心脏传导系统（cardiac conduction system，CCS）是由特殊的心脏细胞组成，它们通过协调房室收缩来建立心脏的有律性跳动，其结构结构包括窦房结（sinoatrial node，SAN）、房室结（atrioventricular node，AVN）、房室束（atrioventricular bundle，AVB)、左右束支（bundle branch，BB）及浦肯野纤维（Purkinje fiber，PF）。由于CCS无法用肉眼识别，只能经验性地借助一些解剖学标志来判断CCS位置[1-3]，因此在心内直视手术中常常被意外损伤，诱发心律失常。其中，传导阻滞是最严重的心律失常类型，特别是在先心病的手术中[4-7]。这不仅会延长住院时间，而且存在植入起搏器的风险，给患者造成额外的痛苦和花费，同时会降低生活质量[8-9]。
为了减少手术中心脏传导组织的损伤对提高心脏外科手术预后，既往研究[10-15]做了不少尝试，但因准确性较差、显像不充分而应用受限。活体荧光成像技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，将荧光染料标记上特异性抗体，来实现特定组织的特异性荧光显像，常用于外科术中定位[16-18]。超极化激活的环核苷酸门控阳离子电流通道蛋白 4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN4），是一种表达于膜表面离子通道蛋白，在传导细胞和非传导细胞中差异性表达，常作为组织切片免疫荧光的特异性靶点[19-20]。另外，连接蛋白（connexin，Cx）参与构成心肌细胞间的缝隙连接，不同亚型在不同心肌中表达存在差异：在SAN及AVN中观察到Cx45高表达，Cx43低表达，在心房肌中Cx43大量表达Cx45低表达，Cx43常作为工作心肌的标记物[19-20]。以上标志物的表达差异，为其在CCS显像中的应用提供了可能。
本研究拟利用HCN4作为CCS特异性靶点，使用针对该靶点荧光染料标记的抗体，通过模拟真实手术主动脉顺行性灌注过程，对CCS的术中实时可视化方法的可行性及成像效果进行了初步的探究。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂
Mouse anti-connexin 43（Santa Cruz，美国）；rabbit anti-HCN4（博奥森，中国）；goat anti-mouse IgG（Alexa Fluor 405）（Thermo Fisher，美国）；goat anti-rabbit IgG（Alexa Fluor 633）（Thermo Fisher，美国）；goat anti-mouse IgG（TRITC）（Jackson，美国）；goat anti-rabbit IgG（Alexa Fluor 647）（Jackson，美国）；DAPI溶液（索莱宝，中国）。
1.2 主要实验仪器
荧光体视显微镜（Leica M205 FCA，德国）；数字切片扫描仪（Olympus，日本）；图像处理软件（Leica，德国）；OLYMPUS（Olympus，日本）。
1.3 实验动物
雄性SPFSD大鼠，9～11周龄，体重350～400 g，购自成都达硕实验动物有限公司，均在四川大学华西临床医学院/华西医院实验动物中心动物房进行饲养。实验动物的饲养和处理遵循美国国立卫生研究院“护理和使用实验室动物指南”（NIH Publication No.85-23）。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-0030。
1.4 实验方法
1.4.1 离体大鼠心脏主动脉顺行性灌注模型构建及预处理
使用异氟烷麻醉33只大鼠后，尾静脉注射肝素钠（100 IU/kg）全身肝素化。使用解剖剪逐层打开胸腔充分暴露心脏，迅速离断各大血管（保留一定长度主动脉），完整取下大鼠心脏，使用预先准备的冰肝素钠-生理盐水稀释液（12 500 U/100 mL）冲洗。将22G留置针经断端插入主动脉近端管腔内并固定。排气后将留置针通过输液延长管连接注射器后固定于微量泵，以4 mL/min经主动脉-冠脉顺行性灌注冰肝素-生理盐水稀释液，直至灌出液无明显红色。使用4%多聚甲醛溶液以4 mL/min灌注固定心脏10 min，PBS溶液（pH 7.2～7.4）灌洗30 min；5%BSA溶液以1 mL/min灌注封闭50 min，PBS溶液灌洗30 min，用于后续经主动脉灌注抗体溶液实验。后续需石蜡切片免疫荧光实验的心脏标本，使用4%多聚甲醛溶液以4 mL/min灌注固定心脏30 min后，浸泡于4%多聚甲醛溶液中4℃固定72 h。
