引用本文： 阿迪娜·贾库林, 迪丽米娜·伊拉木, 郭丽英. Cyclin D1在不同分子亚型乳腺癌中的表达及其对预后的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(2): 187-191. doi: 10.7507/1007-9424.20140043 复制
肿瘤的发生、发展和转移是一个多基因改变参与的渐进过程，其内在机制表现为基因的异常激活、过度表达、缺失或突变失活等导致细胞增殖失控而恶性转化。目前研究[1]表明，细胞增殖失控的主要因素之一为细胞周期调控的失调，而细胞周期蛋白（cyclins）则为重要的调节因子。cyclin D1是细胞周期蛋白家族中的一员，是新近发现并提出的原癌基因，定位于11q13，编码295个氨基酸相对分子质量为34×103的蛋白质，其持续高表达能够使细胞周期G1期缩短，体积变小，对分裂原的依赖性减弱，并提前进入S期，从而引起细胞生长失控、转化和癌变。本研究采用免疫组织化学方法检测cyclin D1在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达，并分析其与乳腺癌临床指标及预后的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2002年1月至2012年12月期间在新疆医科大学第一附属医院乳腺外科手术治疗的女性乳腺癌患者共226例，年龄24～87岁，中位年龄48.4岁。选择其中临床分期为0～Ⅱ期浸润性非特殊癌（乳腺浸润性导管癌）、根治或改良根治术后、首诊无远处转移、经病理证实、临床资料完整并且检测了cyclin D1与临床分子亚型的患者175例，其中Luminal A型72例，Luminal B型54例，Her-2过表达型27例，Basal like型22例。
1.2 方法
Cyclin D1抗体及工作液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。一抗为浓缩人/兔型cyclin D1多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记聚合物（抗兔/鼠）。应用免疫组织化学EnVision二步法检测上述各指标，具体步骤如下：①甲醛固定石蜡包埋组织3μm切片，贴于载玻片上，70℃烤箱过夜。②将石蜡切片浸于二甲苯中20 min。取出后置于100%无水乙醇1 min后置入新配的3%过氧化氢溶液10 min，依次置入90%、80%、70%乙醇中各3 min后蒸馏水冲洗。③置于乙二氨四乙酸二钠修复液中煮沸20 min，室温下自然冷却后磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。④将配制好的一抗滴加在切片上，放入37℃恒温箱中避光孵育1 h。⑤孵育完用PBS冲洗。⑥滴加二抗，放入37℃恒温箱中避光孵育30 min，阴性对照以PBS代替二抗进行滴加。⑦孵育完用PBS冲洗。⑧滴加DAB显色剂，静置5 min左右，光镜下控制显色，将显色后的切片置入蒸馏水终止显色。⑨将切片浸泡于苏木素染色后浸泡于盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗后浸泡于热水中返蓝。⑩置入75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇各3 min脱水。晾干，封片。
1.3 结果判定标准
细胞核内呈现棕黄色颗粒为cyclin D1阳性，无棕黄色颗粒为阴性。免疫染色评分根据染色强度和阳性细胞数来评价[2]。阳性细胞数评分：光镜下随机观察染色清晰的任意10个高倍镜（×400）视野，共计数1 000个乳腺癌细胞中阳性细胞的百分比，无阳性细胞为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分；染色强度评分：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每例标本最后得分为阳性细胞数计分×染色强度计分之积，0分为（－），1分为（+），2～3分为（++），＞3分为（+++）。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，应用Pearson卡方检验分析cyclin D1在不同分子亚型乳腺癌中的表达；采用Spearman秩相关方法分析cyclin D1的表达与ER、PR、Her-2、肿块大小、临床分期、组织学分级和淋巴结转移数目之间的相关性；运用Kaplan-Meier生存曲线对cyclin D1不同表达程度对预后的影响进行分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Cyclin D1蛋白在4种不同分子亚型乳腺癌组织中的表达情况
免疫组织化法检测结果见图 1。cyclin D1在总乳腺癌标本中的表达阳性率为80%（140/175），表达阴性率为20%（35/175）。cyclin D1总表达阳性率在4中不同分子亚型乳腺癌组织中差异有统计学意义（χ2=13.437，P=0.037），Luminal A型乳腺癌组织中的cyclin D1表达总阳性率明显高于其他三个亚型乳腺癌（P < 0.05），Luminal B型乳腺癌组织中的cyclin D1表达阴性率明显高于其他三个亚型乳腺癌（P < 0.05）。
图1
Cyclin D1在乳腺癌组织中不同程度的表达（EnVision× 400）。1A：Cyclin D1（－）；1B：Cyclin D1（+）；1C：Cyclin D1（++）；1D：Cyclin D1（+++）
Figure1.
