引用本文： 于鹏飞, 顾国利, 魏学明, 李明, 顾晋. hMLH1、hMSH2、hMSH6在散发性结直肠癌中的表达状态与其临床病理特征的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(5): 581-585. doi: 10.7507/1007-9424.20150153 复制
错配修复基因的种系突变及其所导致的微卫星不稳定在林奇综合征发生中的作用已被人们所认知[1]。有研究[2]显示，错配修复基因的突变缺失也参与了散发性结直肠癌（sporadic colorectal carcinoma，SCRC）的发生、发展。但错配修复基因蛋白在SCRC中的具体表达状态及其与SCRC患者临床病理参数之间的关系目前尚未明确，对此进行研究将有助于增加对结直肠癌的生物学行为及发病机制的认识。本研究采用免疫组织化学方法研究SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表达缺失状态及其与SCRC患者临床病理参数之间的关系，旨在探讨错配修复基因蛋白表达缺失在SCRC肿瘤发生、发展中的作用，这有助于为SCRC患者制定个体化的化疗方案和预后判断提供一个客观的参考指标。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取空军总医院普通外科和北京大学肿瘤医院结直肠外科2008年3月至2012年3月期间收治的SCRC患者263例，其中男143例，女120例；年龄（62.7±11.2）岁（35～86岁）；肿瘤部位：右半结肠75例，左半结肠90例，直肠98例；组织分化程度：高分化腺癌20例，中分化腺癌165例，低分化及黏液性腺癌78例；淋巴结转移：阳性149例，阴性114例；肿瘤浸润深度：浆膜层48例、肌层及黏膜下层215例。所有病例均经组织学证实且术前均未接受过放化疗。取其手术切除且经甲醛液固定和石蜡包埋的肿瘤组织标本进行研究。
1.2 免疫组织化学方法检测SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表达
1.2.1 主要材料
即用型hMLH1鼠抗人单克隆抗体（ZM-0154）、即用型hMSH2鼠抗人单克隆抗体（ZM-0156）、即用型hMSH6鼠抗人单克隆抗体（ZM-0387）均购自北京中杉金桥生物公司。试验由LAB vision Autostainer 360自动染色仪系统（福建迈新公司）程控完成、镜下图像以Olympus Dp70图像采集分析仪进行采集、分析。
1.2.2 免疫组织化学方法
严格按产品说明书进行操作。切片常规脱蜡至水，hMLH1、hMSH2、hMSH6经1 mmol/L pH 8.0的EDTA抗原修复液高压热修复。30 mL/L H2O2孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，滴加正常兔血清工作液，孵育10 min后倾去，不洗；滴加一抗37℃孵育2 h，PBS冲洗3 min×3次；滴加二抗，孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加三抗，孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。PBS代替一抗作阴性对照，正常大肠黏膜上皮表达情况作阳性对照。在200倍视野下随机选取10个视野，计数每个视野中正常黏膜或肿瘤细胞的染色情况，取平均值。
1.2.3 结果判断标准
hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达阳性均定位于细胞核。依据染色强度和阳性细胞率来计算评分[3-5]。染色强度：0分为阴性，1分为弱阳性（±），2分为阳性（+），3分为强阳性（++）。阳性细胞率：< 1%为0分、1%～25%为1分、25%～50%为2分、50%～75%为3分、≥75%为4分。以染色强度与阳性细胞率得分之和计算评分：0～2分为阴性（-）、3～5分为阳性（+）、6～7分为强阳性（++）。评分过程由两名高年资病理科医生双盲法独立完成。
1.3 统计学方法
应用SPSS 21.0统计软件包进行统计分析。计数资料采用两个（或多个）样本率比较的χ2检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达情况
