重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是由T细胞辅助、补体参与，可以产生特异性的乙酰胆碱受体抗体（anti. acetylcholine receptor antibody，AChRab）影响神经肌肉接头处信号传递，导致骨骼肌收缩乏力的自身免疫性疾病[1]。其特征是波动性的肌肉乏力和易疲劳，早期常累及眼肌，后可逐渐发展到全身[2]。MG在国内并不少见，流行病学显示我国每年MG发病率约为6.8/100万，其中女性发病较为常见，大部分MG患者均会出现AChRab阳性[3]。目前对于MG的发病机制还尚未明确，大多数观点认为胸腺中可以产生特异性的抗体，从而参与了MG的发生、发展过程[4]。胸腺切除术对MG患者临床症状的长期改善逐渐被大家认可，因此胸腺切除术联合药物治疗成为目前MG首选的治疗方式[5]。胸腺被认为是MG自身免疫机制的始动和维持的主要原因，而胸腺滤泡生发中心（follicular germinal center，GC）的发现让胸腺和MG关系更加清晰，GC不仅作为TFH细胞增殖、激活和导入形成的特殊结构，在抗原刺激后次级淋巴组织中B细胞也在GC成熟，也是自身免疫性疾病中形成致病抗体的重要部位[6]。
2000年Schaerli等[7]发现了一类特殊的CD4+T细胞亚群，其主要负责辅助 B细胞迁移、增殖、分化为浆细胞和记忆B细胞，并产生特异性抗体[8]，被命名为滤泡辅助性T（T follicular helper，TFH）细胞。TFH细胞在很多自身免疫性疾病中发挥重大作用，例如 系统性红斑狼疮[9]、自身免疫性疾病[10]、多发性硬化[11]等。研究[12]发现， TFH细胞是辅助B细胞发挥功能最主要的细胞，TFH分泌IL-4促进B细胞分化为记忆细胞，而IL-10、IL-21可以促进B细胞向浆细胞分化，从而产生特异性的AChRab。而MG发病主要是因为AChRab破坏了神经肌肉接头处的信号传递过程，导致肌肉收缩乏力，所以TFH细胞和B细胞的相互作用在MG的发生、发展过程中起至关重要的作用。
α7烟碱样乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor， α7nAChR）作为非神经元型胆碱能系统（non-neuronal cholinergic system，NNCS）其中一个重要亚型，已经被证实广泛分布于免疫细胞表面。有研究[13]发现，激活α7nAChR可增强T淋巴细胞的免疫抑制功能，抑制免疫细胞因子的释放。TFH细胞属于CD4+T细胞一个重要亚群，与MG发生息息相关[14]，那么α7nAChR在TFH细胞上的表达高低是否可以通过影响其功能，导致细胞因子释放发生变化，进一步影响B细胞产生特异性抗体导致MG的发生，这是一个值得思考的问题。所以我们将α7nAChR在MG患者胸腺TFH细胞的表达情况作为研究的创新点，去探讨α7nAChR的表达差异可能通过何种途径来影响MG的发生。本研究通过检测TFH细胞α7nAChR的表达情况，分析α7nAChR的表达水平与TFH细胞的联系，旨在探究MG胸腺TFH细胞α7nAChR的表达水平是否可以通过影响其功能而间接参与MG的发生、发展过程，同时可以为后续进一步探索MG胸腺中致病性抗体产生的具体途径奠定基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选取2022年6月—2023年6月就诊于河南省人民医院重症肌无力综合诊疗中心行手术治疗的MG患者15例为MG组，其中男7例、女8例，年龄12～30岁；选取2022年6月—2023年6月在阜外华中心血管病医院行心脏手术过程中为不阻碍术野行部分胸腺切除术的患者12例为对照组，其中男5例、女7例，年龄20～35岁。纳入标准：（1）MG组患者诊断均已明确，即有典型的MG临床特征，并满足以下任意一点，包括药理学检查、电生理学检查、抗乙酰胆碱受体抗体检查等检测；（2）入组患者均未接受过激素、免疫抑制剂等治疗；（3）临床资料未见缺失。排除标准：（1）合并多脏器感染、多器官衰竭、严重精神疾患等；（2）合并胸腺瘤、其他自身免疫性疾病等；（3）中途退出者。
