引用本文： 杜静芳, 叶涛, 郝瑞英, 卓见, 李沙, 刘伟光, 张瑞英. CYB561在肝细胞癌中的表达及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2024, 31(8): 910-915. doi: 10.7507/1007-9424.202402028 复制
肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝癌中最普遍的亚型，约占原发性肝癌的90%以上[1]，死亡率和发病率在所有癌症中分别排名第4和第6[2]，与乙肝病毒（乙型肝炎）或丙肝病毒（丙型肝炎）感染、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎等有关[3]。HCC高增殖性和高侵袭性生物学特性决定了其发病隐匿、发展迅速和预后差[4]。虽然目前的治疗方法已取得较大进展，但由于化疗的耐药性和个体差异性，HCC的5年存活率为15%～38%，预后仍较差[5]。因此，寻找新的生物学标志物是当前研究重点。细胞色素b561（cytochromes b561，CYB561）属于细胞色素b561家族成员A1[6]，位于17q23.3，是一种完整的跨膜蛋白，由位于膜两侧的血红素-b氧化还原中心组成[7]。CYB561在人体组织中广泛表达，参与细胞代谢、线粒体激活，可调节肾上腺素途径，并参与铁的摄取、抗坏血酸再生、肿瘤生长等过程[8-9]。然而，关于CYB561在HCC中的表达及其临床意义目前鲜有报道。因此，本研究旨在利用生物信息学技术并结合免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）及临床队列分析CYB561在HCC中的表达及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床病例资料
1.1.1 临床病例的获取
选取2013年1月至2015年1月期间在河北工程大学附属医院行手术治疗且术后完成5年随访的61例HCC患者作为研究对象，其中男48例，女13例；年龄32～79岁、中位年龄62岁。纳入标准：① 经病理学检查诊断为HCC；② 可获取肝肿瘤和癌旁组织病理样本；③ 具备完整的临床病理特征信息。排除标准：① 组织活检前接受过辅助治疗包括化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等；② 合并其他恶性肿瘤；③ 合并自身免疫性疾病；④ 既往精神病史或存在语言、认知功能障碍者。本研究获得河北工程大学附属医院医学伦理委员会的批准，批文编号：2023 ［K］ 109，且患者及其家属签署了知情同意书。
1.1.2 组织样本中CYB561蛋白表达的检测
采用IHC法检测。取石蜡包埋的手术切除标本（包括HCC组织及其癌旁组织）进行4 μm厚的连续切片，经脱蜡和脱水处理后使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤切片，然后使用3% H2O2溶液在室温下抑制内源性过氧化物酶活性15 min；在95 ℃的柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）中进行15 min的抗原修复；切片与1%胎牛血清在37 ℃下孵育20 min，以阻断非特异性位点。再使用PBS缓冲液多次洗涤切片后，加入1∶100稀释的CYB561（赛默飞，PA5-
1.2 数据库资料分析
使用TIMER数据库（
1.3 统计学方法
采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。CYB561 mRNA和蛋白在HCC组织及其癌旁组织中的表达差异分析采用独立样本t检验或配对t检验或配对χ2检验，CYB561蛋白的表达与HCC临床病理特征间的相关性采用成组χ2检验，等级资料采用成组设计的Wilcoxon秩和检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，不同组间生存曲线的分析采用log-rank检验；采用Cox比例风险回归模型分析各变量与HCC患者预后的关系。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 CYB561 mRNA在HCC中表达异常升高
