引用本文： 马文杰, 陈巍巍, 杨琴, 李全生, 李富宇. 以核磁共振方法测定胆囊结石患者的氨基酸谱及糖代谢谱的初步临床研究. 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(4): 401-409. doi: 10.7507/1007-9424.201709077 复制
近年来，我国自然人群胆囊结石的发病率呈逐渐升高趋势，发病率从 5% 上升到 10%[1]。有研究者[2]认为，造成胆囊结石的原因有胆汁化学成分的改变、细菌感染和胆汁淤积；也有研究[3]提示脂质代谢异常与胆囊结石发生的关系密切。但是，既往的研究是以较单一的脂代谢产物为研究对象，不能了解脂质代谢整体与胆囊结石发生的关系，更不能把握机体整个代谢物质的变化与胆囊结石的关系，而代谢组学可以从整体上让我们了解体内代谢物质的变化与胆囊结石形成的关系[4]。核磁共振（NMR）技术作为代谢组学研究的主要技术之一，主要应用于疾病诊断及发病机制的研究[5-9]，其中以1H-NMR 的应用最为广泛。本研究运用基于1H-NMR 的代谢组学研究方法，针对无胆囊结石的健康人/肝移植供体和胆囊结石患者，分析他们之间血和胆汁中代谢物质的差别，从而探索与胆囊结石发病相关的代谢变化。
1 资料与方法
1.1 纳入和排除标准
1.1.1 胆囊结石组
胆囊结石患者的纳入标准：① 年龄在 18 岁以上；② 术前彩超明确诊断为胆囊结石，术中证实为胆囊成型结石；③ 手术方式为腹腔镜胆囊切除术。排除标准：① 合并其他急慢性疾病；② 术中胆汁污染；③ 合并胆管梗阻，术前总胆红素（TBIL）水平大于 28 μmol/L。
1.1.2 肝移植供体组
活体肝移植供体组纳入标准：① 年龄在 18 岁以上；② 影像学检查明确诊断无胆囊结石，且术中证实无胆囊成型结石；③ 术中证实胆囊外观正常，无炎症及水肿；④ 肝移植供体的手术方式为开腹肝脏切除附加胆囊切除术。排除标准：① 术中存在胆汁污染；② 术前总胆红素水平大于 28μmol/L。
1.1.3 健康人组
健康人员的纳入标准：① 年龄在 18 岁以上；② 体检彩超检查明确诊断无胆囊结石。排除标准：合并急、慢性疾病。
1.2 临床资料
前瞻性收集 2016 年 3 月至 2016 年 12 月期间于四川大学华西医院接受腹腔镜胆囊切除术的 19 例胆囊结石患者的血清标本和胆汁标本，因 2 例患者的血清标本收集后自凝，故胆囊结石组最终剩余血清标本 17 例。收集同期于四川大学华西医院体检的 10 例健康体检者的血清标本（健康人组），以及 15 例肝移植供体（肝移植供体组）的胆汁标本。3 组对象的基本特征见表 1，由表 1 可见，3 组对象的性别、年龄、TBIL、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及门冬氨酸氨基转移酶（AST）比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究胆囊结石患者的血清及胆汁采集、肝移植供体的胆汁采集及健康人的血清采集均通过四川大学伦理委员会审批，所有研究对象包括胆囊结石患者、肝移植供体及健康人均已签署知情同意书。
表1
胆囊结石组、肝移植供体组与健康人组的临床特征比较
1.3 标本采集
胆囊结石组、肝移植供体组及健康人组对象均于入院第 1 天（健康组为体检当天）清晨空腹、静脉抽取血液 3～4 mL，置于真空采血管中，3 000 r/min离心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低温冰箱中冷冻备用。肝移植供体组及胆囊结石组研究对象在胆囊切除后需保持胆囊的完整性、不泄露胆汁，空针穿刺抽吸 3～4 mL 胆汁，置于玻璃管中，然后 3 000 r/min 离心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低温冰箱中冷冻备用。
1.4 代谢组学检测和分析
本研究的代谢组学分析是委托四川来福瑞科技有限公司完成的。取出冻存血清和胆汁，室温下解冻，以 13 000 r/min 离心（4 ℃，r=10 cm）10 min 后取 4 00 μL 上清液加入 5 mm 核磁管中，再于核磁管中加入 100 μL 重水（D2O），充分振荡约 1 min。在 Varian NMR System 600 MHz 谱仪（Varian 公司，美国）上采集1H-NMR 自由感应衰减（free induction decay，FID）信号。采用 MestReNova 9.0 软件（Mestrelab MestReNova 公司，西班牙）对信号进行手动调相、基线校正和谱峰对齐，并进行分段积分及归一化处理，同时扣除水峰残留信号以得到相应图谱。