引用本文： 张小东, 杨照国, 杨良, 马英博, 李航宇. PKM2和YAP在人肝癌组织中的表达及其相关性分析. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(12): 1443-1449. doi: 10.7507/1007-9424.20160367 复制
肝癌是一种常见的、死亡率高的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内位居第4位，在中国位于第2位[1]。目前肝癌的治疗方法主要是手术切除肿瘤组织[2]，但这并无法彻底治愈肝癌，且手术患者术后往往预后不良。因此研究肝癌发生发展的机理已成为近年来的重点。近几年的研究[3-5]表明，在肿瘤细胞的发生发展过程中，往往伴随着能量代谢的改变，其主要能量代谢方式是有氧糖酵解，而导致肿瘤细胞有氧糖酵解增强的原因与糖酵解过程中关键酶的合成增加、活性增强及某些信号通路异常相关，因此研究有氧糖酵解过程中的关键酶与信号通路之间的调控关系对于探究肿瘤的发生发展机理极为重要。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）是有氧糖酵解过程中的关键酶[6-7]，目前已在结直肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中检测到PKM2蛋白呈高表达，且其含量与肿瘤的分期密切相关[8-9]。yes相关蛋白（yes association protein，YAP）是HIPPO信号通路下游的效应蛋白，其已被证实在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中表达上调，并能促进肿瘤的侵袭和转移[10-11]。最新的研究[12]表明，YAP蛋白与肿瘤细胞能量代谢过程密切相关，无论是抑制肿瘤细胞的葡萄糖摄取、有氧糖酵解过程，还是将有氧糖酵解向氧化磷酸化过程转化，均能抑制YAP蛋白的致癌活性。然而目前关于PKM2蛋白与YAP蛋白在肝癌组织中表达的相关性尚不明确，深化PKM2蛋白与YAP蛋白的研究将为未来肝癌的临床治疗提供潜在的靶点。因此，本实验拟利用免疫组织化学染色方法检测肝癌组织及癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达情况，并采用Western blot与实时荧光定量PCR方法检测癌旁组织和肝癌组织中PKM2蛋白、YAP蛋白及其mRNA的表达水平，以探讨PKM2蛋白与YAP蛋白在肝癌组织中表达的相关性，同时结合其表达与患者临床病理学特征之间的关系，探讨PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织中表达的意义，为有效治疗肝癌提供策略支持。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2010年4月至2013年10月期间于中国医科大学附属第四医院行手术切除的120例肝细胞癌标本。所有病例均有完整的随访资料，且所有患者术前均未进行化疗和放疗治疗。120例患者中，男93例，女27例；年龄39~79岁，平均55.3岁，其中≤55岁53例， > 55岁67例；肿瘤直径≤5 cm59例， > 5 cm 61例；按国际抗癌联盟（UICC）分期标准[13]进行分期：Ⅰ期+Ⅱ期76例，Ⅲ期+Ⅳ期44例；低分化28例，中、高分化92例；合并肝炎112例，未合并肝炎8例；甲胎蛋白（AFP）水平≤200 ng/mL48例， > 200 ng/mL 72例。肝癌标本同时取癌旁组织标本（距离肿瘤 > 2 cm）作为对照。其中，50例肝癌组织及癌旁组织标本具备手术时立即取材的新鲜冰冻组织标本，置液氮冷却后送-70 ℃冷冻冰箱保存，以供Western blot与实时荧光定量PCR检测。50例患者中，男31例，女19例；年龄43~65岁，平均53.5岁，其中≤55岁21例， > 55岁29例；肿瘤直径≤5 cm 23例， > 5 cm 27例；Ⅰ期+Ⅱ期32例，Ⅲ期+Ⅳ期18例；低分化11例，中、高分化39例。组织病理学评估均由两位高年资病理医生独立观察，确诊为肝细胞癌并复查无误。所有标本检测均经患者及其家属同意，并签署知情同意书。
1.2 主要试剂和设备
主要试剂：免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司，兔抗人YAP、PKM2多克隆抗体和鼠抗人多克隆β-actin抗体均购于ProteinTech公司，辣根酶标记的羊抗鼠IgG和辣根酶标记的羊抗兔IgG均购于北京中衫生物有限公司，PCR引物购于北京鼎国生物公司，实时荧光定量PCR试剂盒购于Promega试剂公司。主要设备：BX51光学显微镜购自Lesia公司，PowerPac Basic电泳系统及转膜系统均购自美国Bio-Rad公司，5500全自动化学发光成像分析系统购自上海天能公司，TP600 PCR仪购自TAKARA公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫组织化学染色法检测PKM2蛋白和YAP蛋白的表达