TIMER数据库资料分析结果显示：CYB561 mRNA在多种肿瘤中表达上调，其中在HCC组织中CYB561 mRNA的相对表达量高于癌旁组织（P<0.001）。UALCAN数据库纳入了371例HCC组织和50例癌旁组织，分析结果显示：在HCC组织中CYB561 mRNA的相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。另外，基于TNMplot数据库的基因芯片数据集（包含了配对和非配对的HCC样本数据），分析结果显示：在HCC组织中CYB561 mRNA的相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。具体见补充材料的图1。
图1
示HCC 组织中CYB561 mRNA表达与HCC患者生存之间的关系
a： 通过TIMER数据库构建的CYB561 mRNA表达与肿瘤预后的Cox比例风险回归模型；b～e：分别是HCC组织中CYB561 mRNA表达与HCC患者的 OS （b）、RFS（c）、 PFS（d）和 DSS（e）曲线
2.2 CYB561 mRNA在HCC中的表达与不良预后相关
根据TIMER数据库资料构建CYB561 mRNA表达与HCC预后的Cox比例风险回归模型，其结果显示：CYB561 mRNA表达与HCC的预后相关（P<0.05，图1a ）。通过Kaplan-Meier Plotter数据库资料绘制不同CYB561 mRNA表达HCC患者的生存曲线，并采用log-rank检验进行分析，结果显示：与CYB561 mRNA表达阴性HCC患者相比，CYB561 mRNA表达阳性的HCC患者拥有更差的总生存期（overall survival， OS）、无复发生存期（recurrence-free survival， RFS）、无进展生存期（progression-free survival， PFS）和无病生存期（disease-free survival， DSS），均P<0.05（图1b～1e）。
2.3 CYB561蛋白表达与HCC患者预后关系分析结果
本研究检测了61对HCC组织及其癌旁组织中的CYB561蛋白表达情况（图2a和2b）， 其结果显示：CYB561蛋白主要定位于细胞质中，在HCC组织和癌旁组织中的表达阳性率分别为57.38%（35/61）和21.31%（13/61），前者高于后者，差异有统计学意义（χ2=16.624，P＜0.001）。为了探讨CYB561蛋白表达与HCC患者预后的关系，根据IHC评分结果，61例患者中CYB561蛋白表达阳性35例，表达阴性26例；采用Kaplan-Meier 法绘制2组患者的生存曲线，结果显示：CYB561蛋白表达阳性患者的OS差于表达阴性患者（P＜0.05，图2c）。进一步分析CYB561蛋白表达与 HCC患者临床病理特征的关系以及影响OS的因素，其结果显示：CYB561蛋白的表达与肿瘤组织学分级有关（P=0.001），但与其他临床病理特征无关（P＞0.05），具体见表1。采用Cox比例风险回归模型分析HCC患者术后OS的影响因素，单因素分析结果显示：原发病灶数（P=0.001）、组织学分级（P=0.001）、病理分期（P=0.001）和CYB651蛋白表达（P=0.036）是HCC患者术后OS的影响因素（表2）；多因素分析结果显示：组织学分级Ⅲ ～Ⅳ级（P=0.001）和CYB561蛋白阳性表达（P=0.009）是HCC患者术后OS的危险因素（表3）。
图2
示HCC组织和癌旁组织中CYB561蛋白的表达及CYB561蛋白表达阳性和阴性患者的OS曲线
a：CYB561蛋白在HCC组织中有代表性的阳性及阴性表达（IHC）；b： CYB561蛋白在癌旁组织中有代表性的阳性及阴性表达（IHC）；c： CYB561蛋白表达阳性和阴性患者的OS曲线
表1
HCC中CYB561蛋白的表达与HCC患者临床病理特征间的关系（例）
表2
61 例HCC患者OS影响因素的单因素 Cox 比例风险回归分析结果
表3
61 例HCC患者OS影响因素的多因素 Cox比例风险回归分析结果
3 讨论
HCC是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，发病率高，治愈率低，给HCC患者家庭带来严重经济负担。在过去的20年中，HCC患者的预后几乎没有改善，尽管目前出现了新的治疗策略，但HCC的总体预后仍然令人担忧。因此，迫切需要寻找新的分子机制和诊断标志物，以开发有效治疗HCC的策略。