采用 SIMCA-P+ 11.0 软件（Umetrics AB 公司，瑞典）将积分数据归一化并构成数据矩阵，并利用主成分分析法（PCA）对数据矩阵进行统计分析，得到 PCA 得分图（scores plot）。采用 SIMCA-P+ 11.0 软件对归一化后的数据进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），通过 PLS-DA 的变量权重值（variable importance in the projection，VIP）找出相对应的差异化学位移（ppm）。再通过 PLS-DA 以发现 NMR 数据和其他变量之间的相关关系，并采用交叉验证后得到的反映变量 Y 的变异百分比（R2Y）和模型预测值（Q2），对模型的有效性进行评判。然后，对 PLS-DA 模型进行正交矫正处理（OPLS-DA），以最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异，并通过载荷图进行差异代谢物的筛选和鉴定。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。3 组研究对象的年龄、TBIL、DBIL、IBIL、ALT 及 AST 以均数±标准差（
±s）表示，统计方法采用单因素方差分析（ANOVA）；3 组研究对象的性别构成比较采用成组χ2检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 健康人及胆囊结石患者血清标本的代谢组学分析结果
2.1.1 健康人及胆囊结石患者的血清标本中1H-NMR 测定结果
通过将 FID 信号导入软件后得到健康人及胆囊结石患者血清样本的代表性1H-NMR 图谱，见图 1。由图 1 可见，与健康人比较，胆囊结石患者血清中的缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、组氨酸、次黄嘌呤等成分的1H-NMR 信号峰有所降低，而乙酰乙酸和1, 2-丙二醇的1H-NMR 信号峰有所升高，提示健康人和胆囊结石患者血清中的代谢成分浓度有一定的差异。
图1
示健康人（a）及胆囊结石患者（b）血清样本的代表性1H-NMR 图谱
hypoxanthine：次黄嘌呤；histidine：组氨酸；tyrosine：酪氨酸；α-glucose：α-葡萄糖；β-glucose：β-葡萄糖；lactate：乳酸盐；lysine：赖氨酸；glutamine：谷氨酰胺；N-acetyl glycoprotein：N-乙酰基糖蛋白；alanine：丙氨酸；valine：缬氨酸；VLDL：极低密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；phenylalanine：苯丙氨酸；acetoacetate：乙酰乙酸；1, 2-propanediol：1, 2-丙二醇
2.1.2 健康人及胆囊结石患者的血清标本中1H-NMR 数据分析
① PCA：PCA 结果见图 2a，由图 2a 可见，第1主成分（PC1）与第2主成分（PC2）的 PCA 得分图，提示健康人和胆囊结石患者的血清标本的主成分积分值在椭圆形散点图（95% 置信区间）中无明显交叉，说明健康人和胆囊结石患者的血清样本代谢物能在 PCA 得分图上得到一定的区分。② 1H-NMR 图谱模式识别分析：进一步进行 PLS-DA 分析（图 2b 和图 2c）和正交矫正处理（图 2d–2f）。PLS-DA 分析（图 2b 和图 2c）结果显示：健康组和胆囊结石组的血清标本存在显著的差异；置换检验图（图 2d）表明 PLS-DA 模型能较好地解释 2 组血清成分之间的差异。相比 PLS-DA 分析，健康人组和胆囊结石组的血清样本能在 OPLS-DA 得分图（图 2e–2f）上得到更好的分离，从而表明 2 组血清样本的内源性代谢物有明显的区别。本研究进一步观察 OPLS-DA 分析的载荷图（图 2g）可知，第 168、170、171、157、156、167、155、154、153、158、159、160、161、162、73、74、75、663、675、658、676、666、655、679、656、680、662、657、660 等变量是造成健康人组和胆囊结石组差异的主要变量。③ 血清差异代谢物的筛选和鉴定：健康人组和胆囊结石组的血清差异代谢物的筛选和鉴定结果见表 2。由表 2 可见，与健康人比较，胆囊结石患者的血清中共有 16 种差异代谢物，其中胆囊结石组患者的缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸、肌酸酐、胆碱、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、组氨酸以及次黄嘌呤的浓度较健康人组明显降低（P<0.05），而胆囊结石组患者的乳酸盐、乙酰乙酸以及 1, 2-丙二醇的浓度较健康人组明显升高（P<0.05）。