1.2 主要试剂耗材
PBS缓冲液、80目无菌不锈钢钢丝网、RPMI-1640培养基、Ficoll细胞分离液、流式CD3/CD4/CD8/CD45/CXCR5抗体、CD4+ T细胞分选试剂盒、磁珠CXCR5抗体、LS分选柱、α7nAChR抗体、RNA-easy Isolation Reagent试剂盒、引物、逆转录试剂盒、BCA试剂盒等。
1.3 方法
1.3.1 细胞提取及纯化
胸腺组织离体后立刻置于冷的PBS缓冲液中清洗，无菌操作台上去除胸腺表面的脂肪和结缔组织，将胸腺组织放于80目的不锈钢网上剪成小块，然后轻柔研磨组织，吸取PBS冲洗不锈钢网得到胸腺细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，弃上清。加入红细胞裂解液裂解4～5 min，用PBS洗涤1～2遍后，重悬计数。
1.3.2 密度梯度离心纯化胸腺细胞
取4～5 mL Ficoll细胞分离液（取用前恢复至室温并摇匀）将研磨后的胸腺细胞重悬，转移至15 mL离心管中，缓慢加入500～1 000 μL的RPMI-1640培养基，尽量保持两层液面分界明显。室温，800 g离心30 min。离心过程中均要设置较慢的加速度和减速度，待离心结束后根据密度不同会分为3层。缓慢吸出中间的胸腺细胞层，再加入培养基颠倒洗涤。室温，250 g离心10 min收集细胞。
1.3.3 流式细胞术检验α7nAChR在TFH细胞的表达情况
使用冷的 PBS 缓冲液洗涤胸腺细胞，再用缓冲液配制成1×106细胞/mL的细胞悬液。分别向各样品管加入适量的细胞表面荧光抗体，2～8℃避光孵育30 min，随后加1 mL PBS缓冲液清洗细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清，用500 uL流式细胞鞘液重悬，等待流式上机检测。
1.3.4 磁珠分选获得TFH细胞
取部分纯化后的胸腺细胞悬液，每
个细胞离心重悬于40 μL磁珠分选缓冲液中，先加入 CD4+ Biotin-Antibody Cocktail孵育10 min后，加入Anti-Biotin Microbeads孵育15 min，混匀后加入到LS分选柱中，收集全部流出液。300 g，4℃离心10 min，弃上清，即为我们要的CD4+ T细胞。将分选出的CD4+ T细胞计数，300 g，4℃离心10 min，弃上清。加入CXCR5 Antibody孵育10 min后，加入Anti-APC Microbeads孵育15 min，混匀后加入到LS分选柱，收集全部流出液。将LS柱取下，用1 mL磁珠分选缓冲液将结合在 LS柱内的带有磁珠标记的细胞洗出，300 g，4℃离心10 min，弃上清，得到的即 CD4+CXCR5+ TFH细胞。
1.3.5 RT-PCR
分选后的胸腺TFH细胞用RNA-easy Isolation Reagent试剂盒提取总的RNA，然后根据逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为转录模版按实时荧光聚合酶链式反应试剂盒进行目的基因特异性扩增，GAPDH为内参，以2-△△Ct法计算胸腺TFH细胞中α7nAChR相对表达量。引物序列见表1。
表1
引物序列
1.3.6 Western blot
RIPA蛋白裂解液提取胸腺TFH细胞蛋白，BCA试剂盒测量蛋白浓度，提前制备好预制胶，将蛋白质溶液与样品缓冲液按比例混合，100℃水浴加热3～5 min，离心取上清，上样后开始聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），待电泳结束后将蛋白转膜至PVDF膜上，转膜后封闭。α7nAChR一抗4℃过夜孵育、洗涤，再加入二抗室温孵育、洗涤。配置显色液后孵育显影，上机检测。
1.4 统计学分析
本实验数据均应用SPSS 26.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）描述，两组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。
