铜死亡是最近被定义的一种不同于程序性细胞死亡的独特死亡方式，是由线粒体内铜过载触发的细胞死亡过程。铜死亡相关基因与肿瘤的发生发展存在一定相关性，这使得靶向铜死亡途径的抗肿瘤治疗成为潜在方向，铜离子载体药物可以将铜离子转入细胞从而诱导细胞铜死亡，为铜死亡在肿瘤治疗中的应用奠定基础。此外，本文对铜稳态及铜死亡相关机制进行阐述，进一步阐明铜死亡作为肺癌治疗靶点的可能。本综述旨在总结目前铜死亡及肺癌相关研究进展，为肺癌的临床治疗提供新的理论和依据。
肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤，死亡率为恶性肿瘤的首位[1]。其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）为主要的病理亚型，约占 85%。手术切除、化疗和放疗是肺癌传统的治疗方式，但是由于化疗和放疗的非特异性，在抗肿瘤的同时会引起骨髓抑制、胃肠道反应等副作用。随着对精准治疗的不断探索，针对突变靶点的靶向治疗也是NSCLC的一种重要的治疗手段[2]。而当缺乏敏感突变时，免疫治疗则成了NSCLC治疗的另一种重要手段，且相比于传统的放化疗在疗效和耐受性等方面都有提升[3-4]。近年来，一些可能诱导癌细胞精确死亡的细胞死亡方式开始受到广泛关注，有望为NSCLC的精准治疗提供新的靶点。
铜（copper，Cu），作为一种人体必需的微量元素，与多种信号传导途径及与肿瘤相关的生物学行为有着密切的联系[5]。Tsvetkov等[6]于2022年定义了一种铜依赖的新型细胞死亡方式，即铜死亡。这种死亡方式由线粒体内铜过载诱导，进而使得三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循环相关的脂酰化二氢硫辛酸转乙酰基酶（dihydrolipoyl transacetylase，DLAT）积聚，该产物的堆积最终引发蛋白质毒性应激，从而导致细胞死亡[7]。鉴于铜死亡与细胞代谢的紧密关联，大量铜死亡相关研究聚焦于具有特定代谢状态的癌种，主要包括一些具有较高有氧呼吸水平及高线粒体代谢活性的肿瘤，如黑色素瘤、乳腺癌等[8-10]，以及具有肿瘤干性的恶性肿瘤[11-12]。此外，在Tsvetkov等[6]的研究中，通过全基因组CRISPR敲除筛选，成功鉴定出包括CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1、PDHB在内的10个与铜死亡过程密切相关的基因，加上铜离子转运相关的ATP7A、ATP7B和SLC31A1，这13个基因被称为铜死亡关键基因（cuproptosis key genes，CKGs），于是大量生物信息学研究通过分析CKGs的表达水平，构建了基于CKGs的基因签名及风险评分，以阐明CKGs以及CKGs相关基因与肿瘤治疗疗效及预后的相关性[13-18]，但其中仅有少数基因通过体内外得到验证[19]。而作为诱导细胞内铜过载，进而导致铜死亡的关键工具—铜离子载体药物，其发现使得体内外研究铜死亡成为可能，推动了铜死亡相关机制研究和探索[20-21]。因此，本文旨在对铜稳态及铜死亡机制进行阐述，并试图阐明铜死亡与肺癌治疗靶点之间的关系，总结目前铜死亡及肺癌相关研究进展，为肺癌的临床治疗提供新理论和依据。
1 铜稳态到铜死亡
人体主要通过饮食摄入铜，食物中的铜通过铜转运蛋白在小肠上皮细胞表面吸收，并通过铜离子ATP酶转运酶α肽排至血液中[22] 。血液中的铜离子主要以蛋白质结合形式存在，而非游离状态，约75%的铜离子与铜蓝蛋白以不可交换的形式结合。铜离子随后通过门静脉系统被运输至肝脏[23] ，肝脏不仅是铜储存的主要场所，也是铜离子体内排泄的关键器官，肝细胞中过量铜通过ATP转运酶β肽排泄到胆汁中，接着随尿液排出人体[24]，从而构成一套完整的体内铜稳态系统。
