引用本文： 卢战辉, 白阳秋, 孙趁意, 张晓菲. 海参多糖调控JAK2/STAT3/survivin通路对肝癌细胞增殖和凋亡的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(7): 875-880. doi: 10.7507/1007-9424.202109046 复制
肝癌是常见高发性恶性肿瘤之一[1]。目前手术治疗仍是最有效的根治肝癌的方法[2-3]，但并不是所有肝癌患者都有机会接受手术治疗。对于由于各种原因无法手术治疗的肝癌患者可选择化学药物治疗，可在一定程度上控制疾病的发展，但其严重副作用不可忽视[4]。随着中医的快速发展，越来越多的中医药在防治肿瘤发生及发展中具有良好的作用，可以减少或减轻副作用，还可在一定程度上增强患者的体质[5]。海参是一种食用性海洋动物，富含丰富的营养物质如胶原蛋白、维生素、皂苷、多糖等[6]。已有研究[7]表明，海参中的活性物质在人体抗癌过程中具有非常重要的作用，如从海参中分离的三萜糖苷，可有效抑制肝癌细胞HepG2的黏附、迁移、侵袭等过程，同时对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用。但关于海参多糖在抗癌作用机制中的研究还较少，尤其在肝癌中更少。已有研究[8]证明，通过体外沉默STAT3可阻断JAK2/STAT3信号通路，进而降低其下游靶标基因survivin的表达，同时也可抑制肝癌细胞的增殖。因此，本研究旨在探讨海参多糖对肝癌细胞增殖、凋亡的影响并探讨其对JAK2/STAT3/survivin通路的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料
人肝癌HepG2细胞购自上海北诺生物科技有限公司（货号：ATCC0361，美国ATCC），郑州市金水区总医院冻存；海参多糖购自四川维克奇生物有限公司（货号：wkq-08920，高效液相色谱法检测其纯度≥90%）；MTT、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）均购自美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；总RNA提取试剂盒、蛋白提取试剂盒均购自武汉纯度生物科技有限公司（货号分别为CD-13433-ML、CD-13559-ML）；一抗兔抗人磷酸化（phosphorylated，p）-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-survivin、survivin抗体均购自美国eBioscience公司。20只4~6周龄BALB/c裸鼠（18~25 g）购于中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号为SCXK（京）2019-0014；抗原修复溶液（货号：p0081）购自上海Beyotime公司；过氧化物酶阻滞剂（货号：BF06060）购自北京Biodragon公司；CO2培养箱购自上海Heal Force（型号：HF151）；流式细胞仪购自美国NovoCyte（型号：NovoCyt）；全自动酶标仪购自美国Thermofisher（型号：5119000）；荧光定量PCR仪、全自动凝胶成像分析系统均购自美国BIO-RAD公司（型号分别为1855200、1708271）；电子天平购自中国SOPTOP（型号：AE1202）；光学显微镜、切片机购自德国Leica公司（型号分别为DM4M、RM2235）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及干预
人肝癌HepG2细胞维持培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养直到细胞贴壁生长超过80%，先使用胰蛋白酶洗涤消化，再使用DMEM培养基洗涤3次（800 r/min离心3 min，r=10 cm），弃上清，收集细胞，进行传代培养，培养至第3代细胞才可继续实验。细胞生长至对数生长期时分装于24孔培养板中，每孔中含有106个细胞。持续观察细胞的生长情况直至贴壁生长后，各孔中分别加入0、50、100、200 μg/mL[6]的海参多糖溶液（0 μg/mL海参多糖溶液时细胞使用含100 μL的PBS培养），每个浓度设4个复孔。持续培养36 h。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖情况
不同浓度海参多糖处理细胞后培养12 h、24 h、36 h时依次加入20 μL MTT溶液在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养4 h后小心地去除上清，然后每孔依次加入200 μL 二甲基亚砜溶液在37 ℃的培养箱孵育20 min，随后于570 nm波长处测定细胞吸光度（absorbance，A）值，将0 μg/mL海参多糖处理细胞的A值作为对照组，计算另外3个浓度处理后的细胞（简称“处理组”）在各个时间点的增殖抑制率，其计算公式为“增殖抑制率=（1–A处理组/A对照组）×100%”。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况