Different expressions of cyclin D1 in breast cancer tissue (EnVision× 400). 1A:Cyclin D1 (－); 1B:Cyclin D1 (+); 1C: Cyclin D1(++); 1D:Cyclin D1 (+++)
2.2 Cyclin D1蛋白表达与乳腺癌临床指标的相关性
乳腺癌临床指标的相关性分析结果见表 2。Cyclin D1的表达与组织学分级、临床分期和PR无关（P > 0.05），与淋巴结转移数目呈正相关（rs=0.197，P < 0.01），与Her-2呈负相关（rs=-0.131，P < 0.05），与ER阳性表达呈正相关（rs=0.139，P < 0.05）；Her-2阳性表达与ER阳性表达呈负相关（rs=-0.131，P < 0.05）。
表1
Cyclin D1蛋白在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达〔例（%）〕
Table1.
Expressions of cyclin D1 in different molecular subtypes of breast cancer〔case(%)〕
表2
各临床指标的相关性分析结果
Table2.
Results of correlation analysis of clinical pathology parameters
2.3 Cyclin D1的不同表达对于乳腺癌患者预后的影响
术后随访10年，随访截至2012年12月31日，删失患者21例（随访期间死于其他原因、失访者，均计为删失数据）。根据cyclin D1不同表达分为cyclin D1（－）、cyclin D1（+～++）及cyclin D1（+++）3组，对无瘤生存时间进行生存分析，三者差异具有统计学意义（P=0.043），生存曲线见图 1。
图2
Cyclin D1不同表达对预后影响的生存曲线
Figure2.
Survival curves of impact of cyclin D1 different expression on prognosis
3 讨论
Cyclin D1是Wnt信号通路中重要的靶基因，当Wnt信号通路被激活，将导致β-catenin在细胞浆中聚集并形成复合物[3]，从而激活cyclin D1基因转录[4]。Cyclin D1是一种细胞周期蛋白。有研究[5]表明，乳腺癌的发生、发展与细胞周期G1期的调控异常有关，当cyclin D1过度表达时，可使细胞G1期缩短，促进细胞周期的进展导致细胞过度增殖，从而发生癌变。师杰等[6]、疏楠等[7]在研究中发现，cyclin D1蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，分别为93.33%、68.8%，本研究中cyclin D1蛋白在乳腺癌组织中也呈高表达（80%）。
罗洁等[8]、Zwijsen等[9]的研究认为，cyclin D1可能是ER的独立激活因子，ERα介导的ER通路激活后通过β-catenin的活化，进一步激活了Wnt通路，使cyclin D1表达增高。本研究结果提示，cyclin D1阳性表达与乳腺癌组织中ER阳性表达呈明显正相关（rs=0.139，P < 0.05）。越来越多证据[10-11]表明，乳腺癌ER可诱导cyclin D1过表达，cyclin D1过表达的乳腺癌更倾向于ER阳性，组织分化程度高。Sutherland等[12]研究组通过对乳腺癌细胞株的研究结果显示，当雌激素依赖性乳腺细胞株撤离了雌激素的供给后会导致cyclin D1和CDK4表达水平的下降及抑癌基因p27表达水平的升高，细胞受阻于G1期；重新给予雌激素后，cyclin D1 mRNA及蛋白表达增加，细胞能顺利通过细胞周期。因此，在一定程度上证实了cyclin D1水平依赖于雌激素和ER的存在。