铜在细胞功能中具有双重作用。一方面，稳态下的铜通过提供或接收电子发挥酶的伴侣作用[5] ；另一方面，铜的异常过载可能导致一系列细胞代谢功能障碍，最终诱导细胞死亡[25] 。当存在肿瘤负荷的情况下，体内铜稳态较易被打破。已在多个癌种中发现肿瘤患者的血清铜离子水平显著高于正常个体[26-28]，其中就包括肺癌[29-30]，且肺癌患者中血清铜离子浓度的升高与临床阶段的恶化及不良预后紧密相关[30]。与小肠上皮细胞相似，肿瘤细胞对铜离子的吸收也依赖于铜转运蛋白，其表达的变化也将直接影响细胞内铜水平[31]。铜离子在细胞内稳态的维持依赖于这些蛋白质的相互作用，铜离子稳态的失衡可能导致细胞代谢功能障碍，甚至细胞死亡。尽管血清铜水平并非等同于细胞内铜水平，但宏观水平的铜离子水平异常也能一定程度上表征病理情况下微观层面的铜代谢紊乱。
Tsvetkov等[6]的研究正是为这种铜离子稳态失衡诱导的细胞死亡机制提供了里程碑式的发现。他们的研究揭示了细胞内过量的铜通过促进DLAT在TCA循环中异常寡聚化来诱导铜死亡。在这个过程中，铁氧化还原蛋白1 (ferredoxin 1，FDX1)是铜死亡的关键调控因素，FDX1通过将 Cu2+还原为 Cu+，促使DLAT脂酰化，脂酰化DLAT进一步发生寡聚化造成蛋白应激诱导细胞死亡 [6]。但目前铜死亡机制仍有许多未解答的问题。首先，铜死亡的特征性表现尚未被描述，包括其细胞形态变化以及分子或细胞水平上的特征性变化[6]。其次，铜离子载体药物，如抗肿瘤药物伊利司莫（elesclomol，ELS）和治疗酒精依赖药物双硫仑（disulfiram，DSF）[32-34]，均存在非DLAT寡聚化诱导的蛋白质毒性应激，例如ELS可通过FDX1降低铁硫簇蛋白稳定性[10]，DSF则通过与核定位蛋白相互作用影响泛素化蛋白质降解途径[35-36]。可见，铜死亡相关机制有待进一步完善，仍需要更多体内外研究明确上游调控途径及下游通路。
2 CKGs与NSCLC相关性
在Tsvetkov等[6]的研究中，通过全基因组CRISPR敲除，成功鉴定出与铜死亡密切相关的10个基因，加上铜离子转运相关基因（SLC31A1、ATP7A及ATP7B），构成了包含13个基因的CKGs。这些基因及对应转录翻译蛋白在铜死亡过程中扮演了至关重要的角色。例如，FDX1通过将Cu从二价铜还原为一价铜，展现出显著的细胞毒性和功能性增强[10]。同样，CDKN2A、GLS和MTF1也被证实在细胞对铜死亡的敏感性中起着决定性作用[6]。进一步研究表明，SLC31A1、ATP7A和ATP7B等基因通过调节细胞内铜离子浓度，对铜死亡过程产生影响[6] 。其中，SLC31A1基因编码的铜离子转运蛋白1负责铜离子的细胞内转运，而ATP7A编码的ATP酶转运酶α肽和ATP7B编码的ATP转运酶β肽则参与铜离子的细胞外排出，共同构成了细胞铜离子转运的重要机制，直接影响着铜的细胞内外平衡[37-39] 。
随着对CKGs在肿瘤学领域内的深入探索，越来越多的研究[40-44]开始聚焦于这些基因在不同类型肿瘤中的表达及其潜在预后价值。针对NSCLC，研究者基于CKGs以及相关lncRNA进行生物信息学分析，成功构建预后特征并显示出良好的预测效果[17-18]。此外，肿瘤免疫微环境（TIME）与CKGs之间的关联已引起广泛关注。早期研究已经揭示，TIME与一系列调节细胞死亡过程，包括凋亡、铁死亡、焦亡、坏死及自噬等，之间存在密切联系[45-47]。在肿瘤环境中诱导这些炎症性细胞死亡形式可能触发损伤相关分子模式（DAMPs）和特定细胞因子的释放，进而调节参与抗肿瘤免疫反应的先天性及适应性免疫细胞的功能。此外，基于铁死亡[48]、焦亡[49-50]以及坏死[51]的分子亚型已被开发，在预测与患者预后及免疫治疗疗效上展现出一定的价值，因此基于CKGs的肿瘤分型也引起了广泛的关注。在NSCLC中，不少研究对CKGs与TIME以及免疫治疗之间的相关性进行研究，在基于CKGs相关基因集构建的风险评分中，高风险组患者表现出免疫抑制的TIME以及较差的免疫治疗响应[15-16]。研究铜死亡相关基因签名有助于从新的视角进行肺癌患者分型，对理解肺癌生物学至关重要，目前由于铜死亡机制尚未完全阐明，尚未能在体内外实验中验证已发表分子分型的有效性，同时还面临数据质量、分析可重复性等挑战，但有赖于大样本数据的挖掘以及统计分析方法的迭代，可以部分克服上述困难，推动铜死亡及肺癌研究进展。
3 铜死亡与NSCLC常见靶点
