引用本文： 王朝樣, 林浩, 张海宝, 巨家华, 俞永江. 肠道菌群对结直肠癌术后吻合口漏影响的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(11): 1522-1527. doi: 10.7507/1007-9424.202205030 复制
结直肠癌最佳的外科治疗方法是根治性切除肿瘤并重建消化道。尽管外科医生遵循个体化治疗原则，术中尽量减少对组织的损伤并保证吻合口血供、降低吻合口张力和采用了恰当的吻合技术，但术后吻合口漏的发生仍不可忽视[1]，有文献[2]报道其发生率为1%～19%。术后发生吻合口漏会增加住院费用和延长住院时间，影响其短期和长期预后，甚至提高病死率。近年来，研究者们[3-5]对结直肠癌根治术后吻合口漏发生的潜在危险因素进行了广泛研究，并且认为吻合口漏的发生归因于多种因素，如年龄≥60岁、男性、体质量指数≥25 kg/m2、吸烟、合并糖尿病等、术前使用非甾体类药物、术前白蛋白＜35 g/L、术后白蛋白＜32 g/L、术前贫血、围术期输血（术中及术后2 d内）、新辅助放化疗、术前口服抗生素肠道准备、美国麻醉医师协会评分分级≥Ⅲ级、肿瘤TNM分期Ⅲ和Ⅴ期、吻合口距肛缘距离＜7 cm、吻合技术等，但其发病机制仍未完全明了。近来有研究[6]又发现，肠道菌群的组成和多样性改变可能也与结直肠癌根治术后吻合口漏的发生有潜在的联系。因此，笔者就近年来结直肠癌围术期肠道菌群变化情况及其影响吻合口漏研究的相关文献进行综述，以了解其相互作用及其潜在的机制，为临床管理结直肠癌手术患者及后续研究提供一定的参考。
1 肠道菌群情况
人类肠道含有超过百亿的微生物，这些微生物共同构成了肠道微生物群如细菌、病毒、真菌、古生菌等，其通过与宿主的持续协同相互作用，在维持机体健康和诱导疾病发生中发挥着至关重要的作用，其中已有超过2 000多种细菌构成了肠道菌群。多数肠道菌群分属于4种门类：厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门[7]。正常情况下，结直肠中的优势菌门是厚壁菌门和拟杆菌门，其可保护肠道上皮免受病原菌的入侵，同时可诱导并促进健康的免疫反应[8]。但有研究[9-11]表明，在结直肠癌患者的肠道菌群中，芽孢杆菌科（厚壁菌门）、葡萄球菌科（厚壁菌门）、梭杆菌属（梭杆菌门）、另枝菌属（拟杆菌门）、卟啉单胞菌属（拟杆菌门）、阿克曼菌（疣微菌门）和脆弱拟杆菌（拟杆菌门）数量较多，而罗氏菌属（放线菌门）、双歧杆菌（放线菌门）、乳杆菌（厚壁菌门）、瘤胃球菌（厚壁菌门）、普拉梭菌（厚壁菌门）和密螺旋体（螺旋体属）数量缺乏。此外，结直肠癌术后肠道菌群也会发生明显变化，主要体现在：专性厌氧菌显著减少，病原菌如肠杆菌科（变形菌门）、肠球菌（厚壁菌门）、葡萄球菌（厚壁菌门）和假单胞菌（变形菌门）数量增加，有机酸浓度也有显著变化，如短链脂肪酸浓度显著降低[12]，并且这种成分的变化几乎是立刻发生，这种变化在Guyton等[13]的研究中得以证实，在结肠切除和吻合后的几小时内，优势菌门种类如拟杆菌门和厚壁菌门减少了90%，其中厚壁菌门中的粪肠球菌则增加了500倍；另外Shogan等[14]通过16S rRNA测序分析结肠切除大鼠模型中肠腔和黏膜的相关菌群变化亦发现，吻合口组织中肠球菌和埃希菌或志贺菌的相对丰度显著增加（分别为500倍和200倍）。因此，通过对这些菌群变化情况的了解，有助于进一步阐明肠道菌群失调与结直肠癌术后吻合口漏之间的联系。
2 肠道菌群与吻合口漏的关系
通常结直肠吻合完成后，宿主会立即启动组织修复过程即吻合口愈合过程，该过程中的生理反应被分为3个连续和重叠的阶段—炎症、增殖和重塑[15]。在炎症阶段，会产生富含纤维蛋白或纤维连接蛋白的基质，任何潜在的入侵微生物将被清除；在增殖阶段，成纤维细胞和肌成纤维细胞被巨噬细胞释放的化学诱导剂所吸引，同时导致不同类型（Ⅰ～Ⅳ型）的胶原蛋白被沉积，从而增强愈合组织的强度；在重塑阶段，Ⅲ型胶原蛋白被基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）分解，取而代之的是瘢痕组织中主要的Ⅰ型胶原蛋白，同时脉管系统得到重新排列[16]。