1.4.2 剂量-荧光强度研究
一抗（rabbit anti-HCN4/Mouse anti-connexin 43）稀释液灌注4 h后PBS灌洗30 min，二抗[goat anti-rabbit IgG（Alexa Fluor 633）/goat anti-mouse IgG（Alexa Fluor 405）]稀释液灌注2 h后PBS灌洗30 min，流量固定为1 mL/min。使用体视荧光显微镜拍摄观察。设置5组灌注剂量梯度，每组3只大鼠：一抗原液剂量2.5 μL/5μL，3.75 μL/7.5μL，5 μL/10μL，7.5 μL/15μL，10 μL/20μL。针对HCN4的一抗与二抗原液体积比例固定为1∶2，针对Cx43的一抗与二抗原液体积比例固定为1∶1。
1.4.3 时间-荧光强度研究
先后取剂量梯度为5 μL/10μL一抗原液稀释液和10 μL/10μL二抗原液稀液灌注心脏，流量固定为1 mL/min。设置5组灌注时间梯度，每组3只大鼠：1 h/0.5 h，2 h/1 h，4 h/2 h，6 h/3 h，8 h/4 h。后使用体视荧光显微镜拍摄观察。
1.4.4 光化学稳定性研究
先后取剂量梯度为5 μL/10μL一抗原液稀释液和10 μL/10μL二抗原液稀液灌注3只大鼠心脏，流量固定为1 mL/min。灌注时间梯度设置为：4 h/2 h。灌注完成后解剖右心房及右室，暴露房室交界区心内膜面，使用LED台灯连续光照，并分别在0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h后使用体视荧光显微镜拍摄观察。
1.4.5 组织学对比验证
为验证离体大鼠心脏经主动脉顺行性灌注抗体溶液后体视荧光显微镜下显影结构的性质，将灌注后的大鼠心脏制作为冰冻切片，并取同一层面下石蜡切片进行标准的免疫荧光染色，于荧光显微镜下进行观察比对。
将灌注后的大鼠心脏制作为冰冻切片，并取同一层面下石蜡切片进行标准的免疫荧光染色，于荧光显微镜下进行观察比对。冰冻切片及石蜡切片使用Olympus VS200数字切片扫描仪采集图像，图像使用OLYMPUS OlyVIA V3.4.1软件分析处理，石蜡切片与冰冻切片HCN4荧光信号设置为红色，Cx43荧光信号设置为绿色。根据荧光强弱分析组织中HCN4与Cx43表达差异，传导组织表达特定为HCN4高表达，Cx43低表达，以此标准识别传导组织。
1.4.6 CCS荧光成像的分析
由于预实验中CCS中的其它成分可视化效果不佳，并未按预期出现SAN、AVN下级的分支AVB和BB的显影。故灌注完成后使用标本针固定大鼠心脏，解剖后置于荧光体式显微镜下，只观察AVN：房-室交界区，并采集图像。采集图像后使用Leica Application Suite X软件分析处理。房室交界区半定量荧光分析：（1）在冠状窦与三尖瓣环之间，平行三尖瓣环作一直线段，横穿红色荧光聚集区域，测定该直线段路径中的HCN4和Cx43荧光信号强度变化趋势，在该直线段上每间隔0.1 mm计算HCN4/Cx43荧光强度比值，评估两种荧光信号的差异性大小。（2）使用直径为2 mm的圆形圈选房室交界区荧光最强处，视作AVN以测量该区域中的平均荧光强度，将圆圈外围1 mm内区域荧光视作背景荧光，计算AVN与背景荧光强度比值评估成像质量，比值越大则认为成像质量越好。
1.5 统计学分析
数据统计分析使用 SPSS 25.0 统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）完成，连续变量使用均数±标准差（x±s）描述。组间重复测量资料采用重复测量方差分析，多配对样本资料采用Friedman非参数检验进行统计分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
1.6 伦理审查
本实验获得四川大学华西医院实验动物伦理委员会审批同意，批件号：20220125001。
2 结果
2.1 房-室交界区成像
冠状窦口与三尖瓣环之间为房室交界区（图1a）。在体视荧光显微镜下，右房内房-室交界区可见一形状不规则的HCN4红色荧光信号聚集区域，沿心脏长轴径长约2 mm（图1b）。与明场重叠后可见该红色荧光聚集结构位于冠状窦口与三尖瓣环之间，紧邻三尖瓣环（图1d）。CX43绿色荧光信号在相同位置荧光信号略有聚集（图1c）。
图1
房-室交界区荧光成像图
a：明场；b：HCN4荧光信号；c：Cx43荧光信号；d：A+B叠加。SVC：上腔静脉；IVC：下腔静脉；黄色箭头：冠状窦口；黄色弧线：三尖瓣环；黄色方框示房-室交界区