Tsvetkov等[6]的研究揭示了铜死亡发生的机制，但是关于铜死亡的调控及靶点并未作进一步探索。在铜死亡过程中，过量铜离子直接与有氧呼吸TCA循环中的硫辛酰化蛋白结合，导致这些蛋白发生凝集、铁硫簇蛋白降解，以及随后的蛋白毒性应激和细胞死亡。因此，肺癌发生发展过程中的常见突变及靶点是否可以直接调控CKGs，或者是否能够改变肿瘤细胞能量代谢途径（有氧呼吸/糖酵解）从而调节肿瘤细胞对线粒体呼吸依赖的铜死亡的敏感性，这种铜死亡与NSCLC治疗靶点间的串扰有望为肺癌治疗提供新思路、新方法。
3.1 p53
50%的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）会发生肿瘤抑制基因 TP53 的突变。p53可通过调节下游的靶基因 ，在肺癌的发生、发展、转移中发挥作用。野生型TP53为抑癌基因，对肺癌细胞的生长起负性调节作用。突变型TP53则具有致癌活性，是肺部肿瘤形成的原因之一[52]。大量研究表明突变型p53通过多种机制增强糖酵解、抑制氧化磷酸化以及调节脂质代谢[53-54]。因此，突变型p53可能通过这些方式增强癌细胞对铜死亡抵抗，通过靶向p53的方式调控代谢重编程从而增强铜死亡敏感性有望成为肺癌治疗的有效靶点。
3.2 KRAS
KRAS突变存在于高达35%的LUAD中，且大部分与吸烟相关。KRAS的激活点突变最常见于密码子12（G12C、G12D、G12V和G12A），而密码子13、10或61的激活点突变较少见[55]。谷氨酰胺转化为TCA循环的中间体α-酮戊二酸以及线粒体产生的ROS对KRAS诱导的肺癌发生发展至关重要[56]，表明线粒体代谢在KRAS诱导的肺癌进展中发挥关键作用。同时，研究表明靶向抑制GLS（CKGs之一，编码谷氨酰胺酶）可以协同增强塞鲁美替尼对KRAS突变型NSCLC的抗肿瘤活性，这表明KRAS突变型NSCLC与谷氨酰胺代谢密切相关[57]，提示抑制铜死亡相关基因GLS可能是KRAS突变NSCLC的新靶点。另外一项结直肠癌中研究[58]表明，ATP7A在KRAS突变的结直肠癌细胞表面表达上调，进而调节KRAS突变细胞中的细胞内铜水平并促进肿瘤生长。在肺癌中，KRAS突变与铜离子转运途径的关系尚不明确，有待进一步探索。
3.3 表皮生长因子受体
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是肺癌的致癌驱动因子，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）为EGFR突变阳性患者提供了有利的治疗结果[59]。研究发现，接受TKIs治疗的患者氧化磷酸化水平升高[60]，提示TKIs可能增加对铜死亡的敏感性。近期一项研究[61]进一步揭示了接受奥希替尼治疗的NSCLC中NCOA4上调。NCOA4是铁自噬中的关键蛋白，维持了线粒体电子传递链和氧化磷酸化相关铁硫簇蛋白的合成，这些蛋白合成和活性上调增强了肿瘤细胞对铜死亡的敏感性。此外，奥希替尼与ELS复合物治疗显著提高了奥希替尼的疗效且没有额外的毒性[61]。总之，针对EGFR TKIs耐药的NSCLC患者，联合诱导铜死亡治疗是一种潜在的新疗法。
3.4 PD-L1
程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡受体1（PD-L1/PD-1）轴是肺癌免疫治疗的主要治疗靶点，针对PD-L1/PD-1免疫治疗已显示出良好的临床效果，随着全球首个肺癌新辅助免疫治疗Ⅲ期临床研究——checkmate816的结果问世，2023年第一版NCCN指南也将纳武利尤单抗联合含铂双药化疗方案正式纳入指南[62]。然而，由于肺癌细胞的免疫逃逸环节众多以及治疗相关的副作用，免疫治疗也存在一定局限性。Voli等[63]发现，铜离子螯合剂能够抑制STAT3和EGFR的磷酸化，从而促进PD-L1泛素化降解，最终提高免疫治疗的效果。也有研究报道铜死亡纳米复合物可以重塑TIME，从而增强免疫治疗疗效，但是具体机制尚不明确，仍有待进一步研究[64]。
4 铜离子载体药物在NSCLC治疗中的应用