吻合口的最终愈合过程涉及肠上皮屏障的重建及肠道微环境的许多组成成分如宿主细胞（上皮细胞和固有层细胞）、微生物群以及胃肠道腔内的膳食和非膳食成分[16]。肠道菌群可通过不同细菌种类之间的竞争和（或）协作来促进或抑制吻合口的愈合。
2015年，Lee等[17]从结直肠癌患者术后发生吻合口漏的143例患者的腹腔液或引流液中分离出的病原体发现，从渗漏部位分离出来的最主要的病原菌是粪肠球菌，其次为铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等；另外，Komen等[18]通过定量逆转录-PCR评估了243例接受肠切除肠吻合术患者的腹腔引流液，发现发生吻合口漏患者的引流液中大肠杆菌和粪肠球菌浓度显著增加，还提出了在术后第2天和第3天对引流液进行粪肠球菌定量逆转录-PCR检测可能是一种简单且低成本的吻合口漏筛查方法。
以上研究结果提示，厚壁菌门的粪肠球菌、变形菌门的铜绿假单胞菌和大肠杆菌可能与吻合口漏有关，其可能的原因是它们具有产生明胶酶的能力，因明胶酶是能够降解胶原蛋白的一种基质水解酶，但还需要更多的临床研究来验证肠道菌群与吻合口漏的关系。
3 肠道菌群引发吻合口漏的可能机制
吻合口漏发生的一个潜在危险因素是宿主组织细胞外基质蛋白的降解。研究[19]证明，细胞外基质中的胶原蛋白降解酶在肠吻合口的早期愈合阶段扮演重要的角色，它们的平衡调节很重要，可以在不危及新形成的胶原层完整性的情况下进行胶原重组。在结直肠中，某些肠道微生物有可能直接激活MMP的活性，引起胶原蛋白降解的失衡，从而影响吻合口的愈合[20]。
胶原蛋白水解酶（简称“胶原酶”）是一种关键的细菌外产物，可以降解对吻合口愈合至关重要的Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白。Olivas等[21]在大鼠模型中证明了铜绿假单胞菌可以被吻合口组织中存在的宿主因素激活以表达胶原酶，提示铜绿假单胞菌菌株可以改变其表型，不仅改变其在吻合口组织部位的抗生素耐药性，而且可以在体内诱导表达组织降解胶原酶，从而导致吻合口漏发生。另外，粪肠球菌能够产生明胶酶，它通过分解胶原蛋白和激活能够降解胶原蛋白的MMP而促进吻合口漏的发生[22]，这一论点在Shogan等[23]的研究中得到证实。在Shogan等[23]的研究中，利用大鼠模型证实了粪肠球菌通过降解宿主肠道组织中的胶原蛋白和激活组织MMP-9导致了吻合口漏的发生；他们还对接受结肠术后患者的吻合口黏膜进行了细菌培养，在64个培养的菌株中发现只有铜绿假单胞菌和粪肠球菌显示出了显著的胶原蛋白降解活性和MMP-9裂解能力，进一步证实了这一结论。此外，Hyoju等[24]在结直肠手术动物模型中证明了黏质沙雷菌的胶原酶溶解菌株在吻合口漏的发病机制中也起关键作用和致病作用。2021年，一项临床研究[25]显示，74%的吻合口漏患者有产生胶原酶的细菌如粪肠球菌定植（P=0.022），并且抗生素耐药菌在吻合口漏患者中更为常见（P=0.01）。另外，MMP的重要性及其在吻合口完整性中的作用通过一系列病例进一步表征，这些病例研究了给予MMP抑制剂（包括强力霉素）后肠吻合口的强度，结果发现，添加MMP抑制剂可改善术后吻合口的组织强度和组织完整性[26]。
综上所述，在吻合口漏的发病机制中，胶原酶产生菌如粪肠球菌、铜绿假单胞菌和黏质沙雷菌起着关键作用和致病作用，提示了某些特定细菌通过细菌胶原酶的表达和宿主肠道MMP的过度激活导致胶原蛋白降解，从而在吻合口漏的发展中发挥作用。
4 围术期干预对肠道菌群及术后吻合口漏的影响
4.1 围术期干预措施对肠道菌群的影响
围术期干预措施如禁食、机械性肠道准备和口服或静脉注射抗生素通常会干扰肠道菌群，目前有证据[27]表明，肠道菌群在内脏手术围术期发生了局部改变，尤其是在吻合口部位。目前对肠道菌群的结构或功能影响的了解甚少。随着肠道取样技术、测序技术和蛋白质产物（转录组学）分析技术的进步，扩展了表征肠道微生物群的能力，并且确定了肠道菌群可能影响吻合口的愈合，从而导致或预防吻合口漏。围术期的干预有可能导致剧毒菌群如肠球菌、假单胞菌的大量繁殖，这些细菌能够根据环境提示转变为更具侵袭性和破坏组织的表型[23]。