图2
示健康人和胆囊结石患者血清标本的代谢组学分析图
a：PCA 得分图；b：PLS-DA 二维得分图；c：PLS-DA 三维得分图；d：PLS-DA 分析的置换检验图，
表2
健康人组和胆囊结石组血清比较的主要差异代谢物及相关系数值
2.2 肝移植供体及胆囊结石患者胆汁标本的代谢组学分析结果
2.2.1 肝移植供体及胆囊结石患者的胆汁标本的 1H-NMR 测定结果
肝移植供体及胆囊结石患者的胆汁样本的代表性1H-NMR 图谱见图 3。通过将 FID 信号导入软件后得到1H-NMR 图谱后（图 3）发现，与肝移植供体比较，胆囊结石患者胆汁中的甘氨酸结合的胆汁酸（glycine conjugated bile acids）、甘氨酸结合的去氧胆汁酸、甘氨酸结合的鹅去氧胆汁酸、牛磺酸结合的胆汁酸（taurine conjugated bile acids）、牛磺酸结合的去氧胆汁酸以及牛磺酸结合的鹅去氧胆汁酸的1H-NMR 信号峰均明显降低。此外，胆囊结石患者的磷脂酰胆碱（phosphatidyl- choline，PC）和胆碱成分的信号强度也较肝移植供体有所降低。
图3
示肝移植供体（a）及胆囊结石患者（b）胆汁的代表性1H-NMR 图谱
taurine conjugated bile acids：牛磺酸结合的胆汁酸；glycine conjugated bile acids：甘氨酸结合的胆汁酸；cholesterol：胆固醇；PC：磷脂酰胆碱；glycerol：甘油；lipids：脂类；choline：胆碱；bile acids：胆汁酸；total bile acids；总胆汁酸；CA：甘氨酸/牛磺酸结合的胆酸；CDCA：甘氨酸/牛磺酸结合的鹅去氧胆酸；DCA：甘氨酸/牛磺酸结合的去氧胆酸
2.2.2 肝移植供体及胆囊结石患者胆汁标本的1H-NMR 数据分析
① PCA：PCA 结果见图 4a，由图 4a 可见第1主成分（PC1）与第2主成分（PC2）的 PCA 得分图，提示肝移植供体组和胆囊结石组的胆汁标本的主成分积分值在椭圆形散点图（95% 置信区间）中得到较好地分离，仅有个别样品重叠，说明肝移植供体和胆囊结石患者的胆汁成分能在 PCA 得分图上得到一定程度的区分。② 1H-NMR 图谱模式识别分析：进一步进行 PLS-DA 分析（图 4b 和图 4c）和正交矫正处理（图 4d–4f）。结果显示：肝移植供体和胆囊结石患者的胆汁标本间存在着显著的差异（图 4b–4c），交叉验证实验（图 4d）说明 PLS-DA 模型能较好地解释 2 组胆汁成分之间的差异。与 PLS-DA 分析比较，OPLS-DA 的分离效果得到了明显地改善，这表明肝移植供体组和胆囊结石组的胆汁标本的内源性代谢物有显著的差异（图 4e–4f）。笔者进一步观察了 OPLS-DA 分析的载荷图，具体见图 4g。由图 4g 可知，第 159、156、155、157、160、84、158、82、154、161、665、85、166、167、79、165、74、75、658、153、86、73、109 等变量是造成肝移植供体组和胆囊结石组存在差异的主要变量。③ 胆汁差异代谢物的筛选和鉴定：肝移植供体组和胆囊结石组的胆汁差异代谢物的筛选和鉴定结果见表 3。由表 3 可见，与肝移植供体比较，胆囊结石患者的胆汁中存在 5 种差异代谢物，其中胆囊结石组患者的牛磺酸结合的胆汁酸、甘氨酸结合的胆汁酸、胆碱以及 PC 的浓度均较肝移植供体组明显降低（P<0.05），而胆囊结石组患者胆汁中的胆固醇浓度较肝移植供体组明显升高（P<0.05）。
图4
示肝移植供体和胆囊结石患者胆汁标本的代谢组学分析图
a：PCA 得分图；b：PLS-DA 二维得分图；c：PLS-DA 三维得分图；d：OPLS-DA 分析的置换检验图：
表3
肝移植供体和胆囊结石患者的主要差异代谢物及相关系数值
3 讨论
胆囊结石的成因复杂，许多学者[1, 2-6, 10]也做了大量的相关研究。有学者[2, 4]在致石基因与遗传因素对胆囊结石影响的研究中，通过对近交系的小鼠进行研究，发现了著名的 Lith-1 基因与胆囊结石连锁。在胆囊动力学紊乱与胆囊结石形成关系的研究中，学者[10-11]发现，胆囊运动减弱是胆囊结石发生的重要因素之一，而胆囊收缩素受体的缺乏可能是胆囊运动功能受损的重要原因之一。此外，细菌感染可能也是导致胆囊结石的一个重要因素，细菌感染可导致胆囊运动减弱和胆汁淤积，并改变胆汁的成分和理化性质，最终导致胆囊结石形成[2, 10, 12]。脂代谢紊乱也可以诱发胆囊结石[2-3, 12-13]，但是除了脂代谢以外，其他代谢如糖代谢和氨基酸代谢在胆囊结石的形成中是否也起到了重要的作用，以及体内代谢物质的整体变化与胆囊结石形成的关系尚鲜见报道。
3.1 胆囊结石患者存在血清糖代谢及氨基酸代谢异常