ELS和DSF是两种临床可及的铜离子载体药物，具有抗癌活性。DSF能提高常规化疗药物的有效性，与多西他赛、阿霉素等联合使用时具有协同作用。一项Ⅱ期随机对照双盲临床研究评估了DSF联合顺铂-长春瑞滨化疗方案的安全性及有效性[65]。该研究纳入了40例晚期NSCLC患者，DSF组相比对照组展现出显著的总生存获益（10.0个月 vs. 7.1个月，P=0.041），其中仅有的两例长期存活患者均出现在DSF组，而这种生存获益并没有在其他一些癌种中得以体现[66]。尽管样本量有限，但作为仅有的一项DSF用于NSCLC治疗的临床研究，其结果仍然显示出DSF用于NSCLC治疗的可能性。此外，DSF与Cu的复合物（DSF-Cu）进一步拓宽了铜离子载体药物的应用。在乳腺癌小鼠模型中，DSF-Cu处理组中上调了PD-L1的表达，进而增强了肿瘤细胞对抗PD-1免疫治疗的敏感性[67]。近期一项研究表明，当与放疗结合时，DSF-Cu能诱导癌细胞中的免疫原性细胞死亡，增强效应T细胞的增殖和活化，从而抑制乳腺癌转移[68]。还有许多正在开展的临床研究探索DSF-Cu的不同治疗方式。一项Ⅰ～Ⅱ期临床研究正在评估围术期使用DSF-Cu治疗胶质母细胞瘤的疗效（NCT02715609），其采用术前单用DSF-Cu新辅助治疗以及术后DSF-Cu联合放化疗辅助治疗方案，研究预计于2024年9月完成。另一项Ⅱ～Ⅲ期随机对照临床研究中并未提示DSF-Cu治疗复发性胶质母细胞瘤患者的临床获益（NCT02678975），研究纳入88例患者并进行1∶1随机化，结果显示额外的DSF-Cu治疗并未取得显著的生存获益，却同时增加了药物毒性[69]。综上，DSF的临床前研究提供了DSF协同已有肿瘤治疗方式的理论基础，且相比于胶质母细胞瘤，DSF治疗已经在NSCLC患者中观察到一定程度的生存获益，未来有望通过进一步临床研究探索DSF/DSF-Cu在NSCLC患者治疗中的应用。
ELS是另一种铜离子载体药物，在诱导铜死亡的专一性方面优于DSF，但其由于特殊的药代动力学，其体内效应较DSF更弱[6]。一项已完成的临床研究评估Ⅲb期/Ⅳ期NSCLC患者采用ELS联合卡铂加紫杉醇化疗方案的安全性及有效性（NCT00088088），但结果并未报道。此外，还有多项早期试验正在进行或已完成但尚未报告结果，临床试验结果的报告可能因各种因素而延迟。近年来，越来越多基于纳米材料的ELS-Cu复合物在临床前动物模型中验证了有效性[64, 70-71]，在精准杀伤肿瘤细胞的同时促进了TIME的重塑，从而增强免疫治疗疗效。
由此可见，铜离子载体药物在改善肿瘤治疗方面具有巨大潜力，未来需进一步研究其在NSCLC治疗中应用以及相关药物的开发，使得精准诱导肺癌细胞铜死亡并协同增强已有治疗方案成为可能。
5 未来及展望
尽管有许多临床前及临床研究初步探索了铜离子载体药物的疗效，铜死亡机制的完善仍是其在肺癌治疗应用中的基石。基于目前金属生物化学及肿瘤代谢检测领域的丰富经验，已有技术能够为肿瘤中铜死亡的直接或间接检测提供参考。铜稳态在肿瘤中的直接或间接观测，对于识别铜依赖性细胞死亡—即铜死亡—发挥着至关重要的作用。例如，Tsvetkov等[6]利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）量化细胞中铜浓度，在其关于铜死亡的研究中展示了离子载体如何将铜运输进入细胞。另外，监测分子生化水平的产物可以识别铜死亡的发生。铜死亡的一个特征是Cu+与TCA循环中涉及的脂酰化线粒体酶（如DLAT）结合，诱发这些蛋白的聚集。因此，监测脂酰化蛋白的寡聚化可以判断是否发生铜死亡。在探索铜死亡机制过程中，Tsvetkov等[6]采用免疫印迹来监测脂酰化DLAT的寡聚化，并使用共聚焦免疫荧光成像直接观察其寡聚体的形成以及与线粒体膜的共定位情况。而通过免疫印迹或免疫组化/免疫荧光检测铜死亡上游调节分子（如LIAS、FDX1和铁硫簇蛋白）的表达水平变化，则间接证明了铜死亡的发生。然而，目前缺乏可靠的形态学变化作为铜死亡的指标，需要进一步的研究来提供更有效的分子标志物。
与其他癌症相比，肺癌细胞线粒体代谢水平更高，耐药性更强，这可能有利于今后诱导铜死亡治疗，取得更好的疗效。铜离子载体与肺癌常用化疗药物或免疫治疗的结合也是未来可能的应用方向。综上所述，铜死亡在肺癌治疗中具有光明的前景，然而铜死亡发生的机制以及铜死亡与肺癌的联系仍需进一步研究。