4.1.1 机械性肠道准备对肠道菌群的影响
术前机械性肠道准备（口服导泻药来清除肠腔内粪便）在术前以多种方式改变了患者的肠道菌群，其有利亦有弊。① 一项评估术前机械性肠道准备对结直肠癌切除患者粪便菌群影响的随机对照试验[28]结果表明，术后双歧杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、肠杆菌科和乳杆菌的数量显著减少，而肠球菌和葡萄球菌的数量无明显减少。② Gaines等[29]的研究结果显示，在非肥胖患者中机械性肠道准备导致胶原酶产生细菌的抑制，而在肥胖患者中则不然，这可能解释了肥胖患者吻合口漏发生率和癌复发风险更高的原因。③ 从黏膜层分泌的黏液是胃肠道吻合口愈合的必要因素，黏膜层的微生物群决定了肠道内上皮细胞和免疫细胞的功能，这两种细胞是促进肠吻合口愈合的已知因素，黏液在其中起屏障作用，限制了肠腔细菌与肠上皮接触以及随之而来的有害影响。然而由于术前机械性肠道准备（以聚乙二醇为基础的准备工作）是有效地清除了肠道黏液，腔外细菌未能冲洗，从而改变了微生物群平衡；此外， 在机械性肠道准备过程中将氧气输送至肠腔，从而对厌氧菌种群产生负面影响，而且还能减少用于细菌新陈代谢营养物质的可获得性，这些因素都可以迅速改变肠道菌群的组成和动态平衡，从而影响肠道屏障的完整性[30]；同时手术也会导致手术部位的组织损伤和缺血，从而改变肠道黏液的产生。由于缺乏保护性黏液层以及正常保护性微生物群的上皮暴露，允许了病原体被黏附和迁移，因而会导致一些不良后果如吻合口漏[31]。
4.1.2 围术期抗生素应用对肠道菌群的影响
目前标准的预防性抗生素方案具有广谱性，因此无法选择性地针对特定的病原体。在一项早期研究[32]中报道，口服阿莫西林5 d，肠道菌群的多样性和丰度在第1天就显著降低，其组成到第60天时部分恢复到约90%。关于静脉注射抗生素，使用β-内酰胺类药物（氨苄西林、头孢唑林和舒巴坦）可导致治疗结束后拟杆菌门减少和厚壁菌门增加[33]；β-内酰胺类和氟喹诺酮类药物的应用导致微生物多样性显著减少，增加了拟杆菌门/厚壁菌门比例[34]。从上述研究中可以看出，围术期抗生素应用，即使是短期使用也会导致对肠道菌群有害的现象持续数月，抗生素的非特异性抗菌作用导致肠道菌群失调，大大降低了微生物的多样性，有利于条件致病菌的增加。
4.1.3 机械性肠道准备和抗生素联合应用对肠道菌群的影响
联合使用机械性肠道准备和抗生素，可能会导致肠道菌群发生有益的变化[35]。已有回顾性研究[36]证明，术前机械性肠道准备和抗生素联合使用可显著降低术后并发症发生率，包括吻合口漏、肠梗阻和外科手术部位感染。Klinger等[37]分析了27 804例接受择期结直肠切除术的患者，发现机械性肠道准备和口服抗生素联合应用可显著降低手术部位感染、器官间隙感染、伤口裂开和吻合口漏的发生率。另有一项临床试验[38]亦证实了机械性肠道准备和抗生素联合使用可显著降低结直肠癌术后患者的吻合口漏发生率。因此，基于这些临床研究结果，对于择期接受结肠或直肠切除术的患者，建议尽可能同时使用机械性肠道准备和口服抗生素进行肠道准备。
4.2 围术期干预措施对吻合口漏的影响
4.2.1 手术本身对吻合口漏的影响
手术本身的损害可能会改变宿主微生物群的毒力，同时增加术后并发症的风险，尤其是吻合口漏。但手术后菌群失调与吻合口漏之间的因果关系需要通过临床试验来验证。Ohigashi等[12]利用定量-逆转录PCR检测到结直肠癌术后肠道微生物群会发生迅速的表型转变且微生物密度和代谢物产生巨大变化，对维持胃肠道稳态有非常重要作用的专性厌氧菌如球形梭菌、柔嫩梭菌、脆弱拟杆菌、双歧杆菌、阿托波菌和普雷沃特菌数量会减少。van Praagh等[39]从进行了结直肠吻合术患者的吻合口切缘中分离出细菌DNA并进行分析发现，后续发展为吻合口漏患者的吻合口切缘中微生物多样性较低且与黏蛋白降解有关的拟杆菌科和毛螺菌科增多。此外，在肠切除时肠腔暴露在氧气中，在血管结扎时会造成局部血液供应暂时中断。在一项对小肠移植患者的研究[40]中发现，在改道的结肠中，专性厌氧菌包括类杆菌和索状芽孢杆菌被耗尽，而乳杆菌和肠杆菌科兼性厌氧菌的数量增加。这些研究为肠道手术导致的菌群失调与吻合口漏之间的因果关系分析提供了一些合理的原因。