在冠状窦口与三尖瓣环之间，平行三尖瓣环作一直线段，横穿红色荧光聚集区域，测定该路径中的HCN4和CX43荧光信号强度连续变化趋势（图2a）。在该路径中从左至右，Cx43荧光信号强度在1.0～2.5 mm之间出现了下降的“波谷”，而在同一区间内，HCN4荧光信号强度则相对平稳，二者变化趋势在该区间内不一致（图2b）。通过比较HCN4/Cx43荧光强度比值变化，这种差异在1.5 mm处达到最大（图2c）。这提示在该区域内存在HCN4高表达而CX43低表达的特点。
图2
选定路径HCN4与Cx43荧光信号半定量分析
a: 整体图像呈镜像翻转，蓝色直线为选定路径
2.2 组织学对比验证
为进一步探究经主动脉顺行性灌注抗体溶液后在房室交界区出现的红色荧光信号聚集结构的性质，取使用灌注法标记荧光后的大鼠心脏，沿心室长轴进行冰冻切片，显露室间隔剖面于荧光显微镜下成像（图3f），并与同一层面下的标准石蜡切片免疫荧光染色图像进行对比（图3a），分析两种荧光染色方法下的组织学特点。
图3
大鼠心脏标准石蜡切片免疫荧光染色与经主动脉灌注荧光染色冰冻切片显微图
a～e：石蜡切片；f～i：冰冻切片；b～e：A中红色方框区域放大；g～h：F中红色方框区域放大；RA：右心房；RV：右心室；LV：左心室；IVS：室间隔；黄色箭头示三尖瓣及其附着缘
在标准石蜡切片免疫荧光染色图像中，三尖瓣环上方的房室交界区心内膜下，可见一HCN4高表达而Cx43低表达的梭形区域，沿心脏长轴方向长度约2 mm，即为AVN（图3b～c，e，白圈区域）。同一层面下的冰冻切片中，三尖瓣环上方心内膜下也出现了存在同样Cx43的HCN4表达特点的结构（图3g～i，白圈区域）。该结构与荧光体式显微镜下的红色荧光信号聚集结构位置一致，均位于三尖瓣环上方且紧邻三尖瓣瓣环。
此外，通过对冰冻切片的整体观察，发现切片上存在大小及形状不一的片状荧光暗区，荧光信号呈现不均匀状态（图3f）。
2.3 剂量-荧光强度研究
当一抗（anti-HCN4）剂量为2.5 μL时，AVN及背景荧光强度分别为717.32±57.82和673.06±35.07，随着一抗剂量的增加，AVN与背景荧光强度均出现升高，后续剂量梯度组与2.5 μL组比较，均存在统计学差异（P<0.05）。3.75～7.5 μL之间出现一平台期，7.5 μL组与3.75 μL组和5 μL组比较无统计差异（P>0.05，图4）。AVN/背景荧光强度比值各组间比较变化均差异无统计学意义（P>0.05）,不同剂量抗体下，成像质量不一（图5）。
图4
不同一抗剂量下荧光强度变化趋势
与2.5 μL组比较， */#:
图5
不同一抗剂量下AVN/背景荧光变化趋势及成像图
a～c：剂量分别为2.5、5、10 μL时AVN成像图
2.4 时间-荧光强度研究
当灌注时间为1 h时，AVN及背景荧光强度分别为619.84±34.19和603.67±20.84，随着一抗灌注时间的增加，AVN与背景荧光强度均上升，抗体灌注时间越长，AVN与背景荧光强度越大，各时间梯度组间比较均具有统计学差异（P<0.05，图6）。AVN/背景荧光强度比值随灌注时间的增加而增大，除1 h组和2 h组差异无统计学意义外（P>0.05），其余各组均存在统计学差异（P<0.05），比值在研究范围内于8 h处达最大，成像质量最佳（图7）。
图6
不同一抗灌注时间荧光强度变化趋势
与1 h组比较， */#：
图7
不同一抗灌注时间AVN/背景荧光变化趋势及成像图
a～c：灌注时间分别为1、4、8 h时AVN成像图；与1 h组比较，*：
2.5 光稳定性研究
将灌注后标记荧光的心脏标本解剖后，暴露于LED台灯光照下模拟手术室无影灯光源照射，探究荧光稳定性。随光照时间的延长，AVN荧光强度出现下降趋势（P<0.05），背景荧光强度出现下降趋势（P<0.05，图8）。AVN与背景荧光强度比值随光照时间的延长变化差异无统计学意义（P>0.05），房室交界区在经过长达8 h光照后，仍能维持一定程度显影（图9）。
图8
暴露时间与荧光强度关系
图9
光照时间与AVN/背景荧光强度比值关系及成像图
a～c：光照时间分别为0、3、8 h时AVN成像图
3 讨论
研究如何减少手术中心脏传导组织的损伤对提高心脏外科手术预后具有极其重要的临床意义。过去几十年来出现了一些术中实时识别和定位CCS尝试，例如，术中使用电阻抗测量和局部心电图的方法[11-14]区分CCS及工作心肌，但其准确性不尽人意，并且有悖于心肌保护原则。近几年的最新尝试是使用光纤共聚焦显微镜（fibre-optic confocal microscopy，FCM）与直接应用于组织表面的非特异性荧光染料相结合，使用手持式FCM探头，对心内膜下的组织进行成像[10,15]。但由于激光穿透深度的限制，仅能观察位置较为表浅的SAN及AVN，而对于更为深层的结构，如AVB、BB等则不适用。