利益冲突：无。
作者贡献：董懂负责文章撰写和语言修改；张亚杰负责问文章语言修改及内容调整；李鹤成负责文章质量监督和总体设计。
肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤，死亡率为恶性肿瘤的首位[1]。其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）为主要的病理亚型，约占 85%。手术切除、化疗和放疗是肺癌传统的治疗方式，但是由于化疗和放疗的非特异性，在抗肿瘤的同时会引起骨髓抑制、胃肠道反应等副作用。随着对精准治疗的不断探索，针对突变靶点的靶向治疗也是NSCLC的一种重要的治疗手段[2]。而当缺乏敏感突变时，免疫治疗则成了NSCLC治疗的另一种重要手段，且相比于传统的放化疗在疗效和耐受性等方面都有提升[3-4]。近年来，一些可能诱导癌细胞精确死亡的细胞死亡方式开始受到广泛关注，有望为NSCLC的精准治疗提供新的靶点。
铜（copper，Cu），作为一种人体必需的微量元素，与多种信号传导途径及与肿瘤相关的生物学行为有着密切的联系[5]。Tsvetkov等[6]于2022年定义了一种铜依赖的新型细胞死亡方式，即铜死亡。这种死亡方式由线粒体内铜过载诱导，进而使得三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循环相关的脂酰化二氢硫辛酸转乙酰基酶（dihydrolipoyl transacetylase，DLAT）积聚，该产物的堆积最终引发蛋白质毒性应激，从而导致细胞死亡[7]。鉴于铜死亡与细胞代谢的紧密关联，大量铜死亡相关研究聚焦于具有特定代谢状态的癌种，主要包括一些具有较高有氧呼吸水平及高线粒体代谢活性的肿瘤，如黑色素瘤、乳腺癌等[8-10]，以及具有肿瘤干性的恶性肿瘤[11-12]。此外，在Tsvetkov等[6]的研究中，通过全基因组CRISPR敲除筛选，成功鉴定出包括CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1、PDHB在内的10个与铜死亡过程密切相关的基因，加上铜离子转运相关的ATP7A、ATP7B和SLC31A1，这13个基因被称为铜死亡关键基因（cuproptosis key genes，CKGs），于是大量生物信息学研究通过分析CKGs的表达水平，构建了基于CKGs的基因签名及风险评分，以阐明CKGs以及CKGs相关基因与肿瘤治疗疗效及预后的相关性[13-18]，但其中仅有少数基因通过体内外得到验证[19]。而作为诱导细胞内铜过载，进而导致铜死亡的关键工具—铜离子载体药物，其发现使得体内外研究铜死亡成为可能，推动了铜死亡相关机制研究和探索[20-21]。因此，本文旨在对铜稳态及铜死亡机制进行阐述，并试图阐明铜死亡与肺癌治疗靶点之间的关系，总结目前铜死亡及肺癌相关研究进展，为肺癌的临床治疗提供新理论和依据。
1 铜稳态到铜死亡
人体主要通过饮食摄入铜，食物中的铜通过铜转运蛋白在小肠上皮细胞表面吸收，并通过铜离子ATP酶转运酶α肽排至血液中[22] 。血液中的铜离子主要以蛋白质结合形式存在，而非游离状态，约75%的铜离子与铜蓝蛋白以不可交换的形式结合。铜离子随后通过门静脉系统被运输至肝脏[23] ，肝脏不仅是铜储存的主要场所，也是铜离子体内排泄的关键器官，肝细胞中过量铜通过ATP转运酶β肽排泄到胆汁中，接着随尿液排出人体[24]，从而构成一套完整的体内铜稳态系统。
铜在细胞功能中具有双重作用。一方面，稳态下的铜通过提供或接收电子发挥酶的伴侣作用[5] ；另一方面，铜的异常过载可能导致一系列细胞代谢功能障碍，最终诱导细胞死亡[25] 。当存在肿瘤负荷的情况下，体内铜稳态较易被打破。已在多个癌种中发现肿瘤患者的血清铜离子水平显著高于正常个体[26-28]，其中就包括肺癌[29-30]，且肺癌患者中血清铜离子浓度的升高与临床阶段的恶化及不良预后紧密相关[30]。与小肠上皮细胞相似，肿瘤细胞对铜离子的吸收也依赖于铜转运蛋白，其表达的变化也将直接影响细胞内铜水平[31]。铜离子在细胞内稳态的维持依赖于这些蛋白质的相互作用，铜离子稳态的失衡可能导致细胞代谢功能障碍，甚至细胞死亡。尽管血清铜水平并非等同于细胞内铜水平，但宏观水平的铜离子水平异常也能一定程度上表征病理情况下微观层面的铜代谢紊乱。