4.2.2 围术期干预改善肠道菌群失调对吻合口漏的影响
前面已描述吻合口漏可能是由产生胶原酶的肠道病原菌引起的，而且肠道黏液对吻合口愈合非常重要，但常规的术前肠道准备并不能减少条件致病菌定植，而且改变了肠道黏液形成，因此需要考虑新的策略来控制这些病原菌的毒力。群体感应是细菌毒力激活的细胞间通讯系统，某些条件致病菌可以通过群体感应来触发其编码胶原酶的gelE基因表达[41]；并且细菌拥有极其敏感的感觉系统来检测细胞外磷酸盐浓度。因此，Hyoju等[24]提出了基于磷酸盐治疗的方法，其利用细胞外磷酸盐来抑制群体感应，作为一种在不影响细菌生长的情况下减弱细菌毒力的方法，在小鼠模型中证明了口服多磷酸盐显著减弱了吻合口组织中黏质沙门菌和铜绿假单胞菌的定植和胶原酶活性，从而防止了吻合口漏发生。在Wiegerinck等[42]的小鼠实验数据亦表明，口服多磷酸化聚合物ABA-PEG20K-Pi20显著抑制了粪肠球菌中胶原酶的产生并预防吻合口漏。另外，Nichols等[43]研究发现，不同形式的磷酸盐的持续释放抑制了细菌胶原酶的形成，可以在不根除肠道愈合过程中的保护性菌群的情况下减弱组织破坏性细菌表型的表达。因此，为准备肠道吻合手术的患者提供多磷酸盐可能代表了一种预防吻合口漏的新方法。此外，丁酸盐作为一种有益的短链脂肪酸，由肠道细菌通过膳食纤维发酵形成，是结肠上皮细胞的主要能量来源，有利于结肠上皮细胞增殖、维持黏膜层厚度和保持肠道屏障功能及完整性[44]。在一项针对丁酸盐的不同给药途径提高大鼠结肠吻合强度的对比研究[45]中发现，丁酸盐灌肠与更好的吻合口愈合有关。另外鉴于菊粉、半乳糖等低聚糖类益生元能够增加短链脂肪酸的产生和促进上皮修复，Hajjar等[46]通过围手术期给予小鼠模型菊粉和低聚半乳糖，结果发现，菊粉和低聚半乳糖饮食的小鼠吻合口周围组织中的胶原蛋白浓度较高，加速了吻合口愈合并增强了肠道屏障。以上这些研究结果提示，丁酸盐对结肠上皮的增殖作用表明与组织修复和黏膜连续性有关，有可能可以防止吻合口部位的渗漏。
综上所述，肠道菌群的个体组成及其围术期成分的变化，可由各种原因解释，如机械肠道准备、口服抗生素、结直肠手术本身等，可能对患者的病程有重要影响。因此，围术期调整肠道菌群组成的措施对于降低吻合口漏的发生率可能具有临床意义。
5 小结与展望
微生物组是一个新的且非常有前景的研究领域，尤其是在研究结直肠癌手术中吻合口漏的病因时。现有的研究证据表明，肠道微生物群与宿主之间存在着强烈的双向作用，并且这种微生物群-宿主关系在结直肠癌术后引起和（或）加剧吻合口漏中发挥重要作用。但是现有的证据仍然有限，需要进一步的研究来确切地阐明肠道微生物群变化是如何导致吻合口漏的，从而以此为依据，识别出具有不良微生物组的高危患者如具有高胶原酶活性的病原体，并根据需要对其采取适当的经口、静脉或灌肠的抗生素方案和（或）菌种移植，可能有助于降低吻合口漏发生率。
目前，已有一些针对肠道菌群在吻合口漏有关治疗中潜在作用的研究，然而这些研究有诸多不足：① 这些研究多是探索性的，而且多数研究样本量小且多在动物模型中完成，而关于结直肠癌患者肠道菌群与吻合口漏之间关系的临床研究非常有限；② 在对于动物的研究中看到，将人类粪便移植到动物身体内时，细菌定植的发展与人类不同，宿主免疫反应可能不同；③ 在制作动物模型时，需要考虑到基因组学、肿瘤固有特征、动物微生物组与种植的人类细菌之间的竞争等因素，唯有如此才能更准确地优化动物模型，使其更接近于人类肠道中的情况；④ 由于宿主遗传、环境和生活方式因素的差异如种族、地理位置、饮食等，不同个体之间微生物群的成分存在一定差异，可能导致针对人体的研究结果存在极端差异。针对以上不足，有必要进行更大规模及多中心的分析，以确定可能达成共识的结直肠癌术后与吻合口漏相关的微生物组；此外，从本综述结果看，围术期各项干预措施对肠道菌群会产生重要影响，并且结直肠癌术后肠道菌群也会发生显著变化。因此，外科医生在围术期对患者的管理中应努力减少对肠道菌群平衡的过度干扰，减少一些非必要药物的使用，可在有适应证的情况下适当应用口服抗生素或进行肠道准备。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王朝樣查阅文献、设计选题及撰写文章；林浩、张海宝、巨家华参与查阅文献；俞永江校对文章及指导选题设计。