3.1 CCS经主动脉顺行性灌注抗体标记的荧光染料的成像效果
本研究通过经主动脉顺行性灌注以HCN4作为CCS特异性靶的抗体并进行荧光染色，能在体视荧光显微镜下观察到房室交界区存在红色荧信号聚集结构，该结构位于冠状窦口与三尖瓣环之间，紧邻三尖瓣环，沿心脏长轴径长约2 mm。通过对该结构中的红、绿荧光强度进行进一步的半定量分析，发现两种荧光强度变化趋势不一致，这提示在该结构内存在HCN4高表达而CX43低表达的特点，符合既往研究对CCS表型的描述[21-23]。为了进一步验证出现在房室交界区的红色荧光信号聚集结构性质，对免疫荧光染色石蜡切片和冰冻切片的图像进行了组织学对比。两种切片在相同位置均发现同样HCN4高表达而表达Cx43低表达特点的结构。综上认为，体式荧光显微镜下所见红色荧光结构即为AVN，经主动脉顺行性灌注抗体标记的荧光染料的方法能成功实现AVN的肉眼可视化。
3.2 抗体剂量和灌注时间对AVN成像质量的影响及光化学稳定性
随着抗体剂量的增加，AVN与背景荧光强度均呈现上升趋势，在3.75～7.5 μL之间可见一平台期。但随抗体剂量的增加，对成像质量的提升作用并不十分显著。而灌注时间越长，成像质量却越高。在本实验的时间梯度内（1～8 h），比值的差异持续升高而未出现峰值，这表明抗原抗体结合反应仍不完全。同时也说明在本实验中改变抗体剂量时AVN成像效果不一，可能与抗体灌注时间过短，抗体与抗原结合不充分有关。继续延长反应时间让抗原抗体反应充分，可能是进一步提升AVN成像质量的关键。
荧光染料原有的发光性可能会受损，出现荧光减弱的现象，即光漂白（photobleaching）[24]。为模拟在心内直视手术中无影灯照射的临床场景中光漂白显像的发生，使用LED台灯对经主动脉灌注标记荧光的大鼠心脏房室交接区进行持续照射。本实验中，随着光照时间的延长，AVN及背景荧光信号均呈现下降趋势，但二者下降幅度一致，因而AVN与背景荧光强度比值并未出现明显下降，在8 h的持续光照后仍维持了一定的成像效果。在先心病儿童群体中，平均体外循环时间往往需1～3 h[25-26]，光漂白实验的结果说明Alexa Fluor 633的成像性能的维持时间足够满足绝大部分心脏手术。
3.3 抗体试剂的给药方式
在心脏手术中使心脏停跳，大部分是通过在主动脉根部灌注停跳液的方式来实现的。经主动脉根部灌注的方式给药具有药物用量少和作用范围局限，不进入全身血液循环的优点，因此本实验设计之初选用此种方式进行给药。但根据本实验的实验结果，抗原抗体充分结合以达到最佳成像效果的时间较长，远远超过了心脏手术本身的时间。此外，由于长时间的灌注，容易出现灌注不均匀的现象。因此，在活体动物中使用特异性抗体标记的荧光染料对CCS进行染色时，经主动脉给药并不是合适的方法。但是，目前已有研究通过静脉注射抗体标记的荧光染料的方法，成功实现了活体动物肿瘤病灶的实时荧光成像，并用于指导肿瘤病灶的完整切除[16-18]。经静脉给药的方式更为简单，但抗体制剂的用量可能更大，在CCS活体荧光成像领域有待进一步研究。
3.4 创新性及局限性
本研究创新性地以HCN4作为CCS特异性靶点并进行荧光染色，成功在大标本中实现了AVN的可视化，初步证明了使用特异性抗体标记的荧光染料的可行性。本研究仍存在一定局限性。本研究使用标本为离体的大鼠心脏，并进行醛固定操作，BSA进行封闭，以及一抗和二抗进行荧光染色，处理过程繁杂、耗时长，在活体动物中抗体与CCS的结合能力以及成像效果未知。在圈选目标区域测定AVN及背景荧光强度时，其位置仅为大致范围，测定数据并不精确，可能使实验结果不准确。LED台灯和无影灯的发光强度之间有较大的差距，用LED台灯代替无影灯模拟光漂白显像的发生，不足以模拟真实临床场景，需要进一步研究。此外，本实验样本量少，可能造成实验结果的偏差。
3.5 展望
本研究目前处于相对早期的阶段，使用标本为离体标本，并未在活体动物上进行荧光成像，使用抗体标记的荧光染料进行CCS成像在活体动物中的成像效果以及临床适用性仍有待探讨。本研究是对CCS活体荧光成像领域的一次初步的探索，初步证明了使用特异性抗体标记的荧光染料的可行性。利用特异性靶点的方法在CCS可视化领域具有广阔的临床转化前景。
本研究在体视荧光显微镜下，经主动脉顺行性灌注抗体标记的荧光染料（Alexa Fluor 633）能成功对离体大鼠心脏CCS中的AVN进行成像。实验结果表明：抗体剂量的增加，对AVN成像效果的影响并不显著；抗体灌注时间越长，AVN的成像效果越好；Alexa Fluor 633在长时间（8 h）暴露于光照后，仍能维持一定的AVN显影。
利益冲突：无。
作者贡献：任一飞参与实验实施、文章撰写和修改；于锴参与实验设计和文章撰写；干昌平对实验的相关内容进行指导和进行论文修改。