Her-2表达与cyclin D1表达之间的关系尚不明确。有研究[13]结果提示，在淋巴结阳性肿瘤中Her-2过表达可以诱导β-catenin在胞浆中的聚集而激活Wnt信号通路；但也有研究[14]提示，当ER阴性表达、Her-2基因扩增沉默时，β-catenin在胞浆中的聚集明显，Wnt信号通路被激活；另有夏红强等[15]研究提示ER和Her-2信号传导通路上存在某些关联，ER在雌激素作用下可抑制Her-2表达，当ER表达降低时，Her-2表达增强。本研究结果提示Her-2表达与cyclin D1（rs=-0.131，P < 0.05）及ER表达呈负相关（rs=-0.131，P < 0.05），考虑可能与Her-2过表达时ER表达下降导致依赖于雌激素及ER的cyclin D1表达水平下降有关，也有可能与Her-2基因无扩增时Wnt信号通路被激活相关。本研究结果提示cyclin D1表达与腋窝淋巴结转移数目呈正相关，与何艳蛟等[16]研究结论相同，即当cyclin D1的表达程度越高时，淋巴结转移数目也越多。
近年来的临床研究将乳腺癌分为Luminal A型（ER+，PR+，Her-2-）、Luminal B型（ER+，PR+，Her-2+）、Her-2过表达型（ER-，PR-，Her-2+）及Basal like型（ER-，PR-，Her-2-）四个亚型。我们比较cyclin D1在各亚型中表达发现，在cyclin D1的表达阳性率在Luminal A型最高，而cyclin D1的表达阴性率在Luminal B型中最高。文献证实，Luminal A型ER表达水平及表达强度较高[17]，是乳腺癌预后最好的分子亚型[18]，Luminal B型中ER虽阳性表达，但表达强度相对较低，内分泌治疗敏感性不及Luminal A型[19]，且Her-2呈过度表达，故考虑为Luminal A型中受ER诱导的cyclin D1表达较高，而Luminal B型中则相对明显下降，而Her-2过表达型及Basal like型在乳腺癌中所占比例不高，故未见明显差异。有文献[13, 20-21]提示，Wnt信号通路的激活可能是肿瘤发生的早期事件，故cyclin D1在分子亚型中的表达差异可能与不同亚型肿瘤分期及恶性程度有关，有待进一步分析。
Hwang等[22]认为，cyclin D1过表达的乳腺癌预后良好，可用于识别预后良好的乳腺癌患者。陈晓曦等[23]研究发现，cyclin D1阳性表达肿瘤有较好的激素敏感性，与良好预后有关。Gillett等[24]和Pelosio等[25]研究345例乳腺癌患者发现，cyclin D1蛋白阴性表达患者预后不良，可能的解释为cyclin D1蛋白阴性表达患者可能存在其他基因的突变，这种突变对乳腺癌患者的生存影响更大。本研究采用Kaplan-Meier生存曲线分析cyclin D1的不同表达程度对于乳腺癌患者预后的影响，结果显示cyclin D1阳性表达程度越高，乳腺癌患者生存时间越长（P < 0.05）。另外，在本研究中，cylin D1阳性表达与Her-2阳性表达呈负相关，cyclin D1阳性表达与ER阳性表达呈正相关，提示cyclin D1阳性乳腺癌可能对雌激素更为敏感，恶性度相对偏低，由此也可推断，cyclin D1过表达可能提示患者生存期长，预后良好。近年来随着分子生物学研究的深入，ER受体表达状态在预后中的作用也受到各类研究者的关注[26]。
综上所述，cyclin D1在乳腺癌组织中呈高表达，且与腋窝淋巴结转移数目密切相关，其表达与ER表达呈正相关，与Her-2表达呈负相关，且在cyclin D1过表达组中Luminal A型乳腺癌所占比例较大，cyclin D1阳性表达程度越高，无瘤生存时间越长。上述结果提示cyclin D1表达可能与雌激素敏感乳腺癌的发生及增殖有关，但提示较好的预后，其检测可为乳腺癌评估及预后评价提供必要依据。
肿瘤的发生、发展和转移是一个多基因改变参与的渐进过程，其内在机制表现为基因的异常激活、过度表达、缺失或突变失活等导致细胞增殖失控而恶性转化。目前研究[1]表明，细胞增殖失控的主要因素之一为细胞周期调控的失调，而细胞周期蛋白（cyclins）则为重要的调节因子。cyclin D1是细胞周期蛋白家族中的一员，是新近发现并提出的原癌基因，定位于11q13，编码295个氨基酸相对分子质量为34×103的蛋白质，其持续高表达能够使细胞周期G1期缩短，体积变小，对分裂原的依赖性减弱，并提前进入S期，从而引起细胞生长失控、转化和癌变。本研究采用免疫组织化学方法检测cyclin D1在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达，并分析其与乳腺癌临床指标及预后的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2002年1月至2012年12月期间在新疆医科大学第一附属医院乳腺外科手术治疗的女性乳腺癌患者共226例，年龄24～87岁，中位年龄48.4岁。选择其中临床分期为0～Ⅱ期浸润性非特殊癌（乳腺浸润性导管癌）、根治或改良根治术后、首诊无远处转移、经病理证实、临床资料完整并且检测了cyclin D1与临床分子亚型的患者175例，其中Luminal A型72例，Luminal B型54例，Her-2过表达型27例，Basal like型22例。