Tsvetkov等[6]的研究正是为这种铜离子稳态失衡诱导的细胞死亡机制提供了里程碑式的发现。他们的研究揭示了细胞内过量的铜通过促进DLAT在TCA循环中异常寡聚化来诱导铜死亡。在这个过程中，铁氧化还原蛋白1 (ferredoxin 1，FDX1)是铜死亡的关键调控因素，FDX1通过将 Cu2+还原为 Cu+，促使DLAT脂酰化，脂酰化DLAT进一步发生寡聚化造成蛋白应激诱导细胞死亡 [6]。但目前铜死亡机制仍有许多未解答的问题。首先，铜死亡的特征性表现尚未被描述，包括其细胞形态变化以及分子或细胞水平上的特征性变化[6]。其次，铜离子载体药物，如抗肿瘤药物伊利司莫（elesclomol，ELS）和治疗酒精依赖药物双硫仑（disulfiram，DSF）[32-34]，均存在非DLAT寡聚化诱导的蛋白质毒性应激，例如ELS可通过FDX1降低铁硫簇蛋白稳定性[10]，DSF则通过与核定位蛋白相互作用影响泛素化蛋白质降解途径[35-36]。可见，铜死亡相关机制有待进一步完善，仍需要更多体内外研究明确上游调控途径及下游通路。
2 CKGs与NSCLC相关性
在Tsvetkov等[6]的研究中，通过全基因组CRISPR敲除，成功鉴定出与铜死亡密切相关的10个基因，加上铜离子转运相关基因（SLC31A1、ATP7A及ATP7B），构成了包含13个基因的CKGs。这些基因及对应转录翻译蛋白在铜死亡过程中扮演了至关重要的角色。例如，FDX1通过将Cu从二价铜还原为一价铜，展现出显著的细胞毒性和功能性增强[10]。同样，CDKN2A、GLS和MTF1也被证实在细胞对铜死亡的敏感性中起着决定性作用[6]。进一步研究表明，SLC31A1、ATP7A和ATP7B等基因通过调节细胞内铜离子浓度，对铜死亡过程产生影响[6] 。其中，SLC31A1基因编码的铜离子转运蛋白1负责铜离子的细胞内转运，而ATP7A编码的ATP酶转运酶α肽和ATP7B编码的ATP转运酶β肽则参与铜离子的细胞外排出，共同构成了细胞铜离子转运的重要机制，直接影响着铜的细胞内外平衡[37-39] 。
随着对CKGs在肿瘤学领域内的深入探索，越来越多的研究[40-44]开始聚焦于这些基因在不同类型肿瘤中的表达及其潜在预后价值。针对NSCLC，研究者基于CKGs以及相关lncRNA进行生物信息学分析，成功构建预后特征并显示出良好的预测效果[17-18]。此外，肿瘤免疫微环境（TIME）与CKGs之间的关联已引起广泛关注。早期研究已经揭示，TIME与一系列调节细胞死亡过程，包括凋亡、铁死亡、焦亡、坏死及自噬等，之间存在密切联系[45-47]。在肿瘤环境中诱导这些炎症性细胞死亡形式可能触发损伤相关分子模式（DAMPs）和特定细胞因子的释放，进而调节参与抗肿瘤免疫反应的先天性及适应性免疫细胞的功能。此外，基于铁死亡[48]、焦亡[49-50]以及坏死[51]的分子亚型已被开发，在预测与患者预后及免疫治疗疗效上展现出一定的价值，因此基于CKGs的肿瘤分型也引起了广泛的关注。在NSCLC中，不少研究对CKGs与TIME以及免疫治疗之间的相关性进行研究，在基于CKGs相关基因集构建的风险评分中，高风险组患者表现出免疫抑制的TIME以及较差的免疫治疗响应[15-16]。研究铜死亡相关基因签名有助于从新的视角进行肺癌患者分型，对理解肺癌生物学至关重要，目前由于铜死亡机制尚未完全阐明，尚未能在体内外实验中验证已发表分子分型的有效性，同时还面临数据质量、分析可重复性等挑战，但有赖于大样本数据的挖掘以及统计分析方法的迭代，可以部分克服上述困难，推动铜死亡及肺癌研究进展。
3 铜死亡与NSCLC常见靶点
Tsvetkov等[6]的研究揭示了铜死亡发生的机制，但是关于铜死亡的调控及靶点并未作进一步探索。在铜死亡过程中，过量铜离子直接与有氧呼吸TCA循环中的硫辛酰化蛋白结合，导致这些蛋白发生凝集、铁硫簇蛋白降解，以及随后的蛋白毒性应激和细胞死亡。因此，肺癌发生发展过程中的常见突变及靶点是否可以直接调控CKGs，或者是否能够改变肿瘤细胞能量代谢途径（有氧呼吸/糖酵解）从而调节肿瘤细胞对线粒体呼吸依赖的铜死亡的敏感性，这种铜死亡与NSCLC治疗靶点间的串扰有望为肺癌治疗提供新思路、新方法。