免疫组织化学染色结果显示，hMLH1、hMSH2、hMSH6均定位于肿瘤细胞核，镜下可见细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒，细胞质可轻染，细胞膜和间质不染色（图 1）。263例SCRC患者的肿瘤组织中hMLH1蛋白表达缺失率为13.3%（35/263），hMSH2蛋白表达缺失率为12.2%（32/263），hMSH6蛋白表达缺失率为28.9%（76/263），hMLH1/hMSH2表达共同缺失率为3.4%（9/263），hMLH1/hMSH6表达共同缺失率为10.2%（27/263），hMSH2/hMSH6表达共同缺失率为6.8%（18/263），hMLH1/hMSH2/hMSH6表达共同缺失率为3.4%（9/263）。hMSH6蛋白表达缺失率明显高于hMLH1和hMSH2，差异有统计学意义（P < 0.05）。
图1
SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达（免疫组织化学 ×200）。1A：hMLH1核表达；1B：hMSH2核表达；1C：hMSH6核表达
2.2 hMLH1、hMSH2、hMSH6表达缺失与SCRC患者临床病理参数之间的关系
①hMLH1表达缺失率与SCRC患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、有无脉管癌栓、有无淋巴结转移均无关（P > 0.05）；而仅与肿瘤分化程度有关（P < 0.05），即随着分化程度增高，hMLH1表达缺失率增高。②hMSH2表达缺失率与SCRC患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓、有无淋巴结转移均无关（P > 0.05）；而仅与肿瘤大小有关（P < 0.05），即随着肿瘤直径增大，hMSH2表达缺失率增高。③hMSH6表达缺失率与SCRC患者年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓均无关（P > 0.05）；而与患者性别、有无淋巴结转移有关（P < 0.05），即在男性患者中的hMSH6表达缺失率明显高于女性患者，在较少淋巴结转移组的hMSH6表达缺失率明显高于较多淋巴结转移组。见表 1。
表1
hMLH1、hMSH2、hMSH6表达缺失与SCRC患者临床病理参数间的关系〔例（%）〕
2.3 hMLH1、hMSH2、hMSH6三者之间表达的相关性分析结果
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC肿瘤组织中表达的相关性结果见表 2，按照配对资料四格表计算可知：hMLH1与hMSH2的表达无明显相关性（rs=0.073，P=0.253），hMLH1与hMSH6表达呈正相关（rs=0.446，P=0.000），hMSH2与hMSH6表达亦呈正相关（rs=0.373，P=0.013）。
表2
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC中表达的相关性分析结果
3 讨论
明确疾病发生、发展的生物学规律是疾病治疗能够得以突破的关键。目前，人们尚未彻底掌握结直肠癌发生、发展、侵袭、转移等生物学行为的具体机制。研究[6-8]证实，错配修复基因的种系突变及其所导致的微卫星不稳定是引起林奇综合征发病的遗传学病因。错配修复基因突变导致其蛋白表达产物产生缺陷而失去错配修复功能，从而导致微卫星不稳定或DNA复制错误，进而增加细胞基因组的不稳定，引起细胞增殖及异常分化增加，最终导致多种肿瘤的发生。错配修复基因突变表现为其所指导合成的蛋白产物的表达障碍，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达作为林奇综合征诊断的依据已被公认。因此本研究通过免疫组织化学方法检测hMLH1、hMSH2、hMSH6这三个最主要的错配修复基因蛋白的表达情况来间接判断SCRC肿瘤组织中错配修复基因的突变情况具有较高的可信度和准确度。
虽然错配修复基因蛋白在SCRC中的表达缺失率（27.2%）明显低于林奇综合征（46.7%～76.7%）[9-10]，但单独一种错配修复基因蛋白在SCRC中的表达缺失并不少见。本研究中hMLH1和hMSH2蛋白的表达缺失率大致相当（13.3%比12.2%），而hMSH6表达缺失（28.9%）比hMLH1、hMSH2缺失更常见，在SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表达情况与SCRC患者的年龄、肿瘤部位、肿瘤分化、侵袭转移情况均明显有别于林奇综合征的生物学行为[11-13]。这说明以hMLH1、hMSH2、hMSH6为代表的错配修复基因蛋白在SCRC肿瘤发生、发展中的作用与其在林奇综合征中的作用是不同，错配修复基因的突变缺失并非SCRC发病的主要因素。