胆囊结石的形成可能与糖代谢紊乱有关。在本研究中，丙酮酸代谢被发现是高度影响胆囊结石形成的代谢途径（| r | =0.482）。丙酮酸是人类新陈代谢的关键代谢物，其通过柠檬酸或草酰乙酸进入柠檬酸循环，参与不同的生物合成途径[14]。丙酮酸可通过脱羧生成乙酰辅酶 A，从而进入胆固醇合成途径。本研究结果表明，胆囊结石患者血清中的丙酮酸较健康人明显降低，即丙酮酸大量脱羧生成乙酰辅酶 A 从而合成胆固醇，而血清高胆固醇浓度导致胆汁过饱和，从而使胆汁中的胆固醇沉淀为晶体并导致起始胆囊结石形成。此外，乳酸盐也是糖代谢的重要参与者。在慢性胆囊炎患者中，胆囊上皮细胞中乳酸盐水平的升高可能与 Warburg 效应有关，即在氧含量充足的情况下，糖酵解仍然增加[15]，而这种效应常于肿瘤细胞中观察到，这提示其可能是胆囊慢性炎症向癌症进展的标志物之一。本研究结果表明，胆囊结石患者的血清乳酸盐浓度较健康人升高，这与一项关于兔胆囊结石代谢组学特征的研究[16]相一致。该研究发现，与正常对照组比较，兔胆囊结石组的血浆乳酸水平明显升高。
氨基酸代谢异常可能也在胆囊结石形成中发挥作用。本研究结果表明，与健康组人相比较，胆囊结石组的血清谷氨酸、谷氨酰胺及组氨酸含量明显降低。谷氨酰胺参与体内能量代谢和物质合成。在炎性病症中，谷氨酰胺通过为生物合成提供碳源和氮源来维持细胞的存活和生长。谷氨酰胺的抗氧化能力也有助于减轻炎症，同时也可维持细胞的稳态。而在胆囊结石患者中，血清谷氨酰胺水平明显降低，表明机体抗胆囊结石所致的慢性炎症的能力减弱，从而导致胆囊炎症的进行性进展，而胆道炎症业已被证实与胆系结石的形成有关[17]。同时谷氨酰胺具有调节肠道免疫功能和保护肠黏膜的作用，其含量降低可导致细菌移位、内毒素血症和胆汁葡萄糖醛酸酶活性改变，促使胆囊内结石的形成[18]。目前已知组氨酸具有抗炎特性，其可以降低活性氧的含量[19-21]。组氨酸可以通过剂量依赖性的方式抑制氧化应激和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在转录水平诱导白介素 8（IL-8）分泌，并且消除 TNF-α诱导的核因子κB（NF-κB）依赖性的 IL-8 启动子的激活[22-23]。胆囊结石患者血清中增加的胆汁酸则会产生一些促进胆囊结石生成的活性氧成分[15]。组氨酸的缺乏导致 γ-球蛋白聚集和炎症反应，此外，外源性组氨酸会阻止 γ-球蛋白的聚集以及继发的炎症反应[24]。而本研究结果表明，胆囊结石患者血清中的组氨酸水平明显不足。据报道[20]，慢性炎性肾脏疾病患者血清中的组氨酸浓度亦降低。缬氨酸作为支链氨基酸，主要参与能量代谢，而这类支链氨基酸代谢有利于细胞的长期能量供应，因此血清中缬氨酸的异常降低进一步证实胆囊结石患者的氨基酸代谢存在异常，能量代谢受损。
机体氨基酸代谢紊乱使得机体对抗胆囊结石及其所致的炎症反应能力降低[25]。本研究发现，胆囊结石组血清中的胆碱浓度降低。胆碱是磷脂合成的重要底物，磷脂可通过调控多药耐药基因 2（MDR2）mRNA 的表达，减少胆道内脂质胆汁的分泌，防止胆囊结石生成，所以胆碱水平降低可能导致胆囊结石形成[26-27]。胆囊结石组患者血清中的缬氨酸、谷氨酸、组氨酸等氨基酸，以及 β-葡萄糖和 α-葡萄糖的浓度降低，提示胆囊结石患者不仅有脂代谢紊乱，而且还可能有糖代谢紊乱和氨基酸代谢紊乱，而赖氨酸、酪氨酸及葡萄糖浓度改变与胆囊结石的关系及其致病机制则需进一步探讨。
3.2 胆囊结石患者胆汁中存在胆汁酸代谢异常
胆汁是一种消化液，它含有多种成分，其最主要的脂类物质是胆汁酸、磷酸卵磷脂和胆固醇，其他还包括钠、钾、钙、磷酸盐和碳酸盐，以及少量的蛋白质等成分[28-29]。本研究发现了肝移植供体和胆囊结石患者胆汁的差异代谢物，与肝移植供体组比较，胆囊结石组患者胆汁中的牛磺酸结合的胆汁酸和甘氨酸结合的胆汁酸两种结合型胆汁酸的浓度均明显降低，而胆汁中的胆汁酸几乎都以结合型存在，结合型胆汁酸明显减少后胆固醇溶解能力降低，导致胆汁中胆固醇浓度明显增加而析出，进而导致胆囊结石形成[12]。但有研究高胆固醇血症和豚鼠胆囊胆色素结石关系的动物实验[2]表明，在高血清胆固醇时胆汁中的总胆固醇没有很大的变化，这与本研究结果不同。此外，本研究结果表明，胆囊结石组胆汁中的 PC 浓度较肝移植供体降低。 PC 浓度降低导致胆囊结石形成的原因可能是，胆汁中有一种由 PC 和胆固醇组成的球泡，它可溶解大多数胆汁内的胆固醇，当 PC 浓度降低后，球泡数量降低，胆固醇不稳定从而析出形成结石[28-29]。
3.3 小结
本研究采用1H-NMR 方法进行代谢组学研究，1H-NMR 法作为一种新的方法，与基因组学、蛋白质组学等相结合后，可帮助我们探索胆囊结石的成因及其致病机制。但由于本研究的样本量较小，因此需要进一步扩大样本量，以提高胆囊结石特征代谢产物模型结果的可靠性，进一步研究糖代谢紊乱、氨基酸代谢紊乱与胆囊结石形成的关系及其致病机制。根据本研究结果，可以初步得出，胆囊结石患者和无胆囊结石的健康人的血清代谢物和胆汁代谢物均存在明显的差异，胆囊结石患者不仅存在脂代谢紊乱，还存在糖代谢紊乱以及氨基酸代谢紊乱。