采用免疫组织化学染色法检测120例肝癌及其癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达。免疫组织化学染色的具体操作严格按照说明书进行，用已知阳性组织（阳性对照是由两位病理医生独立在肝癌组织中进行PKM2和YAP蛋白染色并确定阳性表达的其他肝癌组织）切片作为阳性对照，以PBS溶液替代一抗作为阴性对照。结果判定标准严格规范化[14]。阳性判断标准以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，评分标准采用综合评价法，且每张切片随机观察100个细胞。染色范围评分标准：无阳性细胞为（-），为0分；阳性细胞占1%~30%为（+），为1分；阳性细胞占31%~60%为（++），为2分；阳性细胞所占比例 > 60%为（+++），为3分。染色强度评分标准：无染色为0分，染色颗粒黄、细、成堆为1分，染色颗粒深黄、粗、成片为2分，染色颗粒棕黄、粗大、成片为3分。染色范围评分和染色强度评分相乘即为肿瘤细胞的免疫组织化学染色得分，0分为（-），1~2分为（+），3~4分为（++）， > 4分为（+++），其中（-）为阴性表达，（+）~（+++）为阳性表达[15]。
1.3.2 western blot法检测PKM2蛋白和YAP蛋白的相对表达水平
采用western blot法检测50例肝癌及其癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的相对表达水平。Western blot的具体操作严格按照说明书进行。通过Image J软件分析图像，分别以PKM2蛋白、YAP蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
1.3.3 实时荧光定量PCR法检测PKM2 mRNA和YAP mRNA的相对表达水平
采用实时荧光定量PCR法检测50例新鲜肝癌及其癌旁组织中PKM2mRNA和YAP mRNA的相对表达水平。将组织剪碎后，用Trizol试剂提取组织总RNA，根据试剂盒说明书步骤进行实时荧光定量PCR检测。PKM2基因的上游引物序列为：5’-ATGTCGAAGCCCCATAGT-GAA-3’，下游引物序列为：5’-TGGGTGGTGAATCAA-TGTCCA-3’，扩增片段长度为118 bp；YAP基因的上游引物序列为：5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3’，下游引物序列为：5’-TCATGCTTAGTCCACTGTCT-GT-3’，扩增片段长度为177 bp；内参18S基因的上游引物序列为：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT-GG-3’，扩增片段长度为197 bp。实时荧光定量PCR反应体系按照SYBR Green说明书配制。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s退火，共40个循环。根据绘制的标准曲线得到PKM2 mRNA和YAP mRNA表达的相对浓度，以目的基因与18S基因相对浓度的比值来表示目的基因的表达量。每例设2个复孔，取均值。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，统计方法采用配对t检验；计数资料的统计分析方法采用配对χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。检验水准（双侧）α=0.050。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果
2.1.1 肝癌组织和癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达
免疫组织化学染色结果示，PKM2蛋白表达阳性时，染色呈现棕黄色，主要在细胞浆内表达（图 1）。其在肝癌组织中表达呈（-）39例，（+）30例，（++）27例，（+++）24例，总表达阳性率为67.50%（81/120）；其在癌旁组织中的表达呈（-）95例，（+）23例，（++）2例，（+++）0例，总表达阳性率为20.83%（25/120）。YAP蛋白表达阳性时，染色呈现棕黄色，主要在细胞核内，少量在细胞浆内表达（图 1）。其在肝癌组织中表达呈（-）34例，（+）32例，（++）27例，（+++）27例，总表达阳性率为71.67%（86/120），在癌旁组织中表达呈（-）85例，（+）32例，（++）2例，（+++）1例，总表达阳性率为29.17%（35/120）。肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的总表达阳性率均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P < 0.050）。
图1
示PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织和癌旁组织中表达的SP免疫组织化学染色结果，上图为100倍，下图为400倍。1A：PKM2蛋白在癌旁组织中呈（-）表达；1B：PKM2蛋白在肝癌组织中呈（+++）表达；1C：YAP蛋白在癌旁组织中呈（-）表达；1D：YAP蛋白在肝癌组织中呈（+++）表达
2.1.2 肝癌组织中PKM2蛋白表达与YAP蛋白表达的相关性
肝癌组织中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表达呈正相关（r=0.519，P < 0.001），见表 1。提示在肝癌组织中，PKM2蛋白和YAP蛋白可能存在协同作用，共同促进肝癌的发生发展。
表1
肝癌组织中PKM2蛋白表达与YAP蛋白表达的相关性
2.1.3 肝癌组织中PKM2和YAP蛋白表达与患者临床病理学特征的关系
肝癌组织中PKM2蛋白的表达与性别、年龄及合并肝炎均无关（P > 0.050），而与肿瘤直径、TNM分期、肿瘤分化程度及AFP水平相关（P < 0.050），肿瘤直径 > 5 cm、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、肿瘤分化程度为低分化、AFP水平 > 200 ng/mL肝癌患者的PKM2蛋白的表达阳性率较高。肝癌组织中YAP蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期及合并肝炎均无关（P > 0.050），而与肿瘤分化程度和AFP水平有关（P < 0.050），AFP水平 > 200 ng/mL、分化程度为低分化肝癌患者的YAP蛋白的表达阳性率较高。见表 2。
表2
肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白表达与患者临床病理学特征的关系（例）
2.2 Western blot结果
Western blot结果显示，50例肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达水平分别为1.25±0.11和1.08±0.10，癌旁组织分别为0.38±0.01和0.41±0.02。肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达水平均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P < 0.050），见图 2。
图2
示PKM2和YAP蛋白在肝癌组织和癌旁组织中表达的电泳结果（部分代表性蛋白条带图）。N：癌旁组织；T：肝癌组织；1-7：病例编号
2.3 实时荧光定量PCR结果
实时荧光定量PCR结果表明，以癌旁组织作为基准（即为1），肝癌组织中PKM2 mRNA和YAP mRNA的表达水平分别为11.38±0.35和19.96±0.48，肝癌组织中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相对表达水平均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P < 0.050），见图 3。
图3
示肝癌组织和癌旁组织中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相对表达水平（以癌旁组织作为基准）
3 讨论
肿瘤细胞即使在有氧条件下，也经由糖酵解转化大量葡萄糖而生成乳酸，这一现象被称为Warburg效应[16-17]，是肿瘤细胞的基本特征之一。在糖酵解过程中有多种酶发挥重要的作用，其中PKM2蛋白值得我们关注。PKM2蛋白是丙酮酸激酶（PK）的同工酶，PK在代谢过程中的主要功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸产生丙酮酸。而PKM2蛋白除了通过核转录调节和活性调节两个方面调控肿瘤细胞的能量代谢过程外，还参与到了多种信号通路的转录调控活动中[18]。PKM2蛋白的表达既可以被缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）和C-MYC基因调控[19-20]，也可以在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路过度活化后表达上调，引起Warburg效应的增强[21]。鉴于PKM2蛋白在维系肿瘤细胞能量和合成原料供应平衡中发挥的重要作用及其与信号通路之间的调控关系，其已成为肿瘤诊断和治疗领域的研究热点。