1.5 伦理审查
本研究已通过河南省人民医院医学伦理委员会批准，伦理批号：（2021）伦审第（176）号，所有入组患者对本研究皆支持，并签署相关知情同意书。
2 结果
2.1 一般资料
两组患者年龄差异有统计学意义（P=0.035），两组患者性别差异无统计学意义（P=0.795）；见表2。
表2
两组患者一般资料比较 ［x±s/例（%）］
2.2 流式间接标记检测MG组与对照组胸腺TFH细胞比例
MG组胸腺TFH细胞的比例较对照组明显升高（P<0.05）；见图1a～b。
图1
XXX
2.3 流式间接标记检测MG组与对照组胸腺TFH细胞α7nAChR水平
MG组胸腺TFH细胞α7nAChR的水平较对照组明显降低（P<0.001）；见图1c～d。
2.4 MG组与对照组胸腺TFH细胞中α7nAChR水平比较
MG组胸腺TFH细胞α7nAChR mRNA、蛋白水平较对照组明显降低（P<0. 01）；见图1e。
3 讨论
MG的发病机制涉及多方面的因素，其发生主要是由于特异性AchRab的产生，而活化的TFH细胞、B细胞、浆细胞和相关细胞因子在MG致病性自身抗体的产生中起至关重要的作用[14]。目前发现患MG的人群中，女性是要略多于男性，整体发病率也在逐年上升。因此，研究MG的发病机制对MG的诊断和治疗非常有意义。
研究[15]表明，TFH细胞表面标志物是 CXCR5、ICOS、PD-l、CCR7，同时特异性的表达Bcl-6，分泌IL-21，这是TFH细胞与其他T细胞亚群相互鉴别的关键特征。同时，这些分子在调控TFH细胞的发育以及其辅助B细胞分泌特异性抗体的过程中都发挥着非常重要作用。TFH分泌的IL-6对生发中心的形成是非常重要的，GC是高亲和力B细胞选择的位点，在GC中，TFH细胞和B细胞的相互作用是通过一系列的表面分子和细胞因子实现的，如 ICOS-ICOSL、PD-1–PD-1L、CD40-CD40L、IL-21–IL-21R，这些分子信号的传导促进了记忆B细胞和浆细胞的形成[16-17]。TFH分泌的细胞因子在GC中T-B 细胞之间的相互作用中决定了B细胞的分化方向，IL-4 促进B细胞分化为记忆细胞，而IL-10、IL-21可以促进 B 细胞向浆细胞分化[18]。研究表明，MG患者的临床症状严重程度与细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21均存在相关性[19]。
研究[20]发现，MG患者外周血中的TFH细胞比例增高，且TFH细胞的增高与抗乙酰胆碱受体抗体的水平有正相关性。有动物研究显示，通过抑制TFH细胞的分化，可以降低EAMG模型小鼠中抗体的水平，改善EAMG模型小鼠的重症肌无力症状[21]。这充分说明TFH细胞在重症肌无力的发生、发展过程中发挥重要作用。研究发现[22]，在 MG 患者的外周血的 TFH细胞及细胞因子IL-21的表达都高于对照组。同时在MG患者的胸腺中有TFH细胞的高表达，并且TFH细胞的比例与疾病的严重程度相关，以上都充分说明胸腺中的TFH可能参与了MG的发病[23]。我们研究发现，MG患者胸腺中TFH细胞比例显著高于正常对照组。结合之前研究，说明TFH细胞的比例增加与MG的关系十分密切。
有研究[12]发现，激活α7nAChR可增强T淋巴细胞的免疫抑制功能，抑制免疫细胞因子的释放。那么α7nAChR的表达降低减弱了对TFH细胞的免疫抑制功能，从而使其TFH细胞的功能活跃，增加细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21等的释放，促进了记忆B细胞和浆细胞的形成，使致病性抗体的产生增加，从而参与MG的发病过程。我们本次研究首先通过流式细胞术检测胸腺细胞悬液中TFH细胞的比例，发现MG组TFH细胞的比例是要明显高于对照组的，但是TFH细胞中α7nAChR的表达是要比对照组明显降低的，这也验证了我们的猜想。TFH细胞作为主要辅助B细胞增殖分化为浆细胞并产生特异性抗体，在重症肌无力中是会明显升高的。而α7nAChR作为TFH细胞表面的靶点，是对TFH细胞起免疫抑制作用，所以α7nAChR表达降低会减少对TFH细胞的免疫抑制作用，使其活化并产生更多的细胞因子，刺激B细胞活化增殖为浆细胞，产生特异性抗体，从而可能参与MG的发生发展过程。