结直肠癌最佳的外科治疗方法是根治性切除肿瘤并重建消化道。尽管外科医生遵循个体化治疗原则，术中尽量减少对组织的损伤并保证吻合口血供、降低吻合口张力和采用了恰当的吻合技术，但术后吻合口漏的发生仍不可忽视[1]，有文献[2]报道其发生率为1%～19%。术后发生吻合口漏会增加住院费用和延长住院时间，影响其短期和长期预后，甚至提高病死率。近年来，研究者们[3-5]对结直肠癌根治术后吻合口漏发生的潜在危险因素进行了广泛研究，并且认为吻合口漏的发生归因于多种因素，如年龄≥60岁、男性、体质量指数≥25 kg/m2、吸烟、合并糖尿病等、术前使用非甾体类药物、术前白蛋白＜35 g/L、术后白蛋白＜32 g/L、术前贫血、围术期输血（术中及术后2 d内）、新辅助放化疗、术前口服抗生素肠道准备、美国麻醉医师协会评分分级≥Ⅲ级、肿瘤TNM分期Ⅲ和Ⅴ期、吻合口距肛缘距离＜7 cm、吻合技术等，但其发病机制仍未完全明了。近来有研究[6]又发现，肠道菌群的组成和多样性改变可能也与结直肠癌根治术后吻合口漏的发生有潜在的联系。因此，笔者就近年来结直肠癌围术期肠道菌群变化情况及其影响吻合口漏研究的相关文献进行综述，以了解其相互作用及其潜在的机制，为临床管理结直肠癌手术患者及后续研究提供一定的参考。
1 肠道菌群情况
人类肠道含有超过百亿的微生物，这些微生物共同构成了肠道微生物群如细菌、病毒、真菌、古生菌等，其通过与宿主的持续协同相互作用，在维持机体健康和诱导疾病发生中发挥着至关重要的作用，其中已有超过2 000多种细菌构成了肠道菌群。多数肠道菌群分属于4种门类：厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门[7]。正常情况下，结直肠中的优势菌门是厚壁菌门和拟杆菌门，其可保护肠道上皮免受病原菌的入侵，同时可诱导并促进健康的免疫反应[8]。但有研究[9-11]表明，在结直肠癌患者的肠道菌群中，芽孢杆菌科（厚壁菌门）、葡萄球菌科（厚壁菌门）、梭杆菌属（梭杆菌门）、另枝菌属（拟杆菌门）、卟啉单胞菌属（拟杆菌门）、阿克曼菌（疣微菌门）和脆弱拟杆菌（拟杆菌门）数量较多，而罗氏菌属（放线菌门）、双歧杆菌（放线菌门）、乳杆菌（厚壁菌门）、瘤胃球菌（厚壁菌门）、普拉梭菌（厚壁菌门）和密螺旋体（螺旋体属）数量缺乏。此外，结直肠癌术后肠道菌群也会发生明显变化，主要体现在：专性厌氧菌显著减少，病原菌如肠杆菌科（变形菌门）、肠球菌（厚壁菌门）、葡萄球菌（厚壁菌门）和假单胞菌（变形菌门）数量增加，有机酸浓度也有显著变化，如短链脂肪酸浓度显著降低[12]，并且这种成分的变化几乎是立刻发生，这种变化在Guyton等[13]的研究中得以证实，在结肠切除和吻合后的几小时内，优势菌门种类如拟杆菌门和厚壁菌门减少了90%，其中厚壁菌门中的粪肠球菌则增加了500倍；另外Shogan等[14]通过16S rRNA测序分析结肠切除大鼠模型中肠腔和黏膜的相关菌群变化亦发现，吻合口组织中肠球菌和埃希菌或志贺菌的相对丰度显著增加（分别为500倍和200倍）。因此，通过对这些菌群变化情况的了解，有助于进一步阐明肠道菌群失调与结直肠癌术后吻合口漏之间的联系。
2 肠道菌群与吻合口漏的关系
通常结直肠吻合完成后，宿主会立即启动组织修复过程即吻合口愈合过程，该过程中的生理反应被分为3个连续和重叠的阶段—炎症、增殖和重塑[15]。在炎症阶段，会产生富含纤维蛋白或纤维连接蛋白的基质，任何潜在的入侵微生物将被清除；在增殖阶段，成纤维细胞和肌成纤维细胞被巨噬细胞释放的化学诱导剂所吸引，同时导致不同类型（Ⅰ～Ⅳ型）的胶原蛋白被沉积，从而增强愈合组织的强度；在重塑阶段，Ⅲ型胶原蛋白被基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）分解，取而代之的是瘢痕组织中主要的Ⅰ型胶原蛋白，同时脉管系统得到重新排列[16]。
吻合口的最终愈合过程涉及肠上皮屏障的重建及肠道微环境的许多组成成分如宿主细胞（上皮细胞和固有层细胞）、微生物群以及胃肠道腔内的膳食和非膳食成分[16]。肠道菌群可通过不同细菌种类之间的竞争和（或）协作来促进或抑制吻合口的愈合。