心脏传导系统（cardiac conduction system，CCS）是由特殊的心脏细胞组成，它们通过协调房室收缩来建立心脏的有律性跳动，其结构结构包括窦房结（sinoatrial node，SAN）、房室结（atrioventricular node，AVN）、房室束（atrioventricular bundle，AVB)、左右束支（bundle branch，BB）及浦肯野纤维（Purkinje fiber，PF）。由于CCS无法用肉眼识别，只能经验性地借助一些解剖学标志来判断CCS位置[1-3]，因此在心内直视手术中常常被意外损伤，诱发心律失常。其中，传导阻滞是最严重的心律失常类型，特别是在先心病的手术中[4-7]。这不仅会延长住院时间，而且存在植入起搏器的风险，给患者造成额外的痛苦和花费，同时会降低生活质量[8-9]。
为了减少手术中心脏传导组织的损伤对提高心脏外科手术预后，既往研究[10-15]做了不少尝试，但因准确性较差、显像不充分而应用受限。活体荧光成像技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，将荧光染料标记上特异性抗体，来实现特定组织的特异性荧光显像，常用于外科术中定位[16-18]。超极化激活的环核苷酸门控阳离子电流通道蛋白 4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN4），是一种表达于膜表面离子通道蛋白，在传导细胞和非传导细胞中差异性表达，常作为组织切片免疫荧光的特异性靶点[19-20]。另外，连接蛋白（connexin，Cx）参与构成心肌细胞间的缝隙连接，不同亚型在不同心肌中表达存在差异：在SAN及AVN中观察到Cx45高表达，Cx43低表达，在心房肌中Cx43大量表达Cx45低表达，Cx43常作为工作心肌的标记物[19-20]。以上标志物的表达差异，为其在CCS显像中的应用提供了可能。
本研究拟利用HCN4作为CCS特异性靶点，使用针对该靶点荧光染料标记的抗体，通过模拟真实手术主动脉顺行性灌注过程，对CCS的术中实时可视化方法的可行性及成像效果进行了初步的探究。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂
Mouse anti-connexin 43（Santa Cruz，美国）；rabbit anti-HCN4（博奥森，中国）；goat anti-mouse IgG（Alexa Fluor 405）（Thermo Fisher，美国）；goat anti-rabbit IgG（Alexa Fluor 633）（Thermo Fisher，美国）；goat anti-mouse IgG（TRITC）（Jackson，美国）；goat anti-rabbit IgG（Alexa Fluor 647）（Jackson，美国）；DAPI溶液（索莱宝，中国）。
1.2 主要实验仪器
荧光体视显微镜（Leica M205 FCA，德国）；数字切片扫描仪（Olympus，日本）；图像处理软件（Leica，德国）；OLYMPUS（Olympus，日本）。
1.3 实验动物
雄性SPFSD大鼠，9～11周龄，体重350～400 g，购自成都达硕实验动物有限公司，均在四川大学华西临床医学院/华西医院实验动物中心动物房进行饲养。实验动物的饲养和处理遵循美国国立卫生研究院“护理和使用实验室动物指南”（NIH Publication No.85-23）。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-0030。
1.4 实验方法
1.4.1 离体大鼠心脏主动脉顺行性灌注模型构建及预处理
使用异氟烷麻醉33只大鼠后，尾静脉注射肝素钠（100 IU/kg）全身肝素化。使用解剖剪逐层打开胸腔充分暴露心脏，迅速离断各大血管（保留一定长度主动脉），完整取下大鼠心脏，使用预先准备的冰肝素钠-生理盐水稀释液（12 500 U/100 mL）冲洗。将22G留置针经断端插入主动脉近端管腔内并固定。排气后将留置针通过输液延长管连接注射器后固定于微量泵，以4 mL/min经主动脉-冠脉顺行性灌注冰肝素-生理盐水稀释液，直至灌出液无明显红色。使用4%多聚甲醛溶液以4 mL/min灌注固定心脏10 min，PBS溶液（pH 7.2～7.4）灌洗30 min；5%BSA溶液以1 mL/min灌注封闭50 min，PBS溶液灌洗30 min，用于后续经主动脉灌注抗体溶液实验。后续需石蜡切片免疫荧光实验的心脏标本，使用4%多聚甲醛溶液以4 mL/min灌注固定心脏30 min后，浸泡于4%多聚甲醛溶液中4℃固定72 h。