我们发现α7nAChR在TFH细胞表达降低与MG的发生密切相关，但具体是通过何种途径来介导该种免疫反应还暂未明确。有研究发现，Ach与免疫细胞上的α7nAChR结合，通过因子核因子κB （nuclear factor κB，NF- κB）、JAK2/STAT3、PI3K/AKT 等信号通路调控多种细胞因子的产生与释放，发挥免疫作用[24]。其中JAK2/STAT3 通路主要介导细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡及生物体免疫调节，在免疫调节过程中发挥重要作用[25]。NF-κB是在炎性反应中无法代替的转录因子，NF-κB 在炎性反应中能够与多种炎性反应调控基因的启动子相结合，从而调控炎症反应[26]。PI3K/AKT 是生物体内非常重要的一条细胞内信号传导通路，PI3K是一种脂质激酶，当针刺刺激导致α7nAChR释放激活胆碱能通路，使胞内RTKs发生磷酸化从而激活PI3K 蛋白，进而调控下游介质的表达[27]。那么α7nAChR表达降低会通过何种信号通路来影响细胞因子的释放，将是我们下一步研究的重点方向，是MG发病机制研究更深一步的跨越。
综上所述，本研究表明α7nAChR可以通过影响TFH细胞的功能而间接影响B细胞产生特异性致病性抗体的产生，从而在MG发病中起一定的作用，能够为MG治疗提供新的思路，使得以α7nAChR为中心靶点的治疗成为可能。同时我们下一步将重点放在与α7nAChR密切相关的NF-κB、JAK2/STAT3、PI3K/AKT等信号通路上，希望可以更进一步的了解MG的发病机制。
利益冲突：无。
作者贡献：王猛负责文献检索，绘制图表，初稿撰写；王猛、杨梦豪负责论文设计、数据分析；孙子瑞、史宸硕、张志文、郑理想负责资料收集，提出修改意见；崔新征负责内容指导；张清勇负责参与制定研究思路，全文审校。
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是由T细胞辅助、补体参与，可以产生特异性的乙酰胆碱受体抗体（anti. acetylcholine receptor antibody，AChRab）影响神经肌肉接头处信号传递，导致骨骼肌收缩乏力的自身免疫性疾病[1]。其特征是波动性的肌肉乏力和易疲劳，早期常累及眼肌，后可逐渐发展到全身[2]。MG在国内并不少见，流行病学显示我国每年MG发病率约为6.8/100万，其中女性发病较为常见，大部分MG患者均会出现AChRab阳性[3]。目前对于MG的发病机制还尚未明确，大多数观点认为胸腺中可以产生特异性的抗体，从而参与了MG的发生、发展过程[4]。胸腺切除术对MG患者临床症状的长期改善逐渐被大家认可，因此胸腺切除术联合药物治疗成为目前MG首选的治疗方式[5]。胸腺被认为是MG自身免疫机制的始动和维持的主要原因，而胸腺滤泡生发中心（follicular germinal center，GC）的发现让胸腺和MG关系更加清晰，GC不仅作为TFH细胞增殖、激活和导入形成的特殊结构，在抗原刺激后次级淋巴组织中B细胞也在GC成熟，也是自身免疫性疾病中形成致病抗体的重要部位[6]。
2000年Schaerli等[7]发现了一类特殊的CD4+T细胞亚群，其主要负责辅助 B细胞迁移、增殖、分化为浆细胞和记忆B细胞，并产生特异性抗体[8]，被命名为滤泡辅助性T（T follicular helper，TFH）细胞。TFH细胞在很多自身免疫性疾病中发挥重大作用，例如 系统性红斑狼疮[9]、自身免疫性疾病[10]、多发性硬化[11]等。研究[12]发现， TFH细胞是辅助B细胞发挥功能最主要的细胞，TFH分泌IL-4促进B细胞分化为记忆细胞，而IL-10、IL-21可以促进B细胞向浆细胞分化，从而产生特异性的AChRab。而MG发病主要是因为AChRab破坏了神经肌肉接头处的信号传递过程，导致肌肉收缩乏力，所以TFH细胞和B细胞的相互作用在MG的发生、发展过程中起至关重要的作用。