1.2 方法
Cyclin D1抗体及工作液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。一抗为浓缩人/兔型cyclin D1多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记聚合物（抗兔/鼠）。应用免疫组织化学EnVision二步法检测上述各指标，具体步骤如下：①甲醛固定石蜡包埋组织3μm切片，贴于载玻片上，70℃烤箱过夜。②将石蜡切片浸于二甲苯中20 min。取出后置于100%无水乙醇1 min后置入新配的3%过氧化氢溶液10 min，依次置入90%、80%、70%乙醇中各3 min后蒸馏水冲洗。③置于乙二氨四乙酸二钠修复液中煮沸20 min，室温下自然冷却后磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。④将配制好的一抗滴加在切片上，放入37℃恒温箱中避光孵育1 h。⑤孵育完用PBS冲洗。⑥滴加二抗，放入37℃恒温箱中避光孵育30 min，阴性对照以PBS代替二抗进行滴加。⑦孵育完用PBS冲洗。⑧滴加DAB显色剂，静置5 min左右，光镜下控制显色，将显色后的切片置入蒸馏水终止显色。⑨将切片浸泡于苏木素染色后浸泡于盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗后浸泡于热水中返蓝。⑩置入75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇各3 min脱水。晾干，封片。
1.3 结果判定标准
细胞核内呈现棕黄色颗粒为cyclin D1阳性，无棕黄色颗粒为阴性。免疫染色评分根据染色强度和阳性细胞数来评价[2]。阳性细胞数评分：光镜下随机观察染色清晰的任意10个高倍镜（×400）视野，共计数1 000个乳腺癌细胞中阳性细胞的百分比，无阳性细胞为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分；染色强度评分：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每例标本最后得分为阳性细胞数计分×染色强度计分之积，0分为（－），1分为（+），2～3分为（++），＞3分为（+++）。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，应用Pearson卡方检验分析cyclin D1在不同分子亚型乳腺癌中的表达；采用Spearman秩相关方法分析cyclin D1的表达与ER、PR、Her-2、肿块大小、临床分期、组织学分级和淋巴结转移数目之间的相关性；运用Kaplan-Meier生存曲线对cyclin D1不同表达程度对预后的影响进行分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Cyclin D1蛋白在4种不同分子亚型乳腺癌组织中的表达情况
免疫组织化法检测结果见图 1。cyclin D1在总乳腺癌标本中的表达阳性率为80%（140/175），表达阴性率为20%（35/175）。cyclin D1总表达阳性率在4中不同分子亚型乳腺癌组织中差异有统计学意义（χ2=13.437，P=0.037），Luminal A型乳腺癌组织中的cyclin D1表达总阳性率明显高于其他三个亚型乳腺癌（P < 0.05），Luminal B型乳腺癌组织中的cyclin D1表达阴性率明显高于其他三个亚型乳腺癌（P < 0.05）。
图1
Cyclin D1在乳腺癌组织中不同程度的表达（EnVision× 400）。1A：Cyclin D1（－）；1B：Cyclin D1（+）；1C：Cyclin D1（++）；1D：Cyclin D1（+++）
Figure1.