3.1 p53
50%的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）会发生肿瘤抑制基因 TP53 的突变。p53可通过调节下游的靶基因 ，在肺癌的发生、发展、转移中发挥作用。野生型TP53为抑癌基因，对肺癌细胞的生长起负性调节作用。突变型TP53则具有致癌活性，是肺部肿瘤形成的原因之一[52]。大量研究表明突变型p53通过多种机制增强糖酵解、抑制氧化磷酸化以及调节脂质代谢[53-54]。因此，突变型p53可能通过这些方式增强癌细胞对铜死亡抵抗，通过靶向p53的方式调控代谢重编程从而增强铜死亡敏感性有望成为肺癌治疗的有效靶点。
3.2 KRAS
KRAS突变存在于高达35%的LUAD中，且大部分与吸烟相关。KRAS的激活点突变最常见于密码子12（G12C、G12D、G12V和G12A），而密码子13、10或61的激活点突变较少见[55]。谷氨酰胺转化为TCA循环的中间体α-酮戊二酸以及线粒体产生的ROS对KRAS诱导的肺癌发生发展至关重要[56]，表明线粒体代谢在KRAS诱导的肺癌进展中发挥关键作用。同时，研究表明靶向抑制GLS（CKGs之一，编码谷氨酰胺酶）可以协同增强塞鲁美替尼对KRAS突变型NSCLC的抗肿瘤活性，这表明KRAS突变型NSCLC与谷氨酰胺代谢密切相关[57]，提示抑制铜死亡相关基因GLS可能是KRAS突变NSCLC的新靶点。另外一项结直肠癌中研究[58]表明，ATP7A在KRAS突变的结直肠癌细胞表面表达上调，进而调节KRAS突变细胞中的细胞内铜水平并促进肿瘤生长。在肺癌中，KRAS突变与铜离子转运途径的关系尚不明确，有待进一步探索。
3.3 表皮生长因子受体
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是肺癌的致癌驱动因子，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）为EGFR突变阳性患者提供了有利的治疗结果[59]。研究发现，接受TKIs治疗的患者氧化磷酸化水平升高[60]，提示TKIs可能增加对铜死亡的敏感性。近期一项研究[61]进一步揭示了接受奥希替尼治疗的NSCLC中NCOA4上调。NCOA4是铁自噬中的关键蛋白，维持了线粒体电子传递链和氧化磷酸化相关铁硫簇蛋白的合成，这些蛋白合成和活性上调增强了肿瘤细胞对铜死亡的敏感性。此外，奥希替尼与ELS复合物治疗显著提高了奥希替尼的疗效且没有额外的毒性[61]。总之，针对EGFR TKIs耐药的NSCLC患者，联合诱导铜死亡治疗是一种潜在的新疗法。
3.4 PD-L1
程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡受体1（PD-L1/PD-1）轴是肺癌免疫治疗的主要治疗靶点，针对PD-L1/PD-1免疫治疗已显示出良好的临床效果，随着全球首个肺癌新辅助免疫治疗Ⅲ期临床研究——checkmate816的结果问世，2023年第一版NCCN指南也将纳武利尤单抗联合含铂双药化疗方案正式纳入指南[62]。然而，由于肺癌细胞的免疫逃逸环节众多以及治疗相关的副作用，免疫治疗也存在一定局限性。Voli等[63]发现，铜离子螯合剂能够抑制STAT3和EGFR的磷酸化，从而促进PD-L1泛素化降解，最终提高免疫治疗的效果。也有研究报道铜死亡纳米复合物可以重塑TIME，从而增强免疫治疗疗效，但是具体机制尚不明确，仍有待进一步研究[64]。
4 铜离子载体药物在NSCLC治疗中的应用