调整细胞浓度为106个/mL后接种于80 mm培养皿中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养36 h后终止培养收集细胞，加入PBS洗涤后获得细胞悬浮液。随后依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶溶液，充分混匀后避光反应，30 min 后在流式细胞仪中检测不同浓度海参多糖处理36 h时的细胞凋亡情况。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率（右下象限）+晚期细胞凋亡率（右上象限）。
1.2.4 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）检测细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表达水平
收集经不同浓度海参多糖处理36 h后的细胞，使用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录成cDNA。各基因的引物序列见表1。采用qRT-PCR法检测每个PCR反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，即Ct值，以2–ΔΔCt计算基因的相对表达量，以β-actin为内参基因，其中ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因、ΔΔCt=ΔCt处理组–ΔCt对照组。
表1
引物序列
1.2.5 Western blot法检测细胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化的蛋白表达
收集经不同浓度海参多糖处理36 h后的细胞，按照试剂盒方法进行细胞总蛋白提取，使用BCA法进行总蛋白定量，取20 μL蛋白上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。将蛋白胶小心转移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脱脂牛奶室温下封闭2 h，依次在牛奶中添加对应的一抗，4 ℃孵育10 h，TBST冲洗。依次加入二抗（辣根过氧化物酶标记），室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次。最后在膜上加入增强化学发光液，将聚偏二氟乙烯膜充分覆盖后，拍照观测蛋白条带，使用Image J软件进行灰度值分析。
1.2.6 裸鼠异种种植
将经不同浓度（0、50、100、200 μg/mL）海参多糖处理后状态良好的肝癌HepG2细胞使用PBS重悬（5×106个/mL）后与基质胶1∶1混合，吸取50 μL混悬液于裸鼠皮下注射，每个浓度5只裸鼠。每5 d监测1次裸鼠实体瘤的生长情况，20 d后每3 d监测1次肿瘤生长情况，于第35天时通过CO2窒息对小鼠实施安乐死，同时采用天平称取肿瘤组织的质量、游标卡尺测量肿瘤组织的体积，随后将肿瘤组织在10%甲醛中固定24 h后通过石蜡包埋。肿瘤体积（mm3）=肿瘤组织的长径×短径2/2。
1.2.7 免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织中磷酸化JAK2、STAT3、survivin的蛋白表达情况
将1.2.6中的石蜡包埋的裸鼠肿瘤组织通过切片机切成4 μm厚的切片，依次与抗原修复液、内源性过氧化物阻滞剂孵育，随后在室温下与5%的胎牛血清孵育1 h后，将组织切片与一抗低温过夜孵育，隔天使用二抗孵育30 min后，加入3,3′ -二氨基联苯胺处理后使用苏木精染色，最后在显微镜下观察结果。以PBS代替一抗为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照。含棕色颗粒的细胞为阳性细胞，以阳性细胞占总细胞的比例来量化和评估不同组中的蛋白表达情况。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计学分析。数据经过检验符合正态分布者以均数±标准差（
±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，采用SNK-q检验两两比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞增殖情况