Different expressions of cyclin D1 in breast cancer tissue (EnVision× 400). 1A:Cyclin D1 (－); 1B:Cyclin D1 (+); 1C: Cyclin D1(++); 1D:Cyclin D1 (+++)
2.2 Cyclin D1蛋白表达与乳腺癌临床指标的相关性
乳腺癌临床指标的相关性分析结果见表 2。Cyclin D1的表达与组织学分级、临床分期和PR无关（P > 0.05），与淋巴结转移数目呈正相关（rs=0.197，P < 0.01），与Her-2呈负相关（rs=-0.131，P < 0.05），与ER阳性表达呈正相关（rs=0.139，P < 0.05）；Her-2阳性表达与ER阳性表达呈负相关（rs=-0.131，P < 0.05）。
表1
Cyclin D1蛋白在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达〔例（%）〕
Table1.
Expressions of cyclin D1 in different molecular subtypes of breast cancer〔case(%)〕
表2
各临床指标的相关性分析结果
Table2.
Results of correlation analysis of clinical pathology parameters
2.3 Cyclin D1的不同表达对于乳腺癌患者预后的影响
术后随访10年，随访截至2012年12月31日，删失患者21例（随访期间死于其他原因、失访者，均计为删失数据）。根据cyclin D1不同表达分为cyclin D1（－）、cyclin D1（+～++）及cyclin D1（+++）3组，对无瘤生存时间进行生存分析，三者差异具有统计学意义（P=0.043），生存曲线见图 1。
图2
Cyclin D1不同表达对预后影响的生存曲线
Figure2.
Survival curves of impact of cyclin D1 different expression on prognosis
3 讨论
Cyclin D1是Wnt信号通路中重要的靶基因，当Wnt信号通路被激活，将导致β-catenin在细胞浆中聚集并形成复合物[3]，从而激活cyclin D1基因转录[4]。Cyclin D1是一种细胞周期蛋白。有研究[5]表明，乳腺癌的发生、发展与细胞周期G1期的调控异常有关，当cyclin D1过度表达时，可使细胞G1期缩短，促进细胞周期的进展导致细胞过度增殖，从而发生癌变。师杰等[6]、疏楠等[7]在研究中发现，cyclin D1蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，分别为93.33%、68.8%，本研究中cyclin D1蛋白在乳腺癌组织中也呈高表达（80%）。
罗洁等[8]、Zwijsen等[9]的研究认为，cyclin D1可能是ER的独立激活因子，ERα介导的ER通路激活后通过β-catenin的活化，进一步激活了Wnt通路，使cyclin D1表达增高。本研究结果提示，cyclin D1阳性表达与乳腺癌组织中ER阳性表达呈明显正相关（rs=0.139，P < 0.05）。越来越多证据[10-11]表明，乳腺癌ER可诱导cyclin D1过表达，cyclin D1过表达的乳腺癌更倾向于ER阳性，组织分化程度高。Sutherland等[12]研究组通过对乳腺癌细胞株的研究结果显示，当雌激素依赖性乳腺细胞株撤离了雌激素的供给后会导致cyclin D1和CDK4表达水平的下降及抑癌基因p27表达水平的升高，细胞受阻于G1期；重新给予雌激素后，cyclin D1 mRNA及蛋白表达增加，细胞能顺利通过细胞周期。因此，在一定程度上证实了cyclin D1水平依赖于雌激素和ER的存在。