越来越多的研究[22-24]表明，YAP蛋白是致癌蛋白，其与多种肿瘤的发生发展密切相关。YAP蛋白在细胞核内的聚集以及表达上调是引起细胞过度增殖、乃至癌变的重要因素。近几年的研究[25-27]表明，YAP蛋白在肿瘤细胞能量代谢改变的过程中同样发挥着重要作用。DeRan等[25]发现，细胞内能量水平是YAP基因上游的调节因子，细胞能量应激状态的出现，如葡萄糖代谢的抑制和ATP产生减少，均能抑制YAP基因的活性，进而影响肿瘤细胞的增殖。Wang等[26]在对肝癌和结肠癌组织的免疫组织化学研究中发现，YAP蛋白与葡萄糖转运蛋白3（glucose transporter 3，GLUT3）都处于高表达状态，且相关性分析表明二者表达呈正相关；进一步开展细胞水平上的研究表明，YAP蛋白通过直接上调GLUT3蛋白的表达来促进肿瘤细胞的葡萄糖摄取和有氧糖酵解过程。Enzo等[27]的研究表明，在肿瘤细胞中，有氧糖酵解除了发挥自身的生化作用外，还可以参与调控YAP蛋白的表达，进一步促进肿瘤细胞的增殖和侵袭；此外，磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1）--糖酵解过程中的第一个关键酶，通过与YAP/TEAD转录因子复合体相互作用，直接参与对YAP基因的表达调控。那么，糖酵解过程中的另一重要关键酶--PKM2，其与YAP之间存在怎样的关系值得我们进一步研究。因此明确PKM2蛋白与YAP蛋白在肝癌组织中的表达及相关性，对肝癌的发生、发展、早期诊断和治疗研究均具有潜在的意义。
在本研究中，笔者首先利用免疫组织化学染色SP方法，研究了PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况。结果显示，PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织中的表达阳性率均高于癌旁组织（P < 0.050），YAP蛋白在肝癌组织中主要在细胞核内表达，PKM2蛋白则主要在肝癌组织的细胞浆内表达；且二者之间的相关性分析结果表明，在肝癌组织中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表达呈正相关关系（r=0.519，P < 0.001）。该结果提示，PKM2蛋白与YAP蛋白的表达与肝癌的发生密切相关，二者可能具有协同作用。接下来，笔者通过分析PKM2蛋白和YAP蛋白与患者临床病理学特征的关系后发现，PKM2蛋白和YAP蛋白的表达均与肝癌的分化程度以及AFP水平相关，阳性表达PKM2蛋白和YAP蛋白的患者往往伴随着肿瘤分化程度的降低以及AFP水平的升高。为了进一步明确PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织中的表达关系，笔者在免疫组织化学染色结果的基础上，利用Western blot与实时荧光定量PCR方法对50例新鲜冰冻肝癌组织及其癌旁组织标本进行蛋白水平和mRNA水平的检测，结果western blot与实时荧光定量PCR的结果与免疫组织化学染色结果一致，即在蛋白和mRNA两个水平，PKM2和YAP在肝癌组织中的表达都高于癌旁组织（P < 0.050）。以上结果表明，肝癌的发生发展与PKM2蛋白和YAP蛋白的表达密切相关，但是二者之间的确切调控关系还需细胞水平的实验验证。深入探索PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌中的调控机理，有望为肝癌的临床治疗提供潜在的靶点支持。
肝癌是一种常见的、死亡率高的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内位居第4位，在中国位于第2位[1]。目前肝癌的治疗方法主要是手术切除肿瘤组织[2]，但这并无法彻底治愈肝癌，且手术患者术后往往预后不良。因此研究肝癌发生发展的机理已成为近年来的重点。近几年的研究[3-5]表明，在肿瘤细胞的发生发展过程中，往往伴随着能量代谢的改变，其主要能量代谢方式是有氧糖酵解，而导致肿瘤细胞有氧糖酵解增强的原因与糖酵解过程中关键酶的合成增加、活性增强及某些信号通路异常相关，因此研究有氧糖酵解过程中的关键酶与信号通路之间的调控关系对于探究肿瘤的发生发展机理极为重要。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）是有氧糖酵解过程中的关键酶[6-7]，目前已在结直肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中检测到PKM2蛋白呈高表达，且其含量与肿瘤的分期密切相关[8-9]。yes相关蛋白（yes association protein，YAP）是HIPPO信号通路下游的效应蛋白，其已被证实在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中表达上调，并能促进肿瘤的侵袭和转移[10-11]。最新的研究[12]表明，YAP蛋白与肿瘤细胞能量代谢过程密切相关，无论是抑制肿瘤细胞的葡萄糖摄取、有氧糖酵解过程，还是将有氧糖酵解向氧化磷酸化过程转化，均能抑制YAP蛋白的致癌活性。然而目前关于PKM2蛋白与YAP蛋白在肝癌组织中表达的相关性尚不明确，深化PKM2蛋白与YAP蛋白的研究将为未来肝癌的临床治疗提供潜在的靶点。因此，本实验拟利用免疫组织化学染色方法检测肝癌组织及癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达情况，并采用Western blot与实时荧光定量PCR方法检测癌旁组织和肝癌组织中PKM2蛋白、YAP蛋白及其mRNA的表达水平，以探讨PKM2蛋白与YAP蛋白在肝癌组织中表达的相关性，同时结合其表达与患者临床病理学特征之间的关系，探讨PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织中表达的意义，为有效治疗肝癌提供策略支持。