本研究发现，hMLH1、hMSH2、hMSH6表达缺失率与SCRC临床病理参数的关系明显不同于林奇综合征[14-15]，甚至有些结果截然相反。如：高分化的SCRC反而具有较高的hMLH1表达缺失率、淋巴结转移较少的SCRC反而具有较高的hMSH6表达缺失率。分析原因为：①低分化的癌细胞增殖分裂加快，基因发生错配的概率增加，对错配修复基因系统的反馈增强，从而使错配修复基因表达增强，导致hMLH1蛋白高表达。②免疫组织化学方法检测到表达的hMLH1蛋白有可能是已发生突变、无错配修复功能的蛋白[16]。因此，只有对SCRC肿瘤组织进行错配修复基因蛋白联合检测才有助于避免单独单一错配修复基因蛋白检测可能带来的评判误差。
本研究结果发现，hMSH2蛋白随着SCRC肿瘤体积的增大而表达缺失率增高（P < 0.01），结果提示，hMSH2的表达可能参与了SCRC肿瘤的进展过程。另外，本研究还发现，hMLH1、hMSH2蛋白表达缺失率与SCRC患者的年龄、性别、肿瘤部位、浸润深度和淋巴结转移均无关，结果提示，SCRC肿瘤发生的初始阶段可能已经发生hMLH1、hMSH2基因突变，且持续存在和作用于SCRC肿瘤的发展[17-19]。
有研究[20-23]显示，hMSH6蛋白可单独或通过与hMSH2蛋白形成异二聚体的形式来发挥DNA错配修复作用，hMSH6单独突变仅能导致错配修复基因功能的部分缺失，而hMSH2的错义突变却可导致hMSH2/hMSH6依赖的错配修复基因的失活。本研究结果显示，hMSH6表达缺失率（28.9%）明显高于hMLH1（13.3%）和hMSH2（12.2%），差异有统计学意义（P < 0.05），且在男性SCRC患者中的表达缺失明显高于女性患者（P < 0.01），这与文献[24-26]报道一致。虽然性别与hMSH6突变之间的关联机制尚需进一步证实和探讨，但是本研究结果提示，男性SCRC患者更应该进行hMSH6基因突变的筛检。
综上所述，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白在SCRC中的表达缺失并不少见，且其表达缺失与SCRC患者临床病理参数的关系也明显不同于林奇综合征。因此，以hMLH1、hMSH2、hMSH6为代表的错配修复基因蛋白在SCRC发生、发展中的作用可能也有别于林奇综合征。对SCRC肿瘤组织进行hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达状态的检测有助于为SCRC患者制定个体化的化疗方案和预后判断提供一个客观的参考指标。
错配修复基因的种系突变及其所导致的微卫星不稳定在林奇综合征发生中的作用已被人们所认知[1]。有研究[2]显示，错配修复基因的突变缺失也参与了散发性结直肠癌（sporadic colorectal carcinoma，SCRC）的发生、发展。但错配修复基因蛋白在SCRC中的具体表达状态及其与SCRC患者临床病理参数之间的关系目前尚未明确，对此进行研究将有助于增加对结直肠癌的生物学行为及发病机制的认识。本研究采用免疫组织化学方法研究SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表达缺失状态及其与SCRC患者临床病理参数之间的关系，旨在探讨错配修复基因蛋白表达缺失在SCRC肿瘤发生、发展中的作用，这有助于为SCRC患者制定个体化的化疗方案和预后判断提供一个客观的参考指标。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取空军总医院普通外科和北京大学肿瘤医院结直肠外科2008年3月至2012年3月期间收治的SCRC患者263例，其中男143例，女120例；年龄（62.7±11.2）岁（35～86岁）；肿瘤部位：右半结肠75例，左半结肠90例，直肠98例；组织分化程度：高分化腺癌20例，中分化腺癌165例，低分化及黏液性腺癌78例；淋巴结转移：阳性149例，阴性114例；肿瘤浸润深度：浆膜层48例、肌层及黏膜下层215例。所有病例均经组织学证实且术前均未接受过放化疗。取其手术切除且经甲醛液固定和石蜡包埋的肿瘤组织标本进行研究。
1.2 免疫组织化学方法检测SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表达
1.2.1 主要材料
即用型hMLH1鼠抗人单克隆抗体（ZM-0154）、即用型hMSH2鼠抗人单克隆抗体（ZM-0156）、即用型hMSH6鼠抗人单克隆抗体（ZM-0387）均购自北京中杉金桥生物公司。试验由LAB vision Autostainer 360自动染色仪系统（福建迈新公司）程控完成、镜下图像以Olympus Dp70图像采集分析仪进行采集、分析。