不同浓度海参多糖处理后12 h、24 h、36 h时细胞增殖抑制率结果见图1。在相同时间点，不同浓度间总体比较差异均有统计学意义（12 h：F=13.409、P=0.002；24 h：F=13.954、P=0.002；36 h：F=16.192、P=0.001），在观察浓度范围内，随着海参多糖浓度增加而增殖抑制率增高（P<0.05）。在相同浓度，3个时间点的细胞增殖抑制率总体比较差异也均有统计学意义（50 μg/mL：F=13.538、P=0.002；100 μg/mL：F=14.106、P=0.002；200 μg/mL：F=19.481、P=0.001），在观察时间范围内，随着时间的延长而增殖抑制率增高（P<0.05）。
图1
示经不同浓度海参多糖处理后细胞的增殖情况
与相同时间点内50 μg/mL浓度比较，*
2.2 细胞凋亡率结果
流式细胞技术分析结果见图2a~2d，可见在0 μg/mL海参多糖浓度时并未出现大量的细胞凋亡，其他浓度海参多糖处理后出现不同程度的细胞凋亡。定量分析结果（图2e）显示，不同浓度海参多糖处理后的细胞凋亡率总体比较差异有统计学意义（F=117.110，P<0.001），在观察浓度范围内，随着海参多糖浓度的增加而细胞凋亡率增高（P<0.05）。
图2
示经不同浓度海参多糖处理后细胞的凋亡情况及细胞中JAK2、STAT3、survivin表达情况
a~d：分别为流式细胞技术检测0、50、100、200 μg/mL浓度处理后的细胞凋亡结果；e：细胞凋亡率；f：mRNA半定量表达结果；g：蛋白表达定性结果（1~4分别表示0、50、100、200 μg/mL浓度）；h：蛋白表达半定量结果。与0 μg/mL浓度比较，*
2.3 细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA和蛋白水平情况
① qRT-PCR法检测不同浓度海参多糖处理后细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表达半定量结果见图2f，均未发现3个指标在不同浓度间总体比较差异有统计学意义（P>0.05）。② Western blot法检测不同浓度海参多糖处理后细胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化蛋白表达的定性结果见图2g，半定量结果见图2h，不同浓度海参多糖处理后细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和p-survivin/survivin蛋白水平比值总体比较差异有统计学意义（P<0.05），在观察浓度范围内均随着海参多糖浓度的增加而各蛋白表达降低（P<0.05）。
2.4 海参多糖处理后对裸鼠体内肿瘤的影响
不同浓度（0、50、100及200 μg/mL）海参多糖处理后的肝癌HepG2细胞种植于裸鼠后肿瘤的生长情况见图3a，随着海参多糖浓度的增高而裸鼠肿瘤组织的质量（图3b）和体积（图3c）均减轻或减小（P<0.05）。同时免疫组织化学染色结果显示，处理组（50、100、200 μg/mL）中p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表达阳性率均低于对照组（P<0.05）且随着海参多糖浓度的增高而降低，见图3d、3e。
图3
示不同浓度海参多糖处理后对裸鼠体内肿瘤的影响
a：肿瘤大体观；b：肿瘤组织质量；c：肿瘤组织体积；d：蛋白表达阳性率；e：蛋白表达的定性结果（免疫组织化学方法 × 200）。与0 μg/mL浓度比较，*
3 讨论
肝癌的发生及发展是由机体多方面因素共同导致的结果，如癌基因激活或抑癌基因失活、肝细胞结构发生异常、肝癌信号因子被激活同时凋亡途径被抑制、肝细胞异常增殖、血管内皮生长因子被激发[9]等，但其确切机制仍未明确。由于肝癌发生的隐匿性，多数患者确诊时即为中晚期，大部分肝癌患者失去了手术治疗的机会[10]，又因其具有高复发率和高转移率[11]，因此，化学药物治疗是其常采用的方法之一，但其具有较强的副作用，在杀死肿瘤细胞的同时损伤正常细胞，进而使机体产生耐药性[12]。有临床实践[13]表明，在西医治疗方案的同时配合中医治疗能明显地提高化学药物治疗的效用。
海参具有提高人体免疫力、抗癌等作用[14]，尤其是海参提取物在抗癌过程中具有重要作用，可参与调控癌细胞生长、增殖等多个生物学过程[15]，如在海参中提取的三萜糖苷类物质不仅可以显著降低HepG2细胞活力，还可诱导细胞凋亡[16]。有研究[6]报道，海参多糖可能通过抑制核因子-κB信号通路中基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子的表达进而抑制人肾癌细胞的生长、迁移和侵袭过程。目前关于海参多糖在肝癌细胞中作用的研究较少。本研究在前人研究[6-7]的基础上选择海参多糖的处理浓度和观测时间，经分析发现，海参多糖可以有效抑制肝癌HepG2细胞的增殖且在观察浓度和时间范围内随着时间延长和浓度的增加其增殖抑制率也随之升高（P<0.05）；且在动物模型体内，海参多糖可有效抑制肿瘤组织生长且随着浓度增加其抑制效果也随之更明显；对培养36 h后的细胞经不同浓度海参多糖处理后可见其凋亡率随着浓度增加而升高（P<0.05）。以上研究结果提示，海参多糖对肝癌细胞增殖有抑制作用，能促进细胞凋亡且呈现浓度剂量依赖性趋势。