近年来，我国自然人群胆囊结石的发病率呈逐渐升高趋势，发病率从 5% 上升到 10%[1]。有研究者[2]认为，造成胆囊结石的原因有胆汁化学成分的改变、细菌感染和胆汁淤积；也有研究[3]提示脂质代谢异常与胆囊结石发生的关系密切。但是，既往的研究是以较单一的脂代谢产物为研究对象，不能了解脂质代谢整体与胆囊结石发生的关系，更不能把握机体整个代谢物质的变化与胆囊结石的关系，而代谢组学可以从整体上让我们了解体内代谢物质的变化与胆囊结石形成的关系[4]。核磁共振（NMR）技术作为代谢组学研究的主要技术之一，主要应用于疾病诊断及发病机制的研究[5-9]，其中以1H-NMR 的应用最为广泛。本研究运用基于1H-NMR 的代谢组学研究方法，针对无胆囊结石的健康人/肝移植供体和胆囊结石患者，分析他们之间血和胆汁中代谢物质的差别，从而探索与胆囊结石发病相关的代谢变化。
1 资料与方法
1.1 纳入和排除标准
1.1.1 胆囊结石组
胆囊结石患者的纳入标准：① 年龄在 18 岁以上；② 术前彩超明确诊断为胆囊结石，术中证实为胆囊成型结石；③ 手术方式为腹腔镜胆囊切除术。排除标准：① 合并其他急慢性疾病；② 术中胆汁污染；③ 合并胆管梗阻，术前总胆红素（TBIL）水平大于 28 μmol/L。
1.1.2 肝移植供体组
活体肝移植供体组纳入标准：① 年龄在 18 岁以上；② 影像学检查明确诊断无胆囊结石，且术中证实无胆囊成型结石；③ 术中证实胆囊外观正常，无炎症及水肿；④ 肝移植供体的手术方式为开腹肝脏切除附加胆囊切除术。排除标准：① 术中存在胆汁污染；② 术前总胆红素水平大于 28μmol/L。
1.1.3 健康人组
健康人员的纳入标准：① 年龄在 18 岁以上；② 体检彩超检查明确诊断无胆囊结石。排除标准：合并急、慢性疾病。
1.2 临床资料
前瞻性收集 2016 年 3 月至 2016 年 12 月期间于四川大学华西医院接受腹腔镜胆囊切除术的 19 例胆囊结石患者的血清标本和胆汁标本，因 2 例患者的血清标本收集后自凝，故胆囊结石组最终剩余血清标本 17 例。收集同期于四川大学华西医院体检的 10 例健康体检者的血清标本（健康人组），以及 15 例肝移植供体（肝移植供体组）的胆汁标本。3 组对象的基本特征见表 1，由表 1 可见，3 组对象的性别、年龄、TBIL、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及门冬氨酸氨基转移酶（AST）比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究胆囊结石患者的血清及胆汁采集、肝移植供体的胆汁采集及健康人的血清采集均通过四川大学伦理委员会审批，所有研究对象包括胆囊结石患者、肝移植供体及健康人均已签署知情同意书。
表1
胆囊结石组、肝移植供体组与健康人组的临床特征比较
1.3 标本采集
胆囊结石组、肝移植供体组及健康人组对象均于入院第 1 天（健康组为体检当天）清晨空腹、静脉抽取血液 3～4 mL，置于真空采血管中，3 000 r/min离心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低温冰箱中冷冻备用。肝移植供体组及胆囊结石组研究对象在胆囊切除后需保持胆囊的完整性、不泄露胆汁，空针穿刺抽吸 3～4 mL 胆汁，置于玻璃管中，然后 3 000 r/min 离心 10 min（r=10 cm），取上清液于–80 ℃ 深低温冰箱中冷冻备用。
1.4 代谢组学检测和分析
本研究的代谢组学分析是委托四川来福瑞科技有限公司完成的。取出冻存血清和胆汁，室温下解冻，以 13 000 r/min 离心（4 ℃，r=10 cm）10 min 后取 4 00 μL 上清液加入 5 mm 核磁管中，再于核磁管中加入 100 μL 重水（D2O），充分振荡约 1 min。在 Varian NMR System 600 MHz 谱仪（Varian 公司，美国）上采集1H-NMR 自由感应衰减（free induction decay，FID）信号。采用 MestReNova 9.0 软件（Mestrelab MestReNova 公司，西班牙）对信号进行手动调相、基线校正和谱峰对齐，并进行分段积分及归一化处理，同时扣除水峰残留信号以得到相应图谱。采用 SIMCA-P+ 11.0 软件（Umetrics AB 公司，瑞典）将积分数据归一化并构成数据矩阵，并利用主成分分析法（PCA）对数据矩阵进行统计分析，得到 PCA 得分图（scores plot）。