CYB561是一个单拷贝的蛋白编码基因，在整个系统发育中高度保守[10]，其在多种癌症和组织中高表达，如神经内分泌组织，并促进抗去势神经内分泌卵巢癌的生长和转移[11]。此外，CYB561在乳腺癌中的表达增高提示患者的预后不良，并且与乳腺癌的免疫细胞浸润有关 [12-13]。有研究 [14]报道称Burkitt淋巴瘤中 CYB561A3敲除可导致溶酶体和线粒体呼吸功能损伤，诱导严重的铁死亡，得出CYB561A3是Burkitt细胞生长和存活所必需的关键溶酶体铁还原酶。CYB561可以作为抗坏血酸跨膜运输的电子供体，也可以还原铁离子[7]。抗坏血酸和铁是细胞的重要组成成分，在许多代谢反应中是必需的辅助因子。研究[15]表明，抗坏血酸与仑伐替尼和瑞戈非尼的协同效应可作为HCC靶向治疗的辅助剂。同时，抗坏血酸促进铁的吸收并调节其代谢[16]。铁在癌症发生、发展和转移中扮演着不同的角色，铁元素是HCC发生的潜在危险因素，并且参与铁代谢调节的一些分子通常在肿瘤细胞中表达上调，肿瘤细胞的生长依赖于微量铁元素，以便促进肿瘤细胞的生存、增殖和转移[17]。CYB561具有跨膜电子转移载体和铁还原酶的功能，可能参与了铁代谢途径，使其成为潜在的治疗靶点。
本研究对多种数据库中有关HCC患者资料进行分析，发现CYB561在HCC组织中的表达高于癌旁组织，提示其可能在HCC的发生和发展中发挥重要作用。本研究通过IHC技术验证CYB561蛋白表达于细胞质中，并且在HCC组织中的表达阳性率明显高于癌旁组织，提示CYB561可能对HCC的发生发展起到促进作用。进一步分析HCC组织中CYB561蛋白的表达与HCC临床病理特征的关系，结果显示CYB561蛋白的阳性表达与肿瘤的组织学分级有相关性，提示CYB561 可能与HCC恶性进展有关。Cox比例风险回归模型分析结果显示CYB561阳性表达是影响HCC患者生存预后的危险因素。相关研究显示，CYB561在乳腺癌[12]、卵巢癌[11]、非小细胞肺癌[18]等肿瘤中高表达，且与肿瘤进展与不良预后密切相关。本研究结果进一步证实 HCC中CYB561的表达也可作为衡量HCC恶性程度的重要指标之一。这提示CYB561的表达水平与HCC疾病的发生、病情发展及预后有关， CYB561可能是HCC治疗潜在的靶点和生物学标志物，为 HCC的诊断、预后判断和治疗提供新思路。
本研究存在一定的局限性：仅使用生物信息学分析了CYB561在人类基因转录组水平方面的特征，并且纳入的临床样本数量相对较少，结果及结论可能会存在偏倚，未来需要继续扩大研究样本量，以获得更准确的研究结果；并且本研究缺少细胞、动物等基础实验进行验证；CYB561在HCC中参与调控的信号通路也有待进一步证明。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：杜静芳进行临床资料收集、数据分析并撰写论文；叶涛、郝瑞英和卓见协助数据收集及分析；李沙指导论文修改；刘伟光负责研究方案设计、研究过程管理和论文的修改；张瑞英提供研究思路和论文修改。
伦理声明：本研究通过了河北工程大学附属医院医学伦理委员会的审批，批文编号：2023［K］109。
肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝癌中最普遍的亚型，约占原发性肝癌的90%以上[1]，死亡率和发病率在所有癌症中分别排名第4和第6[2]，与乙肝病毒（乙型肝炎）或丙肝病毒（丙型肝炎）感染、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎等有关[3]。HCC高增殖性和高侵袭性生物学特性决定了其发病隐匿、发展迅速和预后差[4]。虽然目前的治疗方法已取得较大进展，但由于化疗的耐药性和个体差异性，HCC的5年存活率为15%～38%，预后仍较差[5]。因此，寻找新的生物学标志物是当前研究重点。细胞色素b561（cytochromes b561，CYB561）属于细胞色素b561家族成员A1[6]，位于17q23.3，是一种完整的跨膜蛋白，由位于膜两侧的血红素-b氧化还原中心组成[7]。CYB561在人体组织中广泛表达，参与细胞代谢、线粒体激活，可调节肾上腺素途径，并参与铁的摄取、抗坏血酸再生、肿瘤生长等过程[8-9]。然而，关于CYB561在HCC中的表达及其临床意义目前鲜有报道。因此，本研究旨在利用生物信息学技术并结合免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）及临床队列分析CYB561在HCC中的表达及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床病例资料
1.1.1 临床病例的获取
选取2013年1月至2015年1月期间在河北工程大学附属医院行手术治疗且术后完成5年随访的61例HCC患者作为研究对象，其中男48例，女13例；年龄32～79岁、中位年龄62岁。纳入标准：① 经病理学检查诊断为HCC；② 可获取肝肿瘤和癌旁组织病理样本；③ 具备完整的临床病理特征信息。排除标准：① 组织活检前接受过辅助治疗包括化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等；② 合并其他恶性肿瘤；③ 合并自身免疫性疾病；④ 既往精神病史或存在语言、认知功能障碍者。本研究获得河北工程大学附属医院医学伦理委员会的批准，批文编号：2023 ［K］ 109，且患者及其家属签署了知情同意书。