α7烟碱样乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor， α7nAChR）作为非神经元型胆碱能系统（non-neuronal cholinergic system，NNCS）其中一个重要亚型，已经被证实广泛分布于免疫细胞表面。有研究[13]发现，激活α7nAChR可增强T淋巴细胞的免疫抑制功能，抑制免疫细胞因子的释放。TFH细胞属于CD4+T细胞一个重要亚群，与MG发生息息相关[14]，那么α7nAChR在TFH细胞上的表达高低是否可以通过影响其功能，导致细胞因子释放发生变化，进一步影响B细胞产生特异性抗体导致MG的发生，这是一个值得思考的问题。所以我们将α7nAChR在MG患者胸腺TFH细胞的表达情况作为研究的创新点，去探讨α7nAChR的表达差异可能通过何种途径来影响MG的发生。本研究通过检测TFH细胞α7nAChR的表达情况，分析α7nAChR的表达水平与TFH细胞的联系，旨在探究MG胸腺TFH细胞α7nAChR的表达水平是否可以通过影响其功能而间接参与MG的发生、发展过程，同时可以为后续进一步探索MG胸腺中致病性抗体产生的具体途径奠定基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选取2022年6月—2023年6月就诊于河南省人民医院重症肌无力综合诊疗中心行手术治疗的MG患者15例为MG组，其中男7例、女8例，年龄12～30岁；选取2022年6月—2023年6月在阜外华中心血管病医院行心脏手术过程中为不阻碍术野行部分胸腺切除术的患者12例为对照组，其中男5例、女7例，年龄20～35岁。纳入标准：（1）MG组患者诊断均已明确，即有典型的MG临床特征，并满足以下任意一点，包括药理学检查、电生理学检查、抗乙酰胆碱受体抗体检查等检测；（2）入组患者均未接受过激素、免疫抑制剂等治疗；（3）临床资料未见缺失。排除标准：（1）合并多脏器感染、多器官衰竭、严重精神疾患等；（2）合并胸腺瘤、其他自身免疫性疾病等；（3）中途退出者。
1.2 主要试剂耗材
PBS缓冲液、80目无菌不锈钢钢丝网、RPMI-1640培养基、Ficoll细胞分离液、流式CD3/CD4/CD8/CD45/CXCR5抗体、CD4+ T细胞分选试剂盒、磁珠CXCR5抗体、LS分选柱、α7nAChR抗体、RNA-easy Isolation Reagent试剂盒、引物、逆转录试剂盒、BCA试剂盒等。
1.3 方法
1.3.1 细胞提取及纯化
胸腺组织离体后立刻置于冷的PBS缓冲液中清洗，无菌操作台上去除胸腺表面的脂肪和结缔组织，将胸腺组织放于80目的不锈钢网上剪成小块，然后轻柔研磨组织，吸取PBS冲洗不锈钢网得到胸腺细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，弃上清。加入红细胞裂解液裂解4～5 min，用PBS洗涤1～2遍后，重悬计数。
1.3.2 密度梯度离心纯化胸腺细胞
取4～5 mL Ficoll细胞分离液（取用前恢复至室温并摇匀）将研磨后的胸腺细胞重悬，转移至15 mL离心管中，缓慢加入500～1 000 μL的RPMI-1640培养基，尽量保持两层液面分界明显。室温，800 g离心30 min。离心过程中均要设置较慢的加速度和减速度，待离心结束后根据密度不同会分为3层。缓慢吸出中间的胸腺细胞层，再加入培养基颠倒洗涤。室温，250 g离心10 min收集细胞。
1.3.3 流式细胞术检验α7nAChR在TFH细胞的表达情况
使用冷的 PBS 缓冲液洗涤胸腺细胞，再用缓冲液配制成1×106细胞/mL的细胞悬液。分别向各样品管加入适量的细胞表面荧光抗体，2～8℃避光孵育30 min，随后加1 mL PBS缓冲液清洗细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清，用500 uL流式细胞鞘液重悬，等待流式上机检测。
1.3.4 磁珠分选获得TFH细胞