已有研究[17]证明，JAK2/STAT3通路是机体恶性肿瘤细胞增殖、凋亡的经典调控传导通路；魏薇等[18]报道，钩吻总碱可通过抑制人舌癌细胞株JAK2、STAT3和survivin蛋白的磷酸化，进而影响JAK2/STAT3/survivin信号通路发挥作用，达到抑制细胞增殖及促进细胞凋亡的目的。本研究中发现，不同浓度海参多糖处理HepG2细胞36 h时，HepG2细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表达量无明显变化，但p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-survivin/survivin比值在不同浓度间总体比较差异有统计学意义且随海参多糖浓度增加而降低，在动物体内，海参多糖可显著下调p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表达阳性率且随着海参多糖浓度增加随之降低。以上结果说明，海参多糖可能是通过诱导JAK2/STAT3/survivin途径相关蛋白磷酸化参与HepG2细胞增殖、凋亡过程，且海参多糖可在一定程度上抑制JAK2、STAT3和survivin的磷酸化表达，进而达到抑制HepG2细胞增殖、促进凋亡的目的。
综上，海参多糖可抑制人HepG2细胞增殖，促进HepG2细胞凋亡，且随着浓度增加其效用也随之增加，并推断此过程可能是通过调控JAK2/STAT3/survivin通路、抑制JAK2、STAT3和survivin蛋白磷酸化而发挥作用。此研究还需要进一步研究，因本研究尚存在一定不足，首先，本研究并未选择其他观测时间点和海参多糖浓度，若再观察几个时间点或浓度，结果是否会出现不同变化趋势还未可知；其次，本研究仅是初步观察了海参多糖在动物模型体内对肿瘤组织生长的影响，未深入探究体内海参多糖的具体作用机制；此外，本研究并未对海参多糖的药效学进行深入探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益，不存在研究者与公开研究成果有关的利益冲突。
作者贡献声明：卢战辉负责提出研究选题、设计研究方案、获取研究经费、技术或材料支持和指导性支持；白阳秋和孙趁意负责实施研究过程、资料采集整理、分析数据、整理文献和设计文章框架；孙趁意和张晓菲负责起草文章、修订文章、终审文章。
伦理声明：本研究动物实验符合动物伦理要求。
肝癌是常见高发性恶性肿瘤之一[1]。目前手术治疗仍是最有效的根治肝癌的方法[2-3]，但并不是所有肝癌患者都有机会接受手术治疗。对于由于各种原因无法手术治疗的肝癌患者可选择化学药物治疗，可在一定程度上控制疾病的发展，但其严重副作用不可忽视[4]。随着中医的快速发展，越来越多的中医药在防治肿瘤发生及发展中具有良好的作用，可以减少或减轻副作用，还可在一定程度上增强患者的体质[5]。海参是一种食用性海洋动物，富含丰富的营养物质如胶原蛋白、维生素、皂苷、多糖等[6]。已有研究[7]表明，海参中的活性物质在人体抗癌过程中具有非常重要的作用，如从海参中分离的三萜糖苷，可有效抑制肝癌细胞HepG2的黏附、迁移、侵袭等过程，同时对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用。但关于海参多糖在抗癌作用机制中的研究还较少，尤其在肝癌中更少。已有研究[8]证明，通过体外沉默STAT3可阻断JAK2/STAT3信号通路，进而降低其下游靶标基因survivin的表达，同时也可抑制肝癌细胞的增殖。因此，本研究旨在探讨海参多糖对肝癌细胞增殖、凋亡的影响并探讨其对JAK2/STAT3/survivin通路的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料
人肝癌HepG2细胞购自上海北诺生物科技有限公司（货号：ATCC0361，美国ATCC），郑州市金水区总医院冻存；海参多糖购自四川维克奇生物有限公司（货号：wkq-08920，高效液相色谱法检测其纯度≥90%）；MTT、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）均购自美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；总RNA提取试剂盒、蛋白提取试剂盒均购自武汉纯度生物科技有限公司（货号分别为CD-13433-ML、CD-13559-ML）；一抗兔抗人磷酸化（phosphorylated，p）-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-survivin、survivin抗体均购自美国eBioscience公司。