ELS和DSF是两种临床可及的铜离子载体药物，具有抗癌活性。DSF能提高常规化疗药物的有效性，与多西他赛、阿霉素等联合使用时具有协同作用。一项Ⅱ期随机对照双盲临床研究评估了DSF联合顺铂-长春瑞滨化疗方案的安全性及有效性[65]。该研究纳入了40例晚期NSCLC患者，DSF组相比对照组展现出显著的总生存获益（10.0个月 vs. 7.1个月，P=0.041），其中仅有的两例长期存活患者均出现在DSF组，而这种生存获益并没有在其他一些癌种中得以体现[66]。尽管样本量有限，但作为仅有的一项DSF用于NSCLC治疗的临床研究，其结果仍然显示出DSF用于NSCLC治疗的可能性。此外，DSF与Cu的复合物（DSF-Cu）进一步拓宽了铜离子载体药物的应用。在乳腺癌小鼠模型中，DSF-Cu处理组中上调了PD-L1的表达，进而增强了肿瘤细胞对抗PD-1免疫治疗的敏感性[67]。近期一项研究表明，当与放疗结合时，DSF-Cu能诱导癌细胞中的免疫原性细胞死亡，增强效应T细胞的增殖和活化，从而抑制乳腺癌转移[68]。还有许多正在开展的临床研究探索DSF-Cu的不同治疗方式。一项Ⅰ～Ⅱ期临床研究正在评估围术期使用DSF-Cu治疗胶质母细胞瘤的疗效（NCT02715609），其采用术前单用DSF-Cu新辅助治疗以及术后DSF-Cu联合放化疗辅助治疗方案，研究预计于2024年9月完成。另一项Ⅱ～Ⅲ期随机对照临床研究中并未提示DSF-Cu治疗复发性胶质母细胞瘤患者的临床获益（NCT02678975），研究纳入88例患者并进行1∶1随机化，结果显示额外的DSF-Cu治疗并未取得显著的生存获益，却同时增加了药物毒性[69]。综上，DSF的临床前研究提供了DSF协同已有肿瘤治疗方式的理论基础，且相比于胶质母细胞瘤，DSF治疗已经在NSCLC患者中观察到一定程度的生存获益，未来有望通过进一步临床研究探索DSF/DSF-Cu在NSCLC患者治疗中的应用。
ELS是另一种铜离子载体药物，在诱导铜死亡的专一性方面优于DSF，但其由于特殊的药代动力学，其体内效应较DSF更弱[6]。一项已完成的临床研究评估Ⅲb期/Ⅳ期NSCLC患者采用ELS联合卡铂加紫杉醇化疗方案的安全性及有效性（NCT00088088），但结果并未报道。此外，还有多项早期试验正在进行或已完成但尚未报告结果，临床试验结果的报告可能因各种因素而延迟。近年来，越来越多基于纳米材料的ELS-Cu复合物在临床前动物模型中验证了有效性[64, 70-71]，在精准杀伤肿瘤细胞的同时促进了TIME的重塑，从而增强免疫治疗疗效。
由此可见，铜离子载体药物在改善肿瘤治疗方面具有巨大潜力，未来需进一步研究其在NSCLC治疗中应用以及相关药物的开发，使得精准诱导肺癌细胞铜死亡并协同增强已有治疗方案成为可能。
5 未来及展望
尽管有许多临床前及临床研究初步探索了铜离子载体药物的疗效，铜死亡机制的完善仍是其在肺癌治疗应用中的基石。基于目前金属生物化学及肿瘤代谢检测领域的丰富经验，已有技术能够为肿瘤中铜死亡的直接或间接检测提供参考。铜稳态在肿瘤中的直接或间接观测，对于识别铜依赖性细胞死亡—即铜死亡—发挥着至关重要的作用。例如，Tsvetkov等[6]利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）量化细胞中铜浓度，在其关于铜死亡的研究中展示了离子载体如何将铜运输进入细胞。另外，监测分子生化水平的产物可以识别铜死亡的发生。铜死亡的一个特征是Cu+与TCA循环中涉及的脂酰化线粒体酶（如DLAT）结合，诱发这些蛋白的聚集。因此，监测脂酰化蛋白的寡聚化可以判断是否发生铜死亡。在探索铜死亡机制过程中，Tsvetkov等[6]采用免疫印迹来监测脂酰化DLAT的寡聚化，并使用共聚焦免疫荧光成像直接观察其寡聚体的形成以及与线粒体膜的共定位情况。而通过免疫印迹或免疫组化/免疫荧光检测铜死亡上游调节分子（如LIAS、FDX1和铁硫簇蛋白）的表达水平变化，则间接证明了铜死亡的发生。然而，目前缺乏可靠的形态学变化作为铜死亡的指标，需要进一步的研究来提供更有效的分子标志物。
与其他癌症相比，肺癌细胞线粒体代谢水平更高，耐药性更强，这可能有利于今后诱导铜死亡治疗，取得更好的疗效。铜离子载体与肺癌常用化疗药物或免疫治疗的结合也是未来可能的应用方向。综上所述，铜死亡在肺癌治疗中具有光明的前景，然而铜死亡发生的机制以及铜死亡与肺癌的联系仍需进一步研究。
利益冲突：无。
作者贡献：董懂负责文章撰写和语言修改；张亚杰负责问文章语言修改及内容调整；李鹤成负责文章质量监督和总体设计。