1.1.2 组织样本中CYB561蛋白表达的检测
采用IHC法检测。取石蜡包埋的手术切除标本（包括HCC组织及其癌旁组织）进行4 μm厚的连续切片，经脱蜡和脱水处理后使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤切片，然后使用3% H2O2溶液在室温下抑制内源性过氧化物酶活性15 min；在95 ℃的柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）中进行15 min的抗原修复；切片与1%胎牛血清在37 ℃下孵育20 min，以阻断非特异性位点。再使用PBS缓冲液多次洗涤切片后，加入1∶100稀释的CYB561（赛默飞，PA5-
1.2 数据库资料分析
使用TIMER数据库（
1.3 统计学方法
采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。CYB561 mRNA和蛋白在HCC组织及其癌旁组织中的表达差异分析采用独立样本t检验或配对t检验或配对χ2检验，CYB561蛋白的表达与HCC临床病理特征间的相关性采用成组χ2检验，等级资料采用成组设计的Wilcoxon秩和检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，不同组间生存曲线的分析采用log-rank检验；采用Cox比例风险回归模型分析各变量与HCC患者预后的关系。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 CYB561 mRNA在HCC中表达异常升高
TIMER数据库资料分析结果显示：CYB561 mRNA在多种肿瘤中表达上调，其中在HCC组织中CYB561 mRNA的相对表达量高于癌旁组织（P<0.001）。UALCAN数据库纳入了371例HCC组织和50例癌旁组织，分析结果显示：在HCC组织中CYB561 mRNA的相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。另外，基于TNMplot数据库的基因芯片数据集（包含了配对和非配对的HCC样本数据），分析结果显示：在HCC组织中CYB561 mRNA的相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。具体见补充材料的图1。
图1
示HCC 组织中CYB561 mRNA表达与HCC患者生存之间的关系
a： 通过TIMER数据库构建的CYB561 mRNA表达与肿瘤预后的Cox比例风险回归模型；b～e：分别是HCC组织中CYB561 mRNA表达与HCC患者的 OS （b）、RFS（c）、 PFS（d）和 DSS（e）曲线
2.2 CYB561 mRNA在HCC中的表达与不良预后相关
根据TIMER数据库资料构建CYB561 mRNA表达与HCC预后的Cox比例风险回归模型，其结果显示：CYB561 mRNA表达与HCC的预后相关（P<0.05，图1a ）。通过Kaplan-Meier Plotter数据库资料绘制不同CYB561 mRNA表达HCC患者的生存曲线，并采用log-rank检验进行分析，结果显示：与CYB561 mRNA表达阴性HCC患者相比，CYB561 mRNA表达阳性的HCC患者拥有更差的总生存期（overall survival， OS）、无复发生存期（recurrence-free survival， RFS）、无进展生存期（progression-free survival， PFS）和无病生存期（disease-free survival， DSS），均P<0.05（图1b～1e）。
2.3 CYB561蛋白表达与HCC患者预后关系分析结果
本研究检测了61对HCC组织及其癌旁组织中的CYB561蛋白表达情况（图2a和2b）， 其结果显示：CYB561蛋白主要定位于细胞质中，在HCC组织和癌旁组织中的表达阳性率分别为57.38%（35/61）和21.31%（13/61），前者高于后者，差异有统计学意义（χ2=16.624，P＜0.001）。为了探讨CYB561蛋白表达与HCC患者预后的关系，根据IHC评分结果，61例患者中CYB561蛋白表达阳性35例，表达阴性26例；采用Kaplan-Meier 法绘制2组患者的生存曲线，结果显示：CYB561蛋白表达阳性患者的OS差于表达阴性患者（P＜0.05，图2c）。进一步分析CYB561蛋白表达与 HCC患者临床病理特征的关系以及影响OS的因素，其结果显示：CYB561蛋白的表达与肿瘤组织学分级有关（P=0.001），但与其他临床病理特征无关（P＞0.05），具体见表1。采用Cox比例风险回归模型分析HCC患者术后OS的影响因素，单因素分析结果显示：原发病灶数（P=0.001）、组织学分级（P=0.001）、病理分期（P=0.001）和CYB651蛋白表达（P=0.036）是HCC患者术后OS的影响因素（表2）；多因素分析结果显示：组织学分级Ⅲ ～Ⅳ级（P=0.001）和CYB561蛋白阳性表达（P=0.009）是HCC患者术后OS的危险因素（表3）。