20只4~6周龄BALB/c裸鼠（18~25 g）购于中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号为SCXK（京）2019-0014；抗原修复溶液（货号：p0081）购自上海Beyotime公司；过氧化物酶阻滞剂（货号：BF06060）购自北京Biodragon公司；CO2培养箱购自上海Heal Force（型号：HF151）；流式细胞仪购自美国NovoCyte（型号：NovoCyt）；全自动酶标仪购自美国Thermofisher（型号：5119000）；荧光定量PCR仪、全自动凝胶成像分析系统均购自美国BIO-RAD公司（型号分别为1855200、1708271）；电子天平购自中国SOPTOP（型号：AE1202）；光学显微镜、切片机购自德国Leica公司（型号分别为DM4M、RM2235）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及干预
人肝癌HepG2细胞维持培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养直到细胞贴壁生长超过80%，先使用胰蛋白酶洗涤消化，再使用DMEM培养基洗涤3次（800 r/min离心3 min，r=10 cm），弃上清，收集细胞，进行传代培养，培养至第3代细胞才可继续实验。细胞生长至对数生长期时分装于24孔培养板中，每孔中含有106个细胞。持续观察细胞的生长情况直至贴壁生长后，各孔中分别加入0、50、100、200 μg/mL[6]的海参多糖溶液（0 μg/mL海参多糖溶液时细胞使用含100 μL的PBS培养），每个浓度设4个复孔。持续培养36 h。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖情况
不同浓度海参多糖处理细胞后培养12 h、24 h、36 h时依次加入20 μL MTT溶液在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养4 h后小心地去除上清，然后每孔依次加入200 μL 二甲基亚砜溶液在37 ℃的培养箱孵育20 min，随后于570 nm波长处测定细胞吸光度（absorbance，A）值，将0 μg/mL海参多糖处理细胞的A值作为对照组，计算另外3个浓度处理后的细胞（简称“处理组”）在各个时间点的增殖抑制率，其计算公式为“增殖抑制率=（1–A处理组/A对照组）×100%”。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况
调整细胞浓度为106个/mL后接种于80 mm培养皿中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养36 h后终止培养收集细胞，加入PBS洗涤后获得细胞悬浮液。随后依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶溶液，充分混匀后避光反应，30 min 后在流式细胞仪中检测不同浓度海参多糖处理36 h时的细胞凋亡情况。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率（右下象限）+晚期细胞凋亡率（右上象限）。
1.2.4 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）检测细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表达水平
收集经不同浓度海参多糖处理36 h后的细胞，使用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录成cDNA。各基因的引物序列见表1。采用qRT-PCR法检测每个PCR反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，即Ct值，以2–ΔΔCt计算基因的相对表达量，以β-actin为内参基因，其中ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因、ΔΔCt=ΔCt处理组–ΔCt对照组。
表1
引物序列
1.2.5 Western blot法检测细胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化的蛋白表达
收集经不同浓度海参多糖处理36 h后的细胞，按照试剂盒方法进行细胞总蛋白提取，使用BCA法进行总蛋白定量，取20 μL蛋白上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。将蛋白胶小心转移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脱脂牛奶室温下封闭2 h，依次在牛奶中添加对应的一抗，4 ℃孵育10 h，TBST冲洗。依次加入二抗（辣根过氧化物酶标记），室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次。最后在膜上加入增强化学发光液，将聚偏二氟乙烯膜充分覆盖后，拍照观测蛋白条带，使用Image J软件进行灰度值分析。