Her-2表达与cyclin D1表达之间的关系尚不明确。有研究[13]结果提示，在淋巴结阳性肿瘤中Her-2过表达可以诱导β-catenin在胞浆中的聚集而激活Wnt信号通路；但也有研究[14]提示，当ER阴性表达、Her-2基因扩增沉默时，β-catenin在胞浆中的聚集明显，Wnt信号通路被激活；另有夏红强等[15]研究提示ER和Her-2信号传导通路上存在某些关联，ER在雌激素作用下可抑制Her-2表达，当ER表达降低时，Her-2表达增强。本研究结果提示Her-2表达与cyclin D1（rs=-0.131，P < 0.05）及ER表达呈负相关（rs=-0.131，P < 0.05），考虑可能与Her-2过表达时ER表达下降导致依赖于雌激素及ER的cyclin D1表达水平下降有关，也有可能与Her-2基因无扩增时Wnt信号通路被激活相关。本研究结果提示cyclin D1表达与腋窝淋巴结转移数目呈正相关，与何艳蛟等[16]研究结论相同，即当cyclin D1的表达程度越高时，淋巴结转移数目也越多。
近年来的临床研究将乳腺癌分为Luminal A型（ER+，PR+，Her-2-）、Luminal B型（ER+，PR+，Her-2+）、Her-2过表达型（ER-，PR-，Her-2+）及Basal like型（ER-，PR-，Her-2-）四个亚型。我们比较cyclin D1在各亚型中表达发现，在cyclin D1的表达阳性率在Luminal A型最高，而cyclin D1的表达阴性率在Luminal B型中最高。文献证实，Luminal A型ER表达水平及表达强度较高[17]，是乳腺癌预后最好的分子亚型[18]，Luminal B型中ER虽阳性表达，但表达强度相对较低，内分泌治疗敏感性不及Luminal A型[19]，且Her-2呈过度表达，故考虑为Luminal A型中受ER诱导的cyclin D1表达较高，而Luminal B型中则相对明显下降，而Her-2过表达型及Basal like型在乳腺癌中所占比例不高，故未见明显差异。有文献[13, 20-21]提示，Wnt信号通路的激活可能是肿瘤发生的早期事件，故cyclin D1在分子亚型中的表达差异可能与不同亚型肿瘤分期及恶性程度有关，有待进一步分析。
Hwang等[22]认为，cyclin D1过表达的乳腺癌预后良好，可用于识别预后良好的乳腺癌患者。陈晓曦等[23]研究发现，cyclin D1阳性表达肿瘤有较好的激素敏感性，与良好预后有关。Gillett等[24]和Pelosio等[25]研究345例乳腺癌患者发现，cyclin D1蛋白阴性表达患者预后不良，可能的解释为cyclin D1蛋白阴性表达患者可能存在其他基因的突变，这种突变对乳腺癌患者的生存影响更大。本研究采用Kaplan-Meier生存曲线分析cyclin D1的不同表达程度对于乳腺癌患者预后的影响，结果显示cyclin D1阳性表达程度越高，乳腺癌患者生存时间越长（P < 0.05）。另外，在本研究中，cylin D1阳性表达与Her-2阳性表达呈负相关，cyclin D1阳性表达与ER阳性表达呈正相关，提示cyclin D1阳性乳腺癌可能对雌激素更为敏感，恶性度相对偏低，由此也可推断，cyclin D1过表达可能提示患者生存期长，预后良好。近年来随着分子生物学研究的深入，ER受体表达状态在预后中的作用也受到各类研究者的关注[26]。
综上所述，cyclin D1在乳腺癌组织中呈高表达，且与腋窝淋巴结转移数目密切相关，其表达与ER表达呈正相关，与Her-2表达呈负相关，且在cyclin D1过表达组中Luminal A型乳腺癌所占比例较大，cyclin D1阳性表达程度越高，无瘤生存时间越长。上述结果提示cyclin D1表达可能与雌激素敏感乳腺癌的发生及增殖有关，但提示较好的预后，其检测可为乳腺癌评估及预后评价提供必要依据。