2015年，Lee等[17]从结直肠癌患者术后发生吻合口漏的143例患者的腹腔液或引流液中分离出的病原体发现，从渗漏部位分离出来的最主要的病原菌是粪肠球菌，其次为铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等；另外，Komen等[18]通过定量逆转录-PCR评估了243例接受肠切除肠吻合术患者的腹腔引流液，发现发生吻合口漏患者的引流液中大肠杆菌和粪肠球菌浓度显著增加，还提出了在术后第2天和第3天对引流液进行粪肠球菌定量逆转录-PCR检测可能是一种简单且低成本的吻合口漏筛查方法。
以上研究结果提示，厚壁菌门的粪肠球菌、变形菌门的铜绿假单胞菌和大肠杆菌可能与吻合口漏有关，其可能的原因是它们具有产生明胶酶的能力，因明胶酶是能够降解胶原蛋白的一种基质水解酶，但还需要更多的临床研究来验证肠道菌群与吻合口漏的关系。
3 肠道菌群引发吻合口漏的可能机制
吻合口漏发生的一个潜在危险因素是宿主组织细胞外基质蛋白的降解。研究[19]证明，细胞外基质中的胶原蛋白降解酶在肠吻合口的早期愈合阶段扮演重要的角色，它们的平衡调节很重要，可以在不危及新形成的胶原层完整性的情况下进行胶原重组。在结直肠中，某些肠道微生物有可能直接激活MMP的活性，引起胶原蛋白降解的失衡，从而影响吻合口的愈合[20]。
胶原蛋白水解酶（简称“胶原酶”）是一种关键的细菌外产物，可以降解对吻合口愈合至关重要的Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白。Olivas等[21]在大鼠模型中证明了铜绿假单胞菌可以被吻合口组织中存在的宿主因素激活以表达胶原酶，提示铜绿假单胞菌菌株可以改变其表型，不仅改变其在吻合口组织部位的抗生素耐药性，而且可以在体内诱导表达组织降解胶原酶，从而导致吻合口漏发生。另外，粪肠球菌能够产生明胶酶，它通过分解胶原蛋白和激活能够降解胶原蛋白的MMP而促进吻合口漏的发生[22]，这一论点在Shogan等[23]的研究中得到证实。在Shogan等[23]的研究中，利用大鼠模型证实了粪肠球菌通过降解宿主肠道组织中的胶原蛋白和激活组织MMP-9导致了吻合口漏的发生；他们还对接受结肠术后患者的吻合口黏膜进行了细菌培养，在64个培养的菌株中发现只有铜绿假单胞菌和粪肠球菌显示出了显著的胶原蛋白降解活性和MMP-9裂解能力，进一步证实了这一结论。此外，Hyoju等[24]在结直肠手术动物模型中证明了黏质沙雷菌的胶原酶溶解菌株在吻合口漏的发病机制中也起关键作用和致病作用。2021年，一项临床研究[25]显示，74%的吻合口漏患者有产生胶原酶的细菌如粪肠球菌定植（P=0.022），并且抗生素耐药菌在吻合口漏患者中更为常见（P=0.01）。另外，MMP的重要性及其在吻合口完整性中的作用通过一系列病例进一步表征，这些病例研究了给予MMP抑制剂（包括强力霉素）后肠吻合口的强度，结果发现，添加MMP抑制剂可改善术后吻合口的组织强度和组织完整性[26]。
综上所述，在吻合口漏的发病机制中，胶原酶产生菌如粪肠球菌、铜绿假单胞菌和黏质沙雷菌起着关键作用和致病作用，提示了某些特定细菌通过细菌胶原酶的表达和宿主肠道MMP的过度激活导致胶原蛋白降解，从而在吻合口漏的发展中发挥作用。
4 围术期干预对肠道菌群及术后吻合口漏的影响
4.1 围术期干预措施对肠道菌群的影响
围术期干预措施如禁食、机械性肠道准备和口服或静脉注射抗生素通常会干扰肠道菌群，目前有证据[27]表明，肠道菌群在内脏手术围术期发生了局部改变，尤其是在吻合口部位。目前对肠道菌群的结构或功能影响的了解甚少。随着肠道取样技术、测序技术和蛋白质产物（转录组学）分析技术的进步，扩展了表征肠道微生物群的能力，并且确定了肠道菌群可能影响吻合口的愈合，从而导致或预防吻合口漏。围术期的干预有可能导致剧毒菌群如肠球菌、假单胞菌的大量繁殖，这些细菌能够根据环境提示转变为更具侵袭性和破坏组织的表型[23]。
4.1.1 机械性肠道准备对肠道菌群的影响