1.2.6 裸鼠异种种植
将经不同浓度（0、50、100、200 μg/mL）海参多糖处理后状态良好的肝癌HepG2细胞使用PBS重悬（5×106个/mL）后与基质胶1∶1混合，吸取50 μL混悬液于裸鼠皮下注射，每个浓度5只裸鼠。每5 d监测1次裸鼠实体瘤的生长情况，20 d后每3 d监测1次肿瘤生长情况，于第35天时通过CO2窒息对小鼠实施安乐死，同时采用天平称取肿瘤组织的质量、游标卡尺测量肿瘤组织的体积，随后将肿瘤组织在10%甲醛中固定24 h后通过石蜡包埋。肿瘤体积（mm3）=肿瘤组织的长径×短径2/2。
1.2.7 免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织中磷酸化JAK2、STAT3、survivin的蛋白表达情况
将1.2.6中的石蜡包埋的裸鼠肿瘤组织通过切片机切成4 μm厚的切片，依次与抗原修复液、内源性过氧化物阻滞剂孵育，随后在室温下与5%的胎牛血清孵育1 h后，将组织切片与一抗低温过夜孵育，隔天使用二抗孵育30 min后，加入3,3′ -二氨基联苯胺处理后使用苏木精染色，最后在显微镜下观察结果。以PBS代替一抗为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照。含棕色颗粒的细胞为阳性细胞，以阳性细胞占总细胞的比例来量化和评估不同组中的蛋白表达情况。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计学分析。数据经过检验符合正态分布者以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，采用SNK-q检验两两比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞增殖情况
不同浓度海参多糖处理后12 h、24 h、36 h时细胞增殖抑制率结果见图1。在相同时间点，不同浓度间总体比较差异均有统计学意义（12 h：F=13.409、P=0.002；24 h：F=13.954、P=0.002；36 h：F=16.192、P=0.001），在观察浓度范围内，随着海参多糖浓度增加而增殖抑制率增高（P<0.05）。在相同浓度，3个时间点的细胞增殖抑制率总体比较差异也均有统计学意义（50 μg/mL：F=13.538、P=0.002；100 μg/mL：F=14.106、P=0.002；200 μg/mL：F=19.481、P=0.001），在观察时间范围内，随着时间的延长而增殖抑制率增高（P<0.05）。
图1
示经不同浓度海参多糖处理后细胞的增殖情况
与相同时间点内50 μg/mL浓度比较，*
2.2 细胞凋亡率结果
流式细胞技术分析结果见图2a~2d，可见在0 μg/mL海参多糖浓度时并未出现大量的细胞凋亡，其他浓度海参多糖处理后出现不同程度的细胞凋亡。定量分析结果（图2e）显示，不同浓度海参多糖处理后的细胞凋亡率总体比较差异有统计学意义（F=117.110，P<0.001），在观察浓度范围内，随着海参多糖浓度的增加而细胞凋亡率增高（P<0.05）。
图2
示经不同浓度海参多糖处理后细胞的凋亡情况及细胞中JAK2、STAT3、survivin表达情况
a~d：分别为流式细胞技术检测0、50、100、200 μg/mL浓度处理后的细胞凋亡结果；e：细胞凋亡率；f：mRNA半定量表达结果；g：蛋白表达定性结果（1~4分别表示0、50、100、200 μg/mL浓度）；h：蛋白表达半定量结果。与0 μg/mL浓度比较，*
2.3 细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA和蛋白水平情况
① qRT-PCR法检测不同浓度海参多糖处理后细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表达半定量结果见图2f，均未发现3个指标在不同浓度间总体比较差异有统计学意义（P>0.05）。② Western blot法检测不同浓度海参多糖处理后细胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化蛋白表达的定性结果见图2g，半定量结果见图2h，不同浓度海参多糖处理后细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和p-survivin/survivin蛋白水平比值总体比较差异有统计学意义（P<0.05），在观察浓度范围内均随着海参多糖浓度的增加而各蛋白表达降低（P<0.05）。
2.4 海参多糖处理后对裸鼠体内肿瘤的影响