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2010年4月至2013年10月期间于中国医科大学附属第四医院行手术切除的120例肝细胞癌标本。所有病例均有完整的随访资料，且所有患者术前均未进行化疗和放疗治疗。120例患者中，男93例，女27例；年龄39~79岁，平均55.3岁，其中≤55岁53例， > 55岁67例；肿瘤直径≤5 cm59例， > 5 cm 61例；按国际抗癌联盟（UICC）分期标准[13]进行分期：Ⅰ期+Ⅱ期76例，Ⅲ期+Ⅳ期44例；低分化28例，中、高分化92例；合并肝炎112例，未合并肝炎8例；甲胎蛋白（AFP）水平≤200 ng/mL48例， > 200 ng/mL 72例。肝癌标本同时取癌旁组织标本（距离肿瘤 > 2 cm）作为对照。其中，50例肝癌组织及癌旁组织标本具备手术时立即取材的新鲜冰冻组织标本，置液氮冷却后送-70 ℃冷冻冰箱保存，以供Western blot与实时荧光定量PCR检测。50例患者中，男31例，女19例；年龄43~65岁，平均53.5岁，其中≤55岁21例， > 55岁29例；肿瘤直径≤5 cm 23例， > 5 cm 27例；Ⅰ期+Ⅱ期32例，Ⅲ期+Ⅳ期18例；低分化11例，中、高分化39例。组织病理学评估均由两位高年资病理医生独立观察，确诊为肝细胞癌并复查无误。所有标本检测均经患者及其家属同意，并签署知情同意书。
1.2 主要试剂和设备
主要试剂：免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司，兔抗人YAP、PKM2多克隆抗体和鼠抗人多克隆β-actin抗体均购于ProteinTech公司，辣根酶标记的羊抗鼠IgG和辣根酶标记的羊抗兔IgG均购于北京中衫生物有限公司，PCR引物购于北京鼎国生物公司，实时荧光定量PCR试剂盒购于Promega试剂公司。主要设备：BX51光学显微镜购自Lesia公司，PowerPac Basic电泳系统及转膜系统均购自美国Bio-Rad公司，5500全自动化学发光成像分析系统购自上海天能公司，TP600 PCR仪购自TAKARA公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫组织化学染色法检测PKM2蛋白和YAP蛋白的表达
采用免疫组织化学染色法检测120例肝癌及其癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达。免疫组织化学染色的具体操作严格按照说明书进行，用已知阳性组织（阳性对照是由两位病理医生独立在肝癌组织中进行PKM2和YAP蛋白染色并确定阳性表达的其他肝癌组织）切片作为阳性对照，以PBS溶液替代一抗作为阴性对照。结果判定标准严格规范化[14]。阳性判断标准以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，评分标准采用综合评价法，且每张切片随机观察100个细胞。染色范围评分标准：无阳性细胞为（-），为0分；阳性细胞占1%~30%为（+），为1分；阳性细胞占31%~60%为（++），为2分；阳性细胞所占比例 > 60%为（+++），为3分。染色强度评分标准：无染色为0分，染色颗粒黄、细、成堆为1分，染色颗粒深黄、粗、成片为2分，染色颗粒棕黄、粗大、成片为3分。染色范围评分和染色强度评分相乘即为肿瘤细胞的免疫组织化学染色得分，0分为（-），1~2分为（+），3~4分为（++）， > 4分为（+++），其中（-）为阴性表达，（+）~（+++）为阳性表达[15]。
1.3.2 western blot法检测PKM2蛋白和YAP蛋白的相对表达水平
采用western blot法检测50例肝癌及其癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的相对表达水平。Western blot的具体操作严格按照说明书进行。通过Image J软件分析图像，分别以PKM2蛋白、YAP蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
1.3.3 实时荧光定量PCR法检测PKM2 mRNA和YAP mRNA的相对表达水平