术前机械性肠道准备（口服导泻药来清除肠腔内粪便）在术前以多种方式改变了患者的肠道菌群，其有利亦有弊。① 一项评估术前机械性肠道准备对结直肠癌切除患者粪便菌群影响的随机对照试验[28]结果表明，术后双歧杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、肠杆菌科和乳杆菌的数量显著减少，而肠球菌和葡萄球菌的数量无明显减少。② Gaines等[29]的研究结果显示，在非肥胖患者中机械性肠道准备导致胶原酶产生细菌的抑制，而在肥胖患者中则不然，这可能解释了肥胖患者吻合口漏发生率和癌复发风险更高的原因。③ 从黏膜层分泌的黏液是胃肠道吻合口愈合的必要因素，黏膜层的微生物群决定了肠道内上皮细胞和免疫细胞的功能，这两种细胞是促进肠吻合口愈合的已知因素，黏液在其中起屏障作用，限制了肠腔细菌与肠上皮接触以及随之而来的有害影响。然而由于术前机械性肠道准备（以聚乙二醇为基础的准备工作）是有效地清除了肠道黏液，腔外细菌未能冲洗，从而改变了微生物群平衡；此外， 在机械性肠道准备过程中将氧气输送至肠腔，从而对厌氧菌种群产生负面影响，而且还能减少用于细菌新陈代谢营养物质的可获得性，这些因素都可以迅速改变肠道菌群的组成和动态平衡，从而影响肠道屏障的完整性[30]；同时手术也会导致手术部位的组织损伤和缺血，从而改变肠道黏液的产生。由于缺乏保护性黏液层以及正常保护性微生物群的上皮暴露，允许了病原体被黏附和迁移，因而会导致一些不良后果如吻合口漏[31]。
4.1.2 围术期抗生素应用对肠道菌群的影响
目前标准的预防性抗生素方案具有广谱性，因此无法选择性地针对特定的病原体。在一项早期研究[32]中报道，口服阿莫西林5 d，肠道菌群的多样性和丰度在第1天就显著降低，其组成到第60天时部分恢复到约90%。关于静脉注射抗生素，使用β-内酰胺类药物（氨苄西林、头孢唑林和舒巴坦）可导致治疗结束后拟杆菌门减少和厚壁菌门增加[33]；β-内酰胺类和氟喹诺酮类药物的应用导致微生物多样性显著减少，增加了拟杆菌门/厚壁菌门比例[34]。从上述研究中可以看出，围术期抗生素应用，即使是短期使用也会导致对肠道菌群有害的现象持续数月，抗生素的非特异性抗菌作用导致肠道菌群失调，大大降低了微生物的多样性，有利于条件致病菌的增加。
4.1.3 机械性肠道准备和抗生素联合应用对肠道菌群的影响
联合使用机械性肠道准备和抗生素，可能会导致肠道菌群发生有益的变化[35]。已有回顾性研究[36]证明，术前机械性肠道准备和抗生素联合使用可显著降低术后并发症发生率，包括吻合口漏、肠梗阻和外科手术部位感染。Klinger等[37]分析了27 804例接受择期结直肠切除术的患者，发现机械性肠道准备和口服抗生素联合应用可显著降低手术部位感染、器官间隙感染、伤口裂开和吻合口漏的发生率。另有一项临床试验[38]亦证实了机械性肠道准备和抗生素联合使用可显著降低结直肠癌术后患者的吻合口漏发生率。因此，基于这些临床研究结果，对于择期接受结肠或直肠切除术的患者，建议尽可能同时使用机械性肠道准备和口服抗生素进行肠道准备。
4.2 围术期干预措施对吻合口漏的影响
4.2.1 手术本身对吻合口漏的影响
手术本身的损害可能会改变宿主微生物群的毒力，同时增加术后并发症的风险，尤其是吻合口漏。但手术后菌群失调与吻合口漏之间的因果关系需要通过临床试验来验证。Ohigashi等[12]利用定量-逆转录PCR检测到结直肠癌术后肠道微生物群会发生迅速的表型转变且微生物密度和代谢物产生巨大变化，对维持胃肠道稳态有非常重要作用的专性厌氧菌如球形梭菌、柔嫩梭菌、脆弱拟杆菌、双歧杆菌、阿托波菌和普雷沃特菌数量会减少。van Praagh等[39]从进行了结直肠吻合术患者的吻合口切缘中分离出细菌DNA并进行分析发现，后续发展为吻合口漏患者的吻合口切缘中微生物多样性较低且与黏蛋白降解有关的拟杆菌科和毛螺菌科增多。此外，在肠切除时肠腔暴露在氧气中，在血管结扎时会造成局部血液供应暂时中断。在一项对小肠移植患者的研究[40]中发现，在改道的结肠中，专性厌氧菌包括类杆菌和索状芽孢杆菌被耗尽，而乳杆菌和肠杆菌科兼性厌氧菌的数量增加。这些研究为肠道手术导致的菌群失调与吻合口漏之间的因果关系分析提供了一些合理的原因。
4.2.2 围术期干预改善肠道菌群失调对吻合口漏的影响