1.4.2 剂量-荧光强度研究
一抗（rabbit anti-HCN4/Mouse anti-connexin 43）稀释液灌注4 h后PBS灌洗30 min，二抗[goat anti-rabbit IgG（Alexa Fluor 633）/goat anti-mouse IgG（Alexa Fluor 405）]稀释液灌注2 h后PBS灌洗30 min，流量固定为1 mL/min。使用体视荧光显微镜拍摄观察。设置5组灌注剂量梯度，每组3只大鼠：一抗原液剂量2.5 μL/5μL，3.75 μL/7.5μL，5 μL/10μL，7.5 μL/15μL，10 μL/20μL。针对HCN4的一抗与二抗原液体积比例固定为1∶2，针对Cx43的一抗与二抗原液体积比例固定为1∶1。
1.4.3 时间-荧光强度研究
先后取剂量梯度为5 μL/10μL一抗原液稀释液和10 μL/10μL二抗原液稀液灌注心脏，流量固定为1 mL/min。设置5组灌注时间梯度，每组3只大鼠：1 h/0.5 h，2 h/1 h，4 h/2 h，6 h/3 h，8 h/4 h。后使用体视荧光显微镜拍摄观察。
1.4.4 光化学稳定性研究
先后取剂量梯度为5 μL/10μL一抗原液稀释液和10 μL/10μL二抗原液稀液灌注3只大鼠心脏，流量固定为1 mL/min。灌注时间梯度设置为：4 h/2 h。灌注完成后解剖右心房及右室，暴露房室交界区心内膜面，使用LED台灯连续光照，并分别在0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h后使用体视荧光显微镜拍摄观察。
1.4.5 组织学对比验证
为验证离体大鼠心脏经主动脉顺行性灌注抗体溶液后体视荧光显微镜下显影结构的性质，将灌注后的大鼠心脏制作为冰冻切片，并取同一层面下石蜡切片进行标准的免疫荧光染色，于荧光显微镜下进行观察比对。
将灌注后的大鼠心脏制作为冰冻切片，并取同一层面下石蜡切片进行标准的免疫荧光染色，于荧光显微镜下进行观察比对。冰冻切片及石蜡切片使用Olympus VS200数字切片扫描仪采集图像，图像使用OLYMPUS OlyVIA V3.4.1软件分析处理，石蜡切片与冰冻切片HCN4荧光信号设置为红色，Cx43荧光信号设置为绿色。根据荧光强弱分析组织中HCN4与Cx43表达差异，传导组织表达特定为HCN4高表达，Cx43低表达，以此标准识别传导组织。
1.4.6 CCS荧光成像的分析
由于预实验中CCS中的其它成分可视化效果不佳，并未按预期出现SAN、AVN下级的分支AVB和BB的显影。故灌注完成后使用标本针固定大鼠心脏，解剖后置于荧光体式显微镜下，只观察AVN：房-室交界区，并采集图像。采集图像后使用Leica Application Suite X软件分析处理。房室交界区半定量荧光分析：（1）在冠状窦与三尖瓣环之间，平行三尖瓣环作一直线段，横穿红色荧光聚集区域，测定该直线段路径中的HCN4和Cx43荧光信号强度变化趋势，在该直线段上每间隔0.1 mm计算HCN4/Cx43荧光强度比值，评估两种荧光信号的差异性大小。（2）使用直径为2 mm的圆形圈选房室交界区荧光最强处，视作AVN以测量该区域中的平均荧光强度，将圆圈外围1 mm内区域荧光视作背景荧光，计算AVN与背景荧光强度比值评估成像质量，比值越大则认为成像质量越好。
1.5 统计学分析
数据统计分析使用 SPSS 25.0 统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）完成，连续变量使用均数±标准差（x±s）描述。组间重复测量资料采用重复测量方差分析，多配对样本资料采用Friedman非参数检验进行统计分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
1.6 伦理审查
本实验获得四川大学华西医院实验动物伦理委员会审批同意，批件号：20220125001。
2 结果
2.1 房-室交界区成像
冠状窦口与三尖瓣环之间为房室交界区（图1a）。在体视荧光显微镜下，右房内房-室交界区可见一形状不规则的HCN4红色荧光信号聚集区域，沿心脏长轴径长约2 mm（图1b）。与明场重叠后可见该红色荧光聚集结构位于冠状窦口与三尖瓣环之间，紧邻三尖瓣环（图1d）。CX43绿色荧光信号在相同位置荧光信号略有聚集（图1c）。
图1
房-室交界区荧光成像图
a：明场；b：HCN4荧光信号；c：Cx43荧光信号；d：A+B叠加。SVC：上腔静脉；IVC：下腔静脉；黄色箭头：冠状窦口；黄色弧线：三尖瓣环；黄色方框示房-室交界区