1.2.2 免疫组织化学方法
严格按产品说明书进行操作。切片常规脱蜡至水，hMLH1、hMSH2、hMSH6经1 mmol/L pH 8.0的EDTA抗原修复液高压热修复。30 mL/L H2O2孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，滴加正常兔血清工作液，孵育10 min后倾去，不洗；滴加一抗37℃孵育2 h，PBS冲洗3 min×3次；滴加二抗，孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次；滴加三抗，孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。PBS代替一抗作阴性对照，正常大肠黏膜上皮表达情况作阳性对照。在200倍视野下随机选取10个视野，计数每个视野中正常黏膜或肿瘤细胞的染色情况，取平均值。
1.2.3 结果判断标准
hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达阳性均定位于细胞核。依据染色强度和阳性细胞率来计算评分[3-5]。染色强度：0分为阴性，1分为弱阳性（±），2分为阳性（+），3分为强阳性（++）。阳性细胞率：< 1%为0分、1%～25%为1分、25%～50%为2分、50%～75%为3分、≥75%为4分。以染色强度与阳性细胞率得分之和计算评分：0～2分为阴性（-）、3～5分为阳性（+）、6～7分为强阳性（++）。评分过程由两名高年资病理科医生双盲法独立完成。
1.3 统计学方法
应用SPSS 21.0统计软件包进行统计分析。计数资料采用两个（或多个）样本率比较的χ2检验；相关性分析采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达情况
免疫组织化学染色结果显示，hMLH1、hMSH2、hMSH6均定位于肿瘤细胞核，镜下可见细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒，细胞质可轻染，细胞膜和间质不染色（图 1）。263例SCRC患者的肿瘤组织中hMLH1蛋白表达缺失率为13.3%（35/263），hMSH2蛋白表达缺失率为12.2%（32/263），hMSH6蛋白表达缺失率为28.9%（76/263），hMLH1/hMSH2表达共同缺失率为3.4%（9/263），hMLH1/hMSH6表达共同缺失率为10.2%（27/263），hMSH2/hMSH6表达共同缺失率为6.8%（18/263），hMLH1/hMSH2/hMSH6表达共同缺失率为3.4%（9/263）。hMSH6蛋白表达缺失率明显高于hMLH1和hMSH2，差异有统计学意义（P < 0.05）。
图1
SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达（免疫组织化学 ×200）。1A：hMLH1核表达；1B：hMSH2核表达；1C：hMSH6核表达
2.2 hMLH1、hMSH2、hMSH6表达缺失与SCRC患者临床病理参数之间的关系
①hMLH1表达缺失率与SCRC患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、有无脉管癌栓、有无淋巴结转移均无关（P > 0.05）；而仅与肿瘤分化程度有关（P < 0.05），即随着分化程度增高，hMLH1表达缺失率增高。②hMSH2表达缺失率与SCRC患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓、有无淋巴结转移均无关（P > 0.05）；而仅与肿瘤大小有关（P < 0.05），即随着肿瘤直径增大，hMSH2表达缺失率增高。③hMSH6表达缺失率与SCRC患者年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓均无关（P > 0.05）；而与患者性别、有无淋巴结转移有关（P < 0.05），即在男性患者中的hMSH6表达缺失率明显高于女性患者，在较少淋巴结转移组的hMSH6表达缺失率明显高于较多淋巴结转移组。见表 1。
表1
hMLH1、hMSH2、hMSH6表达缺失与SCRC患者临床病理参数间的关系〔例（%）〕
2.3 hMLH1、hMSH2、hMSH6三者之间表达的相关性分析结果
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC肿瘤组织中表达的相关性结果见表 2，按照配对资料四格表计算可知：hMLH1与hMSH2的表达无明显相关性（rs=0.073，P=0.253），hMLH1与hMSH6表达呈正相关（rs=0.446，P=0.000），hMSH2与hMSH6表达亦呈正相关（rs=0.373，P=0.013）。