采用实时荧光定量PCR法检测50例新鲜肝癌及其癌旁组织中PKM2mRNA和YAP mRNA的相对表达水平。将组织剪碎后，用Trizol试剂提取组织总RNA，根据试剂盒说明书步骤进行实时荧光定量PCR检测。PKM2基因的上游引物序列为：5’-ATGTCGAAGCCCCATAGT-GAA-3’，下游引物序列为：5’-TGGGTGGTGAATCAA-TGTCCA-3’，扩增片段长度为118 bp；YAP基因的上游引物序列为：5’-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3’，下游引物序列为：5’-TCATGCTTAGTCCACTGTCT-GT-3’，扩增片段长度为177 bp；内参18S基因的上游引物序列为：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT-GG-3’，扩增片段长度为197 bp。实时荧光定量PCR反应体系按照SYBR Green说明书配制。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s退火，共40个循环。根据绘制的标准曲线得到PKM2 mRNA和YAP mRNA表达的相对浓度，以目的基因与18S基因相对浓度的比值来表示目的基因的表达量。每例设2个复孔，取均值。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，统计方法采用配对t检验；计数资料的统计分析方法采用配对χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。检验水准（双侧）α=0.050。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果
2.1.1 肝癌组织和癌旁组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达
免疫组织化学染色结果示，PKM2蛋白表达阳性时，染色呈现棕黄色，主要在细胞浆内表达（图 1）。其在肝癌组织中表达呈（-）39例，（+）30例，（++）27例，（+++）24例，总表达阳性率为67.50%（81/120）；其在癌旁组织中的表达呈（-）95例，（+）23例，（++）2例，（+++）0例，总表达阳性率为20.83%（25/120）。YAP蛋白表达阳性时，染色呈现棕黄色，主要在细胞核内，少量在细胞浆内表达（图 1）。其在肝癌组织中表达呈（-）34例，（+）32例，（++）27例，（+++）27例，总表达阳性率为71.67%（86/120），在癌旁组织中表达呈（-）85例，（+）32例，（++）2例，（+++）1例，总表达阳性率为29.17%（35/120）。肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的总表达阳性率均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P < 0.050）。
图1
示PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织和癌旁组织中表达的SP免疫组织化学染色结果，上图为100倍，下图为400倍。1A：PKM2蛋白在癌旁组织中呈（-）表达；1B：PKM2蛋白在肝癌组织中呈（+++）表达；1C：YAP蛋白在癌旁组织中呈（-）表达；1D：YAP蛋白在肝癌组织中呈（+++）表达
2.1.2 肝癌组织中PKM2蛋白表达与YAP蛋白表达的相关性
肝癌组织中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表达呈正相关（r=0.519，P < 0.001），见表 1。提示在肝癌组织中，PKM2蛋白和YAP蛋白可能存在协同作用，共同促进肝癌的发生发展。
表1
肝癌组织中PKM2蛋白表达与YAP蛋白表达的相关性
2.1.3 肝癌组织中PKM2和YAP蛋白表达与患者临床病理学特征的关系
肝癌组织中PKM2蛋白的表达与性别、年龄及合并肝炎均无关（P > 0.050），而与肿瘤直径、TNM分期、肿瘤分化程度及AFP水平相关（P < 0.050），肿瘤直径 > 5 cm、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、肿瘤分化程度为低分化、AFP水平 > 200 ng/mL肝癌患者的PKM2蛋白的表达阳性率较高。肝癌组织中YAP蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期及合并肝炎均无关（P > 0.050），而与肿瘤分化程度和AFP水平有关（P < 0.050），AFP水平 > 200 ng/mL、分化程度为低分化肝癌患者的YAP蛋白的表达阳性率较高。见表 2。
表2
肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白表达与患者临床病理学特征的关系（例）
2.2 Western blot结果
Western blot结果显示，50例肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达水平分别为1.25±0.11和1.08±0.10，癌旁组织分别为0.38±0.01和0.41±0.02。肝癌组织中PKM2蛋白和YAP蛋白的表达水平均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P < 0.050），见图 2。
图2
示PKM2和YAP蛋白在肝癌组织和癌旁组织中表达的电泳结果（部分代表性蛋白条带图）。N：癌旁组织；T：肝癌组织；1-7：病例编号
2.3 实时荧光定量PCR结果