前面已描述吻合口漏可能是由产生胶原酶的肠道病原菌引起的，而且肠道黏液对吻合口愈合非常重要，但常规的术前肠道准备并不能减少条件致病菌定植，而且改变了肠道黏液形成，因此需要考虑新的策略来控制这些病原菌的毒力。群体感应是细菌毒力激活的细胞间通讯系统，某些条件致病菌可以通过群体感应来触发其编码胶原酶的gelE基因表达[41]；并且细菌拥有极其敏感的感觉系统来检测细胞外磷酸盐浓度。因此，Hyoju等[24]提出了基于磷酸盐治疗的方法，其利用细胞外磷酸盐来抑制群体感应，作为一种在不影响细菌生长的情况下减弱细菌毒力的方法，在小鼠模型中证明了口服多磷酸盐显著减弱了吻合口组织中黏质沙门菌和铜绿假单胞菌的定植和胶原酶活性，从而防止了吻合口漏发生。在Wiegerinck等[42]的小鼠实验数据亦表明，口服多磷酸化聚合物ABA-PEG20K-Pi20显著抑制了粪肠球菌中胶原酶的产生并预防吻合口漏。另外，Nichols等[43]研究发现，不同形式的磷酸盐的持续释放抑制了细菌胶原酶的形成，可以在不根除肠道愈合过程中的保护性菌群的情况下减弱组织破坏性细菌表型的表达。因此，为准备肠道吻合手术的患者提供多磷酸盐可能代表了一种预防吻合口漏的新方法。此外，丁酸盐作为一种有益的短链脂肪酸，由肠道细菌通过膳食纤维发酵形成，是结肠上皮细胞的主要能量来源，有利于结肠上皮细胞增殖、维持黏膜层厚度和保持肠道屏障功能及完整性[44]。在一项针对丁酸盐的不同给药途径提高大鼠结肠吻合强度的对比研究[45]中发现，丁酸盐灌肠与更好的吻合口愈合有关。另外鉴于菊粉、半乳糖等低聚糖类益生元能够增加短链脂肪酸的产生和促进上皮修复，Hajjar等[46]通过围手术期给予小鼠模型菊粉和低聚半乳糖，结果发现，菊粉和低聚半乳糖饮食的小鼠吻合口周围组织中的胶原蛋白浓度较高，加速了吻合口愈合并增强了肠道屏障。以上这些研究结果提示，丁酸盐对结肠上皮的增殖作用表明与组织修复和黏膜连续性有关，有可能可以防止吻合口部位的渗漏。
综上所述，肠道菌群的个体组成及其围术期成分的变化，可由各种原因解释，如机械肠道准备、口服抗生素、结直肠手术本身等，可能对患者的病程有重要影响。因此，围术期调整肠道菌群组成的措施对于降低吻合口漏的发生率可能具有临床意义。
5 小结与展望
微生物组是一个新的且非常有前景的研究领域，尤其是在研究结直肠癌手术中吻合口漏的病因时。现有的研究证据表明，肠道微生物群与宿主之间存在着强烈的双向作用，并且这种微生物群-宿主关系在结直肠癌术后引起和（或）加剧吻合口漏中发挥重要作用。但是现有的证据仍然有限，需要进一步的研究来确切地阐明肠道微生物群变化是如何导致吻合口漏的，从而以此为依据，识别出具有不良微生物组的高危患者如具有高胶原酶活性的病原体，并根据需要对其采取适当的经口、静脉或灌肠的抗生素方案和（或）菌种移植，可能有助于降低吻合口漏发生率。
目前，已有一些针对肠道菌群在吻合口漏有关治疗中潜在作用的研究，然而这些研究有诸多不足：① 这些研究多是探索性的，而且多数研究样本量小且多在动物模型中完成，而关于结直肠癌患者肠道菌群与吻合口漏之间关系的临床研究非常有限；② 在对于动物的研究中看到，将人类粪便移植到动物身体内时，细菌定植的发展与人类不同，宿主免疫反应可能不同；③ 在制作动物模型时，需要考虑到基因组学、肿瘤固有特征、动物微生物组与种植的人类细菌之间的竞争等因素，唯有如此才能更准确地优化动物模型，使其更接近于人类肠道中的情况；④ 由于宿主遗传、环境和生活方式因素的差异如种族、地理位置、饮食等，不同个体之间微生物群的成分存在一定差异，可能导致针对人体的研究结果存在极端差异。针对以上不足，有必要进行更大规模及多中心的分析，以确定可能达成共识的结直肠癌术后与吻合口漏相关的微生物组；此外，从本综述结果看，围术期各项干预措施对肠道菌群会产生重要影响，并且结直肠癌术后肠道菌群也会发生显著变化。因此，外科医生在围术期对患者的管理中应努力减少对肠道菌群平衡的过度干扰，减少一些非必要药物的使用，可在有适应证的情况下适当应用口服抗生素或进行肠道准备。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王朝樣查阅文献、设计选题及撰写文章；林浩、张海宝、巨家华参与查阅文献；俞永江校对文章及指导选题设计。