在冠状窦口与三尖瓣环之间，平行三尖瓣环作一直线段，横穿红色荧光聚集区域，测定该路径中的HCN4和CX43荧光信号强度连续变化趋势（图2a）。在该路径中从左至右，Cx43荧光信号强度在1.0～2.5 mm之间出现了下降的“波谷”，而在同一区间内，HCN4荧光信号强度则相对平稳，二者变化趋势在该区间内不一致（图2b）。通过比较HCN4/Cx43荧光强度比值变化，这种差异在1.5 mm处达到最大（图2c）。这提示在该区域内存在HCN4高表达而CX43低表达的特点。
图2
选定路径HCN4与Cx43荧光信号半定量分析
a: 整体图像呈镜像翻转，蓝色直线为选定路径
2.2 组织学对比验证
为进一步探究经主动脉顺行性灌注抗体溶液后在房室交界区出现的红色荧光信号聚集结构的性质，取使用灌注法标记荧光后的大鼠心脏，沿心室长轴进行冰冻切片，显露室间隔剖面于荧光显微镜下成像（图3f），并与同一层面下的标准石蜡切片免疫荧光染色图像进行对比（图3a），分析两种荧光染色方法下的组织学特点。
图3
大鼠心脏标准石蜡切片免疫荧光染色与经主动脉灌注荧光染色冰冻切片显微图
a～e：石蜡切片；f～i：冰冻切片；b～e：A中红色方框区域放大；g～h：F中红色方框区域放大；RA：右心房；RV：右心室；LV：左心室；IVS：室间隔；黄色箭头示三尖瓣及其附着缘
在标准石蜡切片免疫荧光染色图像中，三尖瓣环上方的房室交界区心内膜下，可见一HCN4高表达而Cx43低表达的梭形区域，沿心脏长轴方向长度约2 mm，即为AVN（图3b～c，e，白圈区域）。同一层面下的冰冻切片中，三尖瓣环上方心内膜下也出现了存在同样Cx43的HCN4表达特点的结构（图3g～i，白圈区域）。该结构与荧光体式显微镜下的红色荧光信号聚集结构位置一致，均位于三尖瓣环上方且紧邻三尖瓣瓣环。
此外，通过对冰冻切片的整体观察，发现切片上存在大小及形状不一的片状荧光暗区，荧光信号呈现不均匀状态（图3f）。
2.3 剂量-荧光强度研究
当一抗（anti-HCN4）剂量为2.5 μL时，AVN及背景荧光强度分别为717.32±57.82和673.06±35.07，随着一抗剂量的增加，AVN与背景荧光强度均出现升高，后续剂量梯度组与2.5 μL组比较，均存在统计学差异（P<0.05）。3.75～7.5 μL之间出现一平台期，7.5 μL组与3.75 μL组和5 μL组比较无统计差异（P>0.05，图4）。AVN/背景荧光强度比值各组间比较变化均差异无统计学意义（P>0.05）,不同剂量抗体下，成像质量不一（图5）。
图4
不同一抗剂量下荧光强度变化趋势
与2.5 μL组比较， */#:
图5
不同一抗剂量下AVN/背景荧光变化趋势及成像图
a～c：剂量分别为2.5、5、10 μL时AVN成像图
2.4 时间-荧光强度研究
当灌注时间为1 h时，AVN及背景荧光强度分别为619.84±34.19和603.67±20.84，随着一抗灌注时间的增加，AVN与背景荧光强度均上升，抗体灌注时间越长，AVN与背景荧光强度越大，各时间梯度组间比较均具有统计学差异（P<0.05，图6）。AVN/背景荧光强度比值随灌注时间的增加而增大，除1 h组和2 h组差异无统计学意义外（P>0.05），其余各组均存在统计学差异（P<0.05），比值在研究范围内于8 h处达最大，成像质量最佳（图7）。
图6
不同一抗灌注时间荧光强度变化趋势
与1 h组比较， */#：
图7
不同一抗灌注时间AVN/背景荧光变化趋势及成像图
a～c：灌注时间分别为1、4、8 h时AVN成像图；与1 h组比较，*：
2.5 光稳定性研究
将灌注后标记荧光的心脏标本解剖后，暴露于LED台灯光照下模拟手术室无影灯光源照射，探究荧光稳定性。随光照时间的延长，AVN荧光强度出现下降趋势（P<0.05），背景荧光强度出现下降趋势（P<0.05，图8）。AVN与背景荧光强度比值随光照时间的延长变化差异无统计学意义（P>0.05），房室交界区在经过长达8 h光照后，仍能维持一定程度显影（图9）。
图8
暴露时间与荧光强度关系
图9
光照时间与AVN/背景荧光强度比值关系及成像图
a～c：光照时间分别为0、3、8 h时AVN成像图
3 讨论
研究如何减少手术中心脏传导组织的损伤对提高心脏外科手术预后具有极其重要的临床意义。过去几十年来出现了一些术中实时识别和定位CCS尝试，例如，术中使用电阻抗测量和局部心电图的方法[11-14]区分CCS及工作心肌，但其准确性不尽人意，并且有悖于心肌保护原则。近几年的最新尝试是使用光纤共聚焦显微镜（fibre-optic confocal microscopy，FCM）与直接应用于组织表面的非特异性荧光染料相结合，使用手持式FCM探头，对心内膜下的组织进行成像[10,15]。但由于激光穿透深度的限制，仅能观察位置较为表浅的SAN及AVN，而对于更为深层的结构，如AVB、BB等则不适用。