采用 SIMCA-P+ 11.0 软件对归一化后的数据进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），通过 PLS-DA 的变量权重值（variable importance in the projection，VIP）找出相对应的差异化学位移（ppm）。再通过 PLS-DA 以发现 NMR 数据和其他变量之间的相关关系，并采用交叉验证后得到的反映变量 Y 的变异百分比（R2Y）和模型预测值（Q2），对模型的有效性进行评判。然后，对 PLS-DA 模型进行正交矫正处理（OPLS-DA），以最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异，并通过载荷图进行差异代谢物的筛选和鉴定。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。3 组研究对象的年龄、TBIL、DBIL、IBIL、ALT 及 AST 以均数±标准差（
±s）表示，统计方法采用单因素方差分析（ANOVA）；3 组研究对象的性别构成比较采用成组χ2检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 健康人及胆囊结石患者血清标本的代谢组学分析结果
2.1.1 健康人及胆囊结石患者的血清标本中1H-NMR 测定结果
通过将 FID 信号导入软件后得到健康人及胆囊结石患者血清样本的代表性1H-NMR 图谱，见图 1。由图 1 可见，与健康人比较，胆囊结石患者血清中的缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、组氨酸、次黄嘌呤等成分的1H-NMR 信号峰有所降低，而乙酰乙酸和1, 2-丙二醇的1H-NMR 信号峰有所升高，提示健康人和胆囊结石患者血清中的代谢成分浓度有一定的差异。
图1
示健康人（a）及胆囊结石患者（b）血清样本的代表性1H-NMR 图谱
hypoxanthine：次黄嘌呤；histidine：组氨酸；tyrosine：酪氨酸；α-glucose：α-葡萄糖；β-glucose：β-葡萄糖；lactate：乳酸盐；lysine：赖氨酸；glutamine：谷氨酰胺；N-acetyl glycoprotein：N-乙酰基糖蛋白；alanine：丙氨酸；valine：缬氨酸；VLDL：极低密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；phenylalanine：苯丙氨酸；acetoacetate：乙酰乙酸；1, 2-propanediol：1, 2-丙二醇
2.1.2 健康人及胆囊结石患者的血清标本中1H-NMR 数据分析
① PCA：PCA 结果见图 2a，由图 2a 可见，第1主成分（PC1）与第2主成分（PC2）的 PCA 得分图，提示健康人和胆囊结石患者的血清标本的主成分积分值在椭圆形散点图（95% 置信区间）中无明显交叉，说明健康人和胆囊结石患者的血清样本代谢物能在 PCA 得分图上得到一定的区分。② 1H-NMR 图谱模式识别分析：进一步进行 PLS-DA 分析（图 2b 和图 2c）和正交矫正处理（图 2d–2f）。PLS-DA 分析（图 2b 和图 2c）结果显示：健康组和胆囊结石组的血清标本存在显著的差异；置换检验图（图 2d）表明 PLS-DA 模型能较好地解释 2 组血清成分之间的差异。相比 PLS-DA 分析，健康人组和胆囊结石组的血清样本能在 OPLS-DA 得分图（图 2e–2f）上得到更好的分离，从而表明 2 组血清样本的内源性代谢物有明显的区别。本研究进一步观察 OPLS-DA 分析的载荷图（图 2g）可知，第 168、170、171、157、156、167、155、154、153、158、159、160、161、162、73、74、75、663、675、658、676、666、655、679、656、680、662、657、660 等变量是造成健康人组和胆囊结石组差异的主要变量。③ 血清差异代谢物的筛选和鉴定：健康人组和胆囊结石组的血清差异代谢物的筛选和鉴定结果见表 2。由表 2 可见，与健康人比较，胆囊结石患者的血清中共有 16 种差异代谢物，其中胆囊结石组患者的缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸、肌酸酐、胆碱、β-葡萄糖、α-葡萄糖、酪氨酸、组氨酸以及次黄嘌呤的浓度较健康人组明显降低（P<0.05），而胆囊结石组患者的乳酸盐、乙酰乙酸以及 1, 2-丙二醇的浓度较健康人组明显升高（P<0.05）。
图2
示健康人和胆囊结石患者血清标本的代谢组学分析图
a：PCA 得分图；b：PLS-DA 二维得分图；c：PLS-DA 三维得分图；d：PLS-DA 分析的置换检验图，