实时荧光定量PCR结果表明，以癌旁组织作为基准（即为1），肝癌组织中PKM2 mRNA和YAP mRNA的表达水平分别为11.38±0.35和19.96±0.48，肝癌组织中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相对表达水平均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P < 0.050），见图 3。
图3
示肝癌组织和癌旁组织中PKM2 mRNA和YAP mRNA的相对表达水平（以癌旁组织作为基准）
3 讨论
肿瘤细胞即使在有氧条件下，也经由糖酵解转化大量葡萄糖而生成乳酸，这一现象被称为Warburg效应[16-17]，是肿瘤细胞的基本特征之一。在糖酵解过程中有多种酶发挥重要的作用，其中PKM2蛋白值得我们关注。PKM2蛋白是丙酮酸激酶（PK）的同工酶，PK在代谢过程中的主要功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸产生丙酮酸。而PKM2蛋白除了通过核转录调节和活性调节两个方面调控肿瘤细胞的能量代谢过程外，还参与到了多种信号通路的转录调控活动中[18]。PKM2蛋白的表达既可以被缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）和C-MYC基因调控[19-20]，也可以在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路过度活化后表达上调，引起Warburg效应的增强[21]。鉴于PKM2蛋白在维系肿瘤细胞能量和合成原料供应平衡中发挥的重要作用及其与信号通路之间的调控关系，其已成为肿瘤诊断和治疗领域的研究热点。
越来越多的研究[22-24]表明，YAP蛋白是致癌蛋白，其与多种肿瘤的发生发展密切相关。YAP蛋白在细胞核内的聚集以及表达上调是引起细胞过度增殖、乃至癌变的重要因素。近几年的研究[25-27]表明，YAP蛋白在肿瘤细胞能量代谢改变的过程中同样发挥着重要作用。DeRan等[25]发现，细胞内能量水平是YAP基因上游的调节因子，细胞能量应激状态的出现，如葡萄糖代谢的抑制和ATP产生减少，均能抑制YAP基因的活性，进而影响肿瘤细胞的增殖。Wang等[26]在对肝癌和结肠癌组织的免疫组织化学研究中发现，YAP蛋白与葡萄糖转运蛋白3（glucose transporter 3，GLUT3）都处于高表达状态，且相关性分析表明二者表达呈正相关；进一步开展细胞水平上的研究表明，YAP蛋白通过直接上调GLUT3蛋白的表达来促进肿瘤细胞的葡萄糖摄取和有氧糖酵解过程。Enzo等[27]的研究表明，在肿瘤细胞中，有氧糖酵解除了发挥自身的生化作用外，还可以参与调控YAP蛋白的表达，进一步促进肿瘤细胞的增殖和侵袭；此外，磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1）--糖酵解过程中的第一个关键酶，通过与YAP/TEAD转录因子复合体相互作用，直接参与对YAP基因的表达调控。那么，糖酵解过程中的另一重要关键酶--PKM2，其与YAP之间存在怎样的关系值得我们进一步研究。因此明确PKM2蛋白与YAP蛋白在肝癌组织中的表达及相关性，对肝癌的发生、发展、早期诊断和治疗研究均具有潜在的意义。
在本研究中，笔者首先利用免疫组织化学染色SP方法，研究了PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况。结果显示，PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织中的表达阳性率均高于癌旁组织（P < 0.050），YAP蛋白在肝癌组织中主要在细胞核内表达，PKM2蛋白则主要在肝癌组织的细胞浆内表达；且二者之间的相关性分析结果表明，在肝癌组织中，PKM2蛋白和YAP蛋白的表达呈正相关关系（r=0.519，P < 0.001）。该结果提示，PKM2蛋白与YAP蛋白的表达与肝癌的发生密切相关，二者可能具有协同作用。接下来，笔者通过分析PKM2蛋白和YAP蛋白与患者临床病理学特征的关系后发现，PKM2蛋白和YAP蛋白的表达均与肝癌的分化程度以及AFP水平相关，阳性表达PKM2蛋白和YAP蛋白的患者往往伴随着肿瘤分化程度的降低以及AFP水平的升高。为了进一步明确PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌组织中的表达关系，笔者在免疫组织化学染色结果的基础上，利用Western blot与实时荧光定量PCR方法对50例新鲜冰冻肝癌组织及其癌旁组织标本进行蛋白水平和mRNA水平的检测，结果western blot与实时荧光定量PCR的结果与免疫组织化学染色结果一致，即在蛋白和mRNA两个水平，PKM2和YAP在肝癌组织中的表达都高于癌旁组织（P < 0.050）。以上结果表明，肝癌的发生发展与PKM2蛋白和YAP蛋白的表达密切相关，但是二者之间的确切调控关系还需细胞水平的实验验证。深入探索PKM2蛋白和YAP蛋白在肝癌中的调控机理，有望为肝癌的临床治疗提供潜在的靶点支持。
