸肌组织和肺组织的透射电镜检查像(×24 500) a.对照组大鼠趾长伸肌组织,胞浆内未发现自噬溶酶体；b.实验组大鼠趾长伸肌组织,自噬溶酶体(黑箭)增多；c.对照组肺组织,肺组织未发现明显异常；d.实验组肺组织,纤维化和炎症细胞(黑箭)增多
五 大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表达
实验组与正常对照组相比，肺泡灌洗液上清和血清中的炎症因子IL-6显著升高(P<0.05)；在肺泡灌洗液上清中炎症因子TNF-α实验组较对照组显著升高(P<0.01)，血清中TNF-α在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图 4。
图4
大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6(a)、TNF-α(b)的表达
与对照组比较，*
六 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表达变化
Real time PCR分析结果显示，大鼠趾长伸肌组织中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA表达实验组显著高于对照组(P<0.05，其中Bnip3两组对照P<0.01)。MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的mRNA表达两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图 5。
图5
大鼠趾长伸肌内FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表达
与对照组比较，*
七 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5蛋白表达变化
Western blot分析结果显示，FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ 及Atg5的蛋白表达实验组显著高于对照组(P<0.05，其中Bnip3、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1两组对照P<0.01)。结果见图 6和图 7。
图6
大鼠趾长伸肌内Atg5、Bnip3及MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达 a. Western blot检测像； b.蛋白相对表达量比较
与对照组比较，*
图7
大鼠趾长伸肌内Beclin1、p62及FOXO的蛋白表达 a.Western blot检测像；b.蛋白相对表达量比较
与对照组比较，*
讨论
慢阻肺患者骨骼肌萎缩引起骨骼肌功能障碍，导致骨骼肌肌力及耐力下降，直接影响疾病的进展和预后，加重患者和社会的经济负担[3, 9]。慢阻肺患者发生的骨骼肌萎缩是一种多因素、多机制共同参与的复杂过程，其最终归结为骨骼肌蛋白降解和合成之间的不平衡，蛋白降解增加大于蛋白合成，导致骨骼肌萎缩[10]。骨骼肌细胞蛋白降解途径主要包括泛素-蛋白酶体途径、自噬-溶酶体途径和Ca2+依赖性途径[8]。
泛素-蛋白酶体系统主要由泛素、泛素相关酶(包括E1、E2S、E3S等)和蛋白酶体三部分组成，在多种蛋白质降解的过程中发挥重要作用，是骨骼肌蛋白降解的主要途径[11-12]。Ottenheijm等[13]于2006年首次报道了慢阻肺患者膈肌20s蛋白酶体水平升高。我们前期的研究发现慢阻肺大鼠膈肌组织和伸趾长肌中泛素和E2-14K的mRNA和蛋白表达明显高于正常对照组[14-15]；慢阻肺大鼠骨骼肌中泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA和蛋白表达均显著增强[16]，提示慢阻肺的骨骼肌消耗和营养不良与泛素-蛋白酶体系统的过度激活有关。体外研究资料显示，E3连接酶的两个肌肉萎缩特异性指标——atrogin-1(muscle atrophy F-box)和MuRF-1(muscle ring finger 1)，通过泛素连接肌肉细胞从而降解肌肉细胞中蛋白质，被称为泛素连接酶[17-18]。我们前期的研究发现慢阻肺大鼠骨骼肌atrogin-1和MuRF-1的基因和蛋白表达明显上调，并受AKT/FOXO信号通路调控，说明AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF-l信号通路参与慢阻肺骨骼肌消耗和萎缩机制[6]。
自噬是一种不同于凋亡的程序性细胞死亡方式，指细胞受到刺激后吞噬自身细胞器或细胞质并最终在溶酶体内降解吞噬物的过程，自噬-溶酶体系统是真核细胞内的另一蛋白降解系统。按吞噬物进入溶酶体的方式,可将细胞自噬分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬[19-21]。最新发现，多种疾病所致的骨骼肌萎缩，其骨骼肌中自噬-溶酶体系统上调，抑制自噬可改善骨骼肌萎缩，提示自噬激活可促进骨骼肌萎缩的发生[22]。Lecker等[21]通过对癌症、禁食、糖尿病及尿毒症的动物模型的骨骼肌进行基因检测，发现泛素-蛋白酶体系统的标志物atrogin-1和MuRF-1以及自噬-溶酶体系统的标志物GABAA受体相关蛋白相似蛋1(Gabarapl 1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Bcl2/腺病毒E1B结合蛋白3(Bnip3)、组织蛋白酶L(Cathepsin I)上调。随后的多项研究发现，不同病因所致的骨骼肌萎缩模型及临床相关疾病的骨骼肌标本中均存在着活跃的自噬-溶酶体系统[21-27]。骨骼肌中自噬的调控机制较为复杂，多种调节自噬的分子可通过直接或间接与Atg的作用调节自噬。p62蛋白与LC3(哺乳动物中Atg8的同源蛋白)可直接作用，介导多泛素样蛋白经ALS降解[28]，第三类磷脂酰肌醇3激酶(class Ⅲ PI3)与Beclin l(Atg6的同源蛋白)相互作可形成class Ⅲ PI3-Beclin l复合体，调节骨骼肌细胞自噬途径[29]。其中FOXO转录因子是十分关键的自噬调控因子[30]，可通过Bnip3促进自噬小体形成[22]，并引起自体吞噬基因包括LC3、VPs34、Bnip3和溶酶体组织蛋白酶L的表达上调[31]，并且这种作用不受蛋白酶体抑制剂的影响，说明FOXO可独立的调控骨骼肌中的两条降解途径，即泛素-蛋白酶体途径、自噬-溶酶体途径[22]。有研究发现在慢阻肺患者和暴露于香烟或香烟萃取物的小鼠的肺组织中，存在自噬作用增强的证据[32-33]，而吸烟是慢阻肺的最常见的原因。因此，我们推测在慢阻肺的发生、发展中自噬作用发挥了相当重要的作用，同时其也受到慢阻肺发病中其他机制或过程的调节。但自噬系统在慢阻肺骨骼肌萎缩中的作用及调控目前尚未有报道。
在本研究中我们检测了慢阻肺大鼠模型中骨骼肌组织中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、P62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA及蛋白表达，结果显示：烟熏12周的实验组大鼠趾长伸肌FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA及蛋白表达量显著高于对照组。透射电镜下，我们也观察到，与对照组比较，实验组大鼠趾长伸肌组织中自噬溶酶体增多，肺组织中出现肺组织纤维化和炎症细胞增多，说明慢阻肺大鼠趾长伸肌组织内自噬-溶酶体系统被激活。结合我们的前期研究结果，可得出结论：在慢阻肺大鼠模型的骨骼肌萎缩中，两条降解途径泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统均被激活，可能是慢阻肺大鼠模型中骨骼肌萎缩的机制之一。
泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统长期以来一直被认作是完全独立的系统，然而越来越多的证据显示两者是功能相关的分解代谢过程：最初发现单泛素化可作为胞吞关键信号，随后又有一系列证据显示泛素可作为选择性自噬的特异信号[34-35]，这两条降解系统分享某些调节分子和底物，表现为协同作用，在某些背景下又显示补偿功能。在接下来的实验中，我们将着重探讨泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统之间的相互关系，为慢阻肺患者骨骼肌萎缩的治疗提供新的理论依据。