表2
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC中表达的相关性分析结果
3 讨论
明确疾病发生、发展的生物学规律是疾病治疗能够得以突破的关键。目前，人们尚未彻底掌握结直肠癌发生、发展、侵袭、转移等生物学行为的具体机制。研究[6-8]证实，错配修复基因的种系突变及其所导致的微卫星不稳定是引起林奇综合征发病的遗传学病因。错配修复基因突变导致其蛋白表达产物产生缺陷而失去错配修复功能，从而导致微卫星不稳定或DNA复制错误，进而增加细胞基因组的不稳定，引起细胞增殖及异常分化增加，最终导致多种肿瘤的发生。错配修复基因突变表现为其所指导合成的蛋白产物的表达障碍，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达作为林奇综合征诊断的依据已被公认。因此本研究通过免疫组织化学方法检测hMLH1、hMSH2、hMSH6这三个最主要的错配修复基因蛋白的表达情况来间接判断SCRC肿瘤组织中错配修复基因的突变情况具有较高的可信度和准确度。
虽然错配修复基因蛋白在SCRC中的表达缺失率（27.2%）明显低于林奇综合征（46.7%～76.7%）[9-10]，但单独一种错配修复基因蛋白在SCRC中的表达缺失并不少见。本研究中hMLH1和hMSH2蛋白的表达缺失率大致相当（13.3%比12.2%），而hMSH6表达缺失（28.9%）比hMLH1、hMSH2缺失更常见，在SCRC肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表达情况与SCRC患者的年龄、肿瘤部位、肿瘤分化、侵袭转移情况均明显有别于林奇综合征的生物学行为[11-13]。这说明以hMLH1、hMSH2、hMSH6为代表的错配修复基因蛋白在SCRC肿瘤发生、发展中的作用与其在林奇综合征中的作用是不同，错配修复基因的突变缺失并非SCRC发病的主要因素。
本研究发现，hMLH1、hMSH2、hMSH6表达缺失率与SCRC临床病理参数的关系明显不同于林奇综合征[14-15]，甚至有些结果截然相反。如：高分化的SCRC反而具有较高的hMLH1表达缺失率、淋巴结转移较少的SCRC反而具有较高的hMSH6表达缺失率。分析原因为：①低分化的癌细胞增殖分裂加快，基因发生错配的概率增加，对错配修复基因系统的反馈增强，从而使错配修复基因表达增强，导致hMLH1蛋白高表达。②免疫组织化学方法检测到表达的hMLH1蛋白有可能是已发生突变、无错配修复功能的蛋白[16]。因此，只有对SCRC肿瘤组织进行错配修复基因蛋白联合检测才有助于避免单独单一错配修复基因蛋白检测可能带来的评判误差。
本研究结果发现，hMSH2蛋白随着SCRC肿瘤体积的增大而表达缺失率增高（P < 0.01），结果提示，hMSH2的表达可能参与了SCRC肿瘤的进展过程。另外，本研究还发现，hMLH1、hMSH2蛋白表达缺失率与SCRC患者的年龄、性别、肿瘤部位、浸润深度和淋巴结转移均无关，结果提示，SCRC肿瘤发生的初始阶段可能已经发生hMLH1、hMSH2基因突变，且持续存在和作用于SCRC肿瘤的发展[17-19]。
有研究[20-23]显示，hMSH6蛋白可单独或通过与hMSH2蛋白形成异二聚体的形式来发挥DNA错配修复作用，hMSH6单独突变仅能导致错配修复基因功能的部分缺失，而hMSH2的错义突变却可导致hMSH2/hMSH6依赖的错配修复基因的失活。本研究结果显示，hMSH6表达缺失率（28.9%）明显高于hMLH1（13.3%）和hMSH2（12.2%），差异有统计学意义（P < 0.05），且在男性SCRC患者中的表达缺失明显高于女性患者（P < 0.01），这与文献[24-26]报道一致。虽然性别与hMSH6突变之间的关联机制尚需进一步证实和探讨，但是本研究结果提示，男性SCRC患者更应该进行hMSH6基因突变的筛检。
综上所述，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白在SCRC中的表达缺失并不少见，且其表达缺失与SCRC患者临床病理参数的关系也明显不同于林奇综合征。因此，以hMLH1、hMSH2、hMSH6为代表的错配修复基因蛋白在SCRC发生、发展中的作用可能也有别于林奇综合征。对SCRC肿瘤组织进行hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达状态的检测有助于为SCRC患者制定个体化的化疗方案和预后判断提供一个客观的参考指标。