图2
示HCC组织和癌旁组织中CYB561蛋白的表达及CYB561蛋白表达阳性和阴性患者的OS曲线
a：CYB561蛋白在HCC组织中有代表性的阳性及阴性表达（IHC）；b： CYB561蛋白在癌旁组织中有代表性的阳性及阴性表达（IHC）；c： CYB561蛋白表达阳性和阴性患者的OS曲线
表1
HCC中CYB561蛋白的表达与HCC患者临床病理特征间的关系（例）
表2
61 例HCC患者OS影响因素的单因素 Cox 比例风险回归分析结果
表3
61 例HCC患者OS影响因素的多因素 Cox比例风险回归分析结果
3 讨论
HCC是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，发病率高，治愈率低，给HCC患者家庭带来严重经济负担。在过去的20年中，HCC患者的预后几乎没有改善，尽管目前出现了新的治疗策略，但HCC的总体预后仍然令人担忧。因此，迫切需要寻找新的分子机制和诊断标志物，以开发有效治疗HCC的策略。
CYB561是一个单拷贝的蛋白编码基因，在整个系统发育中高度保守[10]，其在多种癌症和组织中高表达，如神经内分泌组织，并促进抗去势神经内分泌卵巢癌的生长和转移[11]。此外，CYB561在乳腺癌中的表达增高提示患者的预后不良，并且与乳腺癌的免疫细胞浸润有关 [12-13]。有研究 [14]报道称Burkitt淋巴瘤中 CYB561A3敲除可导致溶酶体和线粒体呼吸功能损伤，诱导严重的铁死亡，得出CYB561A3是Burkitt细胞生长和存活所必需的关键溶酶体铁还原酶。CYB561可以作为抗坏血酸跨膜运输的电子供体，也可以还原铁离子[7]。抗坏血酸和铁是细胞的重要组成成分，在许多代谢反应中是必需的辅助因子。研究[15]表明，抗坏血酸与仑伐替尼和瑞戈非尼的协同效应可作为HCC靶向治疗的辅助剂。同时，抗坏血酸促进铁的吸收并调节其代谢[16]。铁在癌症发生、发展和转移中扮演着不同的角色，铁元素是HCC发生的潜在危险因素，并且参与铁代谢调节的一些分子通常在肿瘤细胞中表达上调，肿瘤细胞的生长依赖于微量铁元素，以便促进肿瘤细胞的生存、增殖和转移[17]。CYB561具有跨膜电子转移载体和铁还原酶的功能，可能参与了铁代谢途径，使其成为潜在的治疗靶点。
本研究对多种数据库中有关HCC患者资料进行分析，发现CYB561在HCC组织中的表达高于癌旁组织，提示其可能在HCC的发生和发展中发挥重要作用。本研究通过IHC技术验证CYB561蛋白表达于细胞质中，并且在HCC组织中的表达阳性率明显高于癌旁组织，提示CYB561可能对HCC的发生发展起到促进作用。进一步分析HCC组织中CYB561蛋白的表达与HCC临床病理特征的关系，结果显示CYB561蛋白的阳性表达与肿瘤的组织学分级有相关性，提示CYB561 可能与HCC恶性进展有关。Cox比例风险回归模型分析结果显示CYB561阳性表达是影响HCC患者生存预后的危险因素。相关研究显示，CYB561在乳腺癌[12]、卵巢癌[11]、非小细胞肺癌[18]等肿瘤中高表达，且与肿瘤进展与不良预后密切相关。本研究结果进一步证实 HCC中CYB561的表达也可作为衡量HCC恶性程度的重要指标之一。这提示CYB561的表达水平与HCC疾病的发生、病情发展及预后有关， CYB561可能是HCC治疗潜在的靶点和生物学标志物，为 HCC的诊断、预后判断和治疗提供新思路。
本研究存在一定的局限性：仅使用生物信息学分析了CYB561在人类基因转录组水平方面的特征，并且纳入的临床样本数量相对较少，结果及结论可能会存在偏倚，未来需要继续扩大研究样本量，以获得更准确的研究结果；并且本研究缺少细胞、动物等基础实验进行验证；CYB561在HCC中参与调控的信号通路也有待进一步证明。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：杜静芳进行临床资料收集、数据分析并撰写论文；叶涛、郝瑞英和卓见协助数据收集及分析；李沙指导论文修改；刘伟光负责研究方案设计、研究过程管理和论文的修改；张瑞英提供研究思路和论文修改。
伦理声明：本研究通过了河北工程大学附属医院医学伦理委员会的审批，批文编号：2023［K］109。