不同浓度（0、50、100及200 μg/mL）海参多糖处理后的肝癌HepG2细胞种植于裸鼠后肿瘤的生长情况见图3a，随着海参多糖浓度的增高而裸鼠肿瘤组织的质量（图3b）和体积（图3c）均减轻或减小（P<0.05）。同时免疫组织化学染色结果显示，处理组（50、100、200 μg/mL）中p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表达阳性率均低于对照组（P<0.05）且随着海参多糖浓度的增高而降低，见图3d、3e。
图3
示不同浓度海参多糖处理后对裸鼠体内肿瘤的影响
a：肿瘤大体观；b：肿瘤组织质量；c：肿瘤组织体积；d：蛋白表达阳性率；e：蛋白表达的定性结果（免疫组织化学方法 × 200）。与0 μg/mL浓度比较，*
3 讨论
肝癌的发生及发展是由机体多方面因素共同导致的结果，如癌基因激活或抑癌基因失活、肝细胞结构发生异常、肝癌信号因子被激活同时凋亡途径被抑制、肝细胞异常增殖、血管内皮生长因子被激发[9]等，但其确切机制仍未明确。由于肝癌发生的隐匿性，多数患者确诊时即为中晚期，大部分肝癌患者失去了手术治疗的机会[10]，又因其具有高复发率和高转移率[11]，因此，化学药物治疗是其常采用的方法之一，但其具有较强的副作用，在杀死肿瘤细胞的同时损伤正常细胞，进而使机体产生耐药性[12]。有临床实践[13]表明，在西医治疗方案的同时配合中医治疗能明显地提高化学药物治疗的效用。
海参具有提高人体免疫力、抗癌等作用[14]，尤其是海参提取物在抗癌过程中具有重要作用，可参与调控癌细胞生长、增殖等多个生物学过程[15]，如在海参中提取的三萜糖苷类物质不仅可以显著降低HepG2细胞活力，还可诱导细胞凋亡[16]。有研究[6]报道，海参多糖可能通过抑制核因子-κB信号通路中基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子的表达进而抑制人肾癌细胞的生长、迁移和侵袭过程。目前关于海参多糖在肝癌细胞中作用的研究较少。本研究在前人研究[6-7]的基础上选择海参多糖的处理浓度和观测时间，经分析发现，海参多糖可以有效抑制肝癌HepG2细胞的增殖且在观察浓度和时间范围内随着时间延长和浓度的增加其增殖抑制率也随之升高（P<0.05）；且在动物模型体内，海参多糖可有效抑制肿瘤组织生长且随着浓度增加其抑制效果也随之更明显；对培养36 h后的细胞经不同浓度海参多糖处理后可见其凋亡率随着浓度增加而升高（P<0.05）。以上研究结果提示，海参多糖对肝癌细胞增殖有抑制作用，能促进细胞凋亡且呈现浓度剂量依赖性趋势。
已有研究[17]证明，JAK2/STAT3通路是机体恶性肿瘤细胞增殖、凋亡的经典调控传导通路；魏薇等[18]报道，钩吻总碱可通过抑制人舌癌细胞株JAK2、STAT3和survivin蛋白的磷酸化，进而影响JAK2/STAT3/survivin信号通路发挥作用，达到抑制细胞增殖及促进细胞凋亡的目的。本研究中发现，不同浓度海参多糖处理HepG2细胞36 h时，HepG2细胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表达量无明显变化，但p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-survivin/survivin比值在不同浓度间总体比较差异有统计学意义且随海参多糖浓度增加而降低，在动物体内，海参多糖可显著下调p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表达阳性率且随着海参多糖浓度增加随之降低。以上结果说明，海参多糖可能是通过诱导JAK2/STAT3/survivin途径相关蛋白磷酸化参与HepG2细胞增殖、凋亡过程，且海参多糖可在一定程度上抑制JAK2、STAT3和survivin的磷酸化表达，进而达到抑制HepG2细胞增殖、促进凋亡的目的。
综上，海参多糖可抑制人HepG2细胞增殖，促进HepG2细胞凋亡，且随着浓度增加其效用也随之增加，并推断此过程可能是通过调控JAK2/STAT3/survivin通路、抑制JAK2、STAT3和survivin蛋白磷酸化而发挥作用。此研究还需要进一步研究，因本研究尚存在一定不足，首先，本研究并未选择其他观测时间点和海参多糖浓度，若再观察几个时间点或浓度，结果是否会出现不同变化趋势还未可知；其次，本研究仅是初步观察了海参多糖在动物模型体内对肿瘤组织生长的影响，未深入探究体内海参多糖的具体作用机制；此外，本研究并未对海参多糖的药效学进行深入探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益，不存在研究者与公开研究成果有关的利益冲突。
作者贡献声明：卢战辉负责提出研究选题、设计研究方案、获取研究经费、技术或材料支持和指导性支持；白阳秋和孙趁意负责实施研究过程、资料采集整理、分析数据、整理文献和设计文章框架；孙趁意和张晓菲负责起草文章、修订文章、终审文章。
伦理声明：本研究动物实验符合动物伦理要求。