取部分纯化后的胸腺细胞悬液，每个细胞离心重悬于40 μL磁珠分选缓冲液中，先加入 CD4+ Biotin-Antibody Cocktail孵育10 min后，加入Anti-Biotin Microbeads孵育15 min，混匀后加入到LS分选柱中，收集全部流出液。300 g，4℃离心10 min，弃上清，即为我们要的CD4+ T细胞。将分选出的CD4+ T细胞计数，300 g，4℃离心10 min，弃上清。加入CXCR5 Antibody孵育10 min后，加入Anti-APC Microbeads孵育15 min，混匀后加入到LS分选柱，收集全部流出液。将LS柱取下，用1 mL磁珠分选缓冲液将结合在 LS柱内的带有磁珠标记的细胞洗出，300 g，4℃离心10 min，弃上清，得到的即 CD4+CXCR5+ TFH细胞。
1.3.5 RT-PCR
分选后的胸腺TFH细胞用RNA-easy Isolation Reagent试剂盒提取总的RNA，然后根据逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为转录模版按实时荧光聚合酶链式反应试剂盒进行目的基因特异性扩增，GAPDH为内参，以2-△△Ct法计算胸腺TFH细胞中α7nAChR相对表达量。引物序列见表1。
表1
引物序列
1.3.6 Western blot
RIPA蛋白裂解液提取胸腺TFH细胞蛋白，BCA试剂盒测量蛋白浓度，提前制备好预制胶，将蛋白质溶液与样品缓冲液按比例混合，100℃水浴加热3～5 min，离心取上清，上样后开始聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），待电泳结束后将蛋白转膜至PVDF膜上，转膜后封闭。α7nAChR一抗4℃过夜孵育、洗涤，再加入二抗室温孵育、洗涤。配置显色液后孵育显影，上机检测。
1.4 统计学分析
本实验数据均应用SPSS 26.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）描述，两组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。
1.5 伦理审查
本研究已通过河南省人民医院医学伦理委员会批准，伦理批号：（2021）伦审第（176）号，所有入组患者对本研究皆支持，并签署相关知情同意书。
2 结果
2.1 一般资料
两组患者年龄差异有统计学意义（P=0.035），两组患者性别差异无统计学意义（P=0.795）；见表2。
表2
两组患者一般资料比较 ［x±s/例（%）］
2.2 流式间接标记检测MG组与对照组胸腺TFH细胞比例
MG组胸腺TFH细胞的比例较对照组明显升高（P<0.05）；见图1a～b。
图1
XXX
2.3 流式间接标记检测MG组与对照组胸腺TFH细胞α7nAChR水平
MG组胸腺TFH细胞α7nAChR的水平较对照组明显降低（P<0.001）；见图1c～d。
2.4 MG组与对照组胸腺TFH细胞中α7nAChR水平比较
MG组胸腺TFH细胞α7nAChR mRNA、蛋白水平较对照组明显降低（P<0. 01）；见图1e。
3 讨论
MG的发病机制涉及多方面的因素，其发生主要是由于特异性AchRab的产生，而活化的TFH细胞、B细胞、浆细胞和相关细胞因子在MG致病性自身抗体的产生中起至关重要的作用[14]。目前发现患MG的人群中，女性是要略多于男性，整体发病率也在逐年上升。因此，研究MG的发病机制对MG的诊断和治疗非常有意义。
研究[15]表明，TFH细胞表面标志物是 CXCR5、ICOS、PD-l、CCR7，同时特异性的表达Bcl-6，分泌IL-21，这是TFH细胞与其他T细胞亚群相互鉴别的关键特征。同时，这些分子在调控TFH细胞的发育以及其辅助B细胞分泌特异性抗体的过程中都发挥着非常重要作用。TFH分泌的IL-6对生发中心的形成是非常重要的，GC是高亲和力B细胞选择的位点，在GC中，TFH细胞和B细胞的相互作用是通过一系列的表面分子和细胞因子实现的，如 ICOS-ICOSL、PD-1–PD-1L、CD40-CD40L、IL-21–IL-21R，这些分子信号的传导促进了记忆B细胞和浆细胞的形成[16-17]。TFH分泌的细胞因子在GC中T-B 细胞之间的相互作用中决定了B细胞的分化方向，IL-4 促进B细胞分化为记忆细胞，而IL-10、IL-21可以促进 B 细胞向浆细胞分化[18]。研究表明，MG患者的临床症状严重程度与细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21均存在相关性[19]。