表2
健康人组和胆囊结石组血清比较的主要差异代谢物及相关系数值
2.2 肝移植供体及胆囊结石患者胆汁标本的代谢组学分析结果
2.2.1 肝移植供体及胆囊结石患者的胆汁标本的 1H-NMR 测定结果
肝移植供体及胆囊结石患者的胆汁样本的代表性1H-NMR 图谱见图 3。通过将 FID 信号导入软件后得到1H-NMR 图谱后（图 3）发现，与肝移植供体比较，胆囊结石患者胆汁中的甘氨酸结合的胆汁酸（glycine conjugated bile acids）、甘氨酸结合的去氧胆汁酸、甘氨酸结合的鹅去氧胆汁酸、牛磺酸结合的胆汁酸（taurine conjugated bile acids）、牛磺酸结合的去氧胆汁酸以及牛磺酸结合的鹅去氧胆汁酸的1H-NMR 信号峰均明显降低。此外，胆囊结石患者的磷脂酰胆碱（phosphatidyl- choline，PC）和胆碱成分的信号强度也较肝移植供体有所降低。
图3
示肝移植供体（a）及胆囊结石患者（b）胆汁的代表性1H-NMR 图谱
taurine conjugated bile acids：牛磺酸结合的胆汁酸；glycine conjugated bile acids：甘氨酸结合的胆汁酸；cholesterol：胆固醇；PC：磷脂酰胆碱；glycerol：甘油；lipids：脂类；choline：胆碱；bile acids：胆汁酸；total bile acids；总胆汁酸；CA：甘氨酸/牛磺酸结合的胆酸；CDCA：甘氨酸/牛磺酸结合的鹅去氧胆酸；DCA：甘氨酸/牛磺酸结合的去氧胆酸
2.2.2 肝移植供体及胆囊结石患者胆汁标本的1H-NMR 数据分析
① PCA：PCA 结果见图 4a，由图 4a 可见第1主成分（PC1）与第2主成分（PC2）的 PCA 得分图，提示肝移植供体组和胆囊结石组的胆汁标本的主成分积分值在椭圆形散点图（95% 置信区间）中得到较好地分离，仅有个别样品重叠，说明肝移植供体和胆囊结石患者的胆汁成分能在 PCA 得分图上得到一定程度的区分。② 1H-NMR 图谱模式识别分析：进一步进行 PLS-DA 分析（图 4b 和图 4c）和正交矫正处理（图 4d–4f）。结果显示：肝移植供体和胆囊结石患者的胆汁标本间存在着显著的差异（图 4b–4c），交叉验证实验（图 4d）说明 PLS-DA 模型能较好地解释 2 组胆汁成分之间的差异。与 PLS-DA 分析比较，OPLS-DA 的分离效果得到了明显地改善，这表明肝移植供体组和胆囊结石组的胆汁标本的内源性代谢物有显著的差异（图 4e–4f）。笔者进一步观察了 OPLS-DA 分析的载荷图，具体见图 4g。由图 4g 可知，第 159、156、155、157、160、84、158、82、154、161、665、85、166、167、79、165、74、75、658、153、86、73、109 等变量是造成肝移植供体组和胆囊结石组存在差异的主要变量。③ 胆汁差异代谢物的筛选和鉴定：肝移植供体组和胆囊结石组的胆汁差异代谢物的筛选和鉴定结果见表 3。由表 3 可见，与肝移植供体比较，胆囊结石患者的胆汁中存在 5 种差异代谢物，其中胆囊结石组患者的牛磺酸结合的胆汁酸、甘氨酸结合的胆汁酸、胆碱以及 PC 的浓度均较肝移植供体组明显降低（P<0.05），而胆囊结石组患者胆汁中的胆固醇浓度较肝移植供体组明显升高（P<0.05）。
图4
示肝移植供体和胆囊结石患者胆汁标本的代谢组学分析图
a：PCA 得分图；b：PLS-DA 二维得分图；c：PLS-DA 三维得分图；d：OPLS-DA 分析的置换检验图：
表3
肝移植供体和胆囊结石患者的主要差异代谢物及相关系数值
3 讨论
胆囊结石的成因复杂，许多学者[1, 2-6, 10]也做了大量的相关研究。有学者[2, 4]在致石基因与遗传因素对胆囊结石影响的研究中，通过对近交系的小鼠进行研究，发现了著名的 Lith-1 基因与胆囊结石连锁。在胆囊动力学紊乱与胆囊结石形成关系的研究中，学者[10-11]发现，胆囊运动减弱是胆囊结石发生的重要因素之一，而胆囊收缩素受体的缺乏可能是胆囊运动功能受损的重要原因之一。此外，细菌感染可能也是导致胆囊结石的一个重要因素，细菌感染可导致胆囊运动减弱和胆汁淤积，并改变胆汁的成分和理化性质，最终导致胆囊结石形成[2, 10, 12]。脂代谢紊乱也可以诱发胆囊结石[2-3, 12-13]，但是除了脂代谢以外，其他代谢如糖代谢和氨基酸代谢在胆囊结石的形成中是否也起到了重要的作用，以及体内代谢物质的整体变化与胆囊结石形成的关系尚鲜见报道。
3.1 胆囊结石患者存在血清糖代谢及氨基酸代谢异常