3.1 CCS经主动脉顺行性灌注抗体标记的荧光染料的成像效果
本研究通过经主动脉顺行性灌注以HCN4作为CCS特异性靶的抗体并进行荧光染色，能在体视荧光显微镜下观察到房室交界区存在红色荧信号聚集结构，该结构位于冠状窦口与三尖瓣环之间，紧邻三尖瓣环，沿心脏长轴径长约2 mm。通过对该结构中的红、绿荧光强度进行进一步的半定量分析，发现两种荧光强度变化趋势不一致，这提示在该结构内存在HCN4高表达而CX43低表达的特点，符合既往研究对CCS表型的描述[21-23]。为了进一步验证出现在房室交界区的红色荧光信号聚集结构性质，对免疫荧光染色石蜡切片和冰冻切片的图像进行了组织学对比。两种切片在相同位置均发现同样HCN4高表达而表达Cx43低表达特点的结构。综上认为，体式荧光显微镜下所见红色荧光结构即为AVN，经主动脉顺行性灌注抗体标记的荧光染料的方法能成功实现AVN的肉眼可视化。
3.2 抗体剂量和灌注时间对AVN成像质量的影响及光化学稳定性
随着抗体剂量的增加，AVN与背景荧光强度均呈现上升趋势，在3.75～7.5 μL之间可见一平台期。但随抗体剂量的增加，对成像质量的提升作用并不十分显著。而灌注时间越长，成像质量却越高。在本实验的时间梯度内（1～8 h），比值的差异持续升高而未出现峰值，这表明抗原抗体结合反应仍不完全。同时也说明在本实验中改变抗体剂量时AVN成像效果不一，可能与抗体灌注时间过短，抗体与抗原结合不充分有关。继续延长反应时间让抗原抗体反应充分，可能是进一步提升AVN成像质量的关键。
荧光染料原有的发光性可能会受损，出现荧光减弱的现象，即光漂白（photobleaching）[24]。为模拟在心内直视手术中无影灯照射的临床场景中光漂白显像的发生，使用LED台灯对经主动脉灌注标记荧光的大鼠心脏房室交接区进行持续照射。本实验中，随着光照时间的延长，AVN及背景荧光信号均呈现下降趋势，但二者下降幅度一致，因而AVN与背景荧光强度比值并未出现明显下降，在8 h的持续光照后仍维持了一定的成像效果。在先心病儿童群体中，平均体外循环时间往往需1～3 h[25-26]，光漂白实验的结果说明Alexa Fluor 633的成像性能的维持时间足够满足绝大部分心脏手术。
3.3 抗体试剂的给药方式
在心脏手术中使心脏停跳，大部分是通过在主动脉根部灌注停跳液的方式来实现的。经主动脉根部灌注的方式给药具有药物用量少和作用范围局限，不进入全身血液循环的优点，因此本实验设计之初选用此种方式进行给药。但根据本实验的实验结果，抗原抗体充分结合以达到最佳成像效果的时间较长，远远超过了心脏手术本身的时间。此外，由于长时间的灌注，容易出现灌注不均匀的现象。因此，在活体动物中使用特异性抗体标记的荧光染料对CCS进行染色时，经主动脉给药并不是合适的方法。但是，目前已有研究通过静脉注射抗体标记的荧光染料的方法，成功实现了活体动物肿瘤病灶的实时荧光成像，并用于指导肿瘤病灶的完整切除[16-18]。经静脉给药的方式更为简单，但抗体制剂的用量可能更大，在CCS活体荧光成像领域有待进一步研究。
3.4 创新性及局限性
本研究创新性地以HCN4作为CCS特异性靶点并进行荧光染色，成功在大标本中实现了AVN的可视化，初步证明了使用特异性抗体标记的荧光染料的可行性。本研究仍存在一定局限性。本研究使用标本为离体的大鼠心脏，并进行醛固定操作，BSA进行封闭，以及一抗和二抗进行荧光染色，处理过程繁杂、耗时长，在活体动物中抗体与CCS的结合能力以及成像效果未知。在圈选目标区域测定AVN及背景荧光强度时，其位置仅为大致范围，测定数据并不精确，可能使实验结果不准确。LED台灯和无影灯的发光强度之间有较大的差距，用LED台灯代替无影灯模拟光漂白显像的发生，不足以模拟真实临床场景，需要进一步研究。此外，本实验样本量少，可能造成实验结果的偏差。
3.5 展望
本研究目前处于相对早期的阶段，使用标本为离体标本，并未在活体动物上进行荧光成像，使用抗体标记的荧光染料进行CCS成像在活体动物中的成像效果以及临床适用性仍有待探讨。本研究是对CCS活体荧光成像领域的一次初步的探索，初步证明了使用特异性抗体标记的荧光染料的可行性。利用特异性靶点的方法在CCS可视化领域具有广阔的临床转化前景。
本研究在体视荧光显微镜下，经主动脉顺行性灌注抗体标记的荧光染料（Alexa Fluor 633）能成功对离体大鼠心脏CCS中的AVN进行成像。实验结果表明：抗体剂量的增加，对AVN成像效果的影响并不显著；抗体灌注时间越长，AVN的成像效果越好；Alexa Fluor 633在长时间（8 h）暴露于光照后，仍能维持一定的AVN显影。
利益冲突：无。
作者贡献：任一飞参与实验实施、文章撰写和修改；于锴参与实验设计和文章撰写；干昌平对实验的相关内容进行指导和进行论文修改。