研究[20]发现，MG患者外周血中的TFH细胞比例增高，且TFH细胞的增高与抗乙酰胆碱受体抗体的水平有正相关性。有动物研究显示，通过抑制TFH细胞的分化，可以降低EAMG模型小鼠中抗体的水平，改善EAMG模型小鼠的重症肌无力症状[21]。这充分说明TFH细胞在重症肌无力的发生、发展过程中发挥重要作用。研究发现[22]，在 MG 患者的外周血的 TFH细胞及细胞因子IL-21的表达都高于对照组。同时在MG患者的胸腺中有TFH细胞的高表达，并且TFH细胞的比例与疾病的严重程度相关，以上都充分说明胸腺中的TFH可能参与了MG的发病[23]。我们研究发现，MG患者胸腺中TFH细胞比例显著高于正常对照组。结合之前研究，说明TFH细胞的比例增加与MG的关系十分密切。
有研究[12]发现，激活α7nAChR可增强T淋巴细胞的免疫抑制功能，抑制免疫细胞因子的释放。那么α7nAChR的表达降低减弱了对TFH细胞的免疫抑制功能，从而使其TFH细胞的功能活跃，增加细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21等的释放，促进了记忆B细胞和浆细胞的形成，使致病性抗体的产生增加，从而参与MG的发病过程。我们本次研究首先通过流式细胞术检测胸腺细胞悬液中TFH细胞的比例，发现MG组TFH细胞的比例是要明显高于对照组的，但是TFH细胞中α7nAChR的表达是要比对照组明显降低的，这也验证了我们的猜想。TFH细胞作为主要辅助B细胞增殖分化为浆细胞并产生特异性抗体，在重症肌无力中是会明显升高的。而α7nAChR作为TFH细胞表面的靶点，是对TFH细胞起免疫抑制作用，所以α7nAChR表达降低会减少对TFH细胞的免疫抑制作用，使其活化并产生更多的细胞因子，刺激B细胞活化增殖为浆细胞，产生特异性抗体，从而可能参与MG的发生发展过程。
我们发现α7nAChR在TFH细胞表达降低与MG的发生密切相关，但具体是通过何种途径来介导该种免疫反应还暂未明确。有研究发现，Ach与免疫细胞上的α7nAChR结合，通过因子核因子κB （nuclear factor κB，NF- κB）、JAK2/STAT3、PI3K/AKT 等信号通路调控多种细胞因子的产生与释放，发挥免疫作用[24]。其中JAK2/STAT3 通路主要介导细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡及生物体免疫调节，在免疫调节过程中发挥重要作用[25]。NF-κB是在炎性反应中无法代替的转录因子，NF-κB 在炎性反应中能够与多种炎性反应调控基因的启动子相结合，从而调控炎症反应[26]。PI3K/AKT 是生物体内非常重要的一条细胞内信号传导通路，PI3K是一种脂质激酶，当针刺刺激导致α7nAChR释放激活胆碱能通路，使胞内RTKs发生磷酸化从而激活PI3K 蛋白，进而调控下游介质的表达[27]。那么α7nAChR表达降低会通过何种信号通路来影响细胞因子的释放，将是我们下一步研究的重点方向，是MG发病机制研究更深一步的跨越。
综上所述，本研究表明α7nAChR可以通过影响TFH细胞的功能而间接影响B细胞产生特异性致病性抗体的产生，从而在MG发病中起一定的作用，能够为MG治疗提供新的思路，使得以α7nAChR为中心靶点的治疗成为可能。同时我们下一步将重点放在与α7nAChR密切相关的NF-κB、JAK2/STAT3、PI3K/AKT等信号通路上，希望可以更进一步的了解MG的发病机制。
利益冲突：无。
作者贡献：王猛负责文献检索，绘制图表，初稿撰写；王猛、杨梦豪负责论文设计、数据分析；孙子瑞、史宸硕、张志文、郑理想负责资料收集，提出修改意见；崔新征负责内容指导；张清勇负责参与制定研究思路，全文审校。