胆囊结石的形成可能与糖代谢紊乱有关。在本研究中，丙酮酸代谢被发现是高度影响胆囊结石形成的代谢途径（| r | =0.482）。丙酮酸是人类新陈代谢的关键代谢物，其通过柠檬酸或草酰乙酸进入柠檬酸循环，参与不同的生物合成途径[14]。丙酮酸可通过脱羧生成乙酰辅酶 A，从而进入胆固醇合成途径。本研究结果表明，胆囊结石患者血清中的丙酮酸较健康人明显降低，即丙酮酸大量脱羧生成乙酰辅酶 A 从而合成胆固醇，而血清高胆固醇浓度导致胆汁过饱和，从而使胆汁中的胆固醇沉淀为晶体并导致起始胆囊结石形成。此外，乳酸盐也是糖代谢的重要参与者。在慢性胆囊炎患者中，胆囊上皮细胞中乳酸盐水平的升高可能与 Warburg 效应有关，即在氧含量充足的情况下，糖酵解仍然增加[15]，而这种效应常于肿瘤细胞中观察到，这提示其可能是胆囊慢性炎症向癌症进展的标志物之一。本研究结果表明，胆囊结石患者的血清乳酸盐浓度较健康人升高，这与一项关于兔胆囊结石代谢组学特征的研究[16]相一致。该研究发现，与正常对照组比较，兔胆囊结石组的血浆乳酸水平明显升高。
氨基酸代谢异常可能也在胆囊结石形成中发挥作用。本研究结果表明，与健康组人相比较，胆囊结石组的血清谷氨酸、谷氨酰胺及组氨酸含量明显降低。谷氨酰胺参与体内能量代谢和物质合成。在炎性病症中，谷氨酰胺通过为生物合成提供碳源和氮源来维持细胞的存活和生长。谷氨酰胺的抗氧化能力也有助于减轻炎症，同时也可维持细胞的稳态。而在胆囊结石患者中，血清谷氨酰胺水平明显降低，表明机体抗胆囊结石所致的慢性炎症的能力减弱，从而导致胆囊炎症的进行性进展，而胆道炎症业已被证实与胆系结石的形成有关[17]。同时谷氨酰胺具有调节肠道免疫功能和保护肠黏膜的作用，其含量降低可导致细菌移位、内毒素血症和胆汁葡萄糖醛酸酶活性改变，促使胆囊内结石的形成[18]。目前已知组氨酸具有抗炎特性，其可以降低活性氧的含量[19-21]。组氨酸可以通过剂量依赖性的方式抑制氧化应激和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在转录水平诱导白介素 8（IL-8）分泌，并且消除 TNF-α诱导的核因子κB（NF-κB）依赖性的 IL-8 启动子的激活[22-23]。胆囊结石患者血清中增加的胆汁酸则会产生一些促进胆囊结石生成的活性氧成分[15]。组氨酸的缺乏导致 γ-球蛋白聚集和炎症反应，此外，外源性组氨酸会阻止 γ-球蛋白的聚集以及继发的炎症反应[24]。而本研究结果表明，胆囊结石患者血清中的组氨酸水平明显不足。据报道[20]，慢性炎性肾脏疾病患者血清中的组氨酸浓度亦降低。缬氨酸作为支链氨基酸，主要参与能量代谢，而这类支链氨基酸代谢有利于细胞的长期能量供应，因此血清中缬氨酸的异常降低进一步证实胆囊结石患者的氨基酸代谢存在异常，能量代谢受损。
机体氨基酸代谢紊乱使得机体对抗胆囊结石及其所致的炎症反应能力降低[25]。本研究发现，胆囊结石组血清中的胆碱浓度降低。胆碱是磷脂合成的重要底物，磷脂可通过调控多药耐药基因 2（MDR2）mRNA 的表达，减少胆道内脂质胆汁的分泌，防止胆囊结石生成，所以胆碱水平降低可能导致胆囊结石形成[26-27]。胆囊结石组患者血清中的缬氨酸、谷氨酸、组氨酸等氨基酸，以及 β-葡萄糖和 α-葡萄糖的浓度降低，提示胆囊结石患者不仅有脂代谢紊乱，而且还可能有糖代谢紊乱和氨基酸代谢紊乱，而赖氨酸、酪氨酸及葡萄糖浓度改变与胆囊结石的关系及其致病机制则需进一步探讨。
3.2 胆囊结石患者胆汁中存在胆汁酸代谢异常
胆汁是一种消化液，它含有多种成分，其最主要的脂类物质是胆汁酸、磷酸卵磷脂和胆固醇，其他还包括钠、钾、钙、磷酸盐和碳酸盐，以及少量的蛋白质等成分[28-29]。本研究发现了肝移植供体和胆囊结石患者胆汁的差异代谢物，与肝移植供体组比较，胆囊结石组患者胆汁中的牛磺酸结合的胆汁酸和甘氨酸结合的胆汁酸两种结合型胆汁酸的浓度均明显降低，而胆汁中的胆汁酸几乎都以结合型存在，结合型胆汁酸明显减少后胆固醇溶解能力降低，导致胆汁中胆固醇浓度明显增加而析出，进而导致胆囊结石形成[12]。但有研究高胆固醇血症和豚鼠胆囊胆色素结石关系的动物实验[2]表明，在高血清胆固醇时胆汁中的总胆固醇没有很大的变化，这与本研究结果不同。此外，本研究结果表明，胆囊结石组胆汁中的 PC 浓度较肝移植供体降低。 PC 浓度降低导致胆囊结石形成的原因可能是，胆汁中有一种由 PC 和胆固醇组成的球泡，它可溶解大多数胆汁内的胆固醇，当 PC 浓度降低后，球泡数量降低，胆固醇不稳定从而析出形成结石[28-29]。
3.3 小结
本研究采用1H-NMR 方法进行代谢组学研究，1H-NMR 法作为一种新的方法，与基因组学、蛋白质组学等相结合后，可帮助我们探索胆囊结石的成因及其致病机制。但由于本研究的样本量较小，因此需要进一步扩大样本量，以提高胆囊结石特征代谢产物模型结果的可靠性，进一步研究糖代谢紊乱、氨基酸代谢紊乱与胆囊结石形成的关系及其致病机制。根据本研究结果，可以初步得出，胆囊结石患者和无胆囊结石的健康人的血清代谢物和胆汁代谢物均存在明显的差异，胆囊结石患者不仅存在脂代谢紊乱，还存在糖代谢紊乱以及氨基酸代谢紊乱。
