心脏黏液瘤是心脏最常见的原发性肿瘤。心脏黏液瘤分为散发性黏液瘤（sporadic cardiac myxoma，SM）和以心脏黏液瘤为局部表现的卡尼复合征（Carney complex，CNC）两种类型。该病以左心房多见（74.2%），其次为右心房（15%～28%）、右心室（8%）、左心室（3%～4%）[1]。而累及瓣膜的黏液瘤极其罕见（＜1%），其中二尖瓣最常受累[2]。根据文献[3]报道，已经发现了34个参与心脏黏液瘤发生、发展的蛋白标志物。这些标志物在多种功能上相互重叠（如心脏、肌肉、上皮、外胚层、表皮、骨骼肌、骨化、骨骼化的生发，细胞增殖、粘附、迁移，内皮向间充质细胞转化，以及血管生成和向间充质细胞、神经细胞和肌肉细胞分化过程等），并通过信号通路（如G蛋白偶联受体、TGF受体、VEGF受体、MAP激酶、生长受体信号通路、细胞因子受体和细胞因子信号通路）发挥作用。
该病虽属良性肿瘤，但有一定的复发率，复发原因可能与以下4方面因素有关：肿瘤切除不完全、肿瘤呈多克隆起源、家族性肿瘤和转移性复发[4]。同时，心脏黏液瘤具有一定的恶性转化倾向[5]，多表现为蛋白MI表达升高和S100蛋白表达的改变，这两个蛋白的表达变化都是黑色素瘤预后不良的标志，也与心脏黏液瘤的恶性转化相关[3]。总之，心脏黏液瘤的生物学特性还不清楚，有待进一步研究。本研究将通过对心脏黏液瘤组织进行全基因组测序，对心脏黏液瘤基因行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）及拷贝数异常（copy number variation，CNV）检测，找到参与肿瘤发生中可能存在重要作用的SNP位点及CNV事件。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
随机选取2015—2019年泰州人民医院收治的心脏黏液瘤患者。患者纳入标准：（1）签署知情同意书；（2）术后所有肿瘤标本同时经两名以上病理医师作出病理诊断，均明确诊断为心脏黏液瘤；（3）年龄≥18岁。排除标准：（1）术前诊断其他肿瘤；（2）器官移植术后或造血干细胞移植术后患者；（3）有家族遗传病；（4）染色体病患者。纳入样本肿瘤最大直径3～12 cm，平均5.7 cm。本研究按照平均肿瘤最大直径将纳入样本分为2组，即直径≤5.7 cm组（A组）和直径>5.7 cm组（B组）。
1.2 方法
1.2.1 心脏肿瘤组织DNA提取
术中直接提取黏液瘤组织，液氮保存待检。取60 mg心脏黏液瘤和正常对照的组织打碎处理为组织悬液，将组织裂解后，使用DNA提取试剂盒（离心吸附柱法）提取心脏肿瘤组织DNA。
1.2.2 DNA文库构建
使用 Covaris™ 系列 DNA 超声破碎仪将样本片段化至150～350 bp，利于杂交捕获。将这些DNA片段进行末端修复，并向3’端加上腺嘌呤（A）后进行接头连接反应，然后筛选片段，并用PCR仪对片段进行扩增。检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit进行建库。用Qubit对文库进行定量，用Bioanalyzer（Agilent）、Qsep100（Bioptic）等相关片段分析仪器进行文库片段分布检测。构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。文库构建原理见图1。
图1
cDNA文库纯化、定量和质量检测流程图
1.2.3 测序
文库检质量检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。
1.2.4 生物信息学分析流程及筛选条件
我们采用GATK，SnpEff进行个体SNP的检测与注释。通过cnvkit等进行检测，即通过基因组上不同的阅读覆盖深度，判断潜在的变异和丢失。筛选条件为：测序深度Depth>10，等位基因的频率>0.01，覆盖该位点variant基因型的reads数之和>4，外显子组整合数据库（the Exome Aggregation Consortium）中该位点的等位基因的频率<0.01，千人基因组数据库中该位点的等位基因的频率<0.01，Filter：PASS或germline_risk。
1.2.5 软件列表
分析涉及到的软件见表1。
表1
生物信息学分析软件表
1.2.6 统计学分析
采用 IBM SPSS Statistics 25 软件处理数据。基因互斥性分析采用费舍尔精确检验，组间比较采用配对ｔ检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
1.2.7 伦理审查
本研究经我院医学伦理委员会审批，批准号：2019KY-079，同时取得患者书面知情同意。
2 结果
2.1 患者一般资料
共纳入14例心脏黏液瘤患者，其中女8例、男6例，年龄41～79岁，平均61.4岁。男性平均身高168.3 cm，平均体重71.5 kg；女性平均身高158.8 cm，平均体重57.6 kg。12例患者粘液瘤发生于左心房，其中11例肿瘤瘤蒂位于房间隔，1例瘤蒂位于左房壁；另外2例患者发生于右心房，瘤蒂均位于房间隔。
2.2 心脏肿瘤样本SNP检测
14个样本中共检测到43877个突变位点，其中单样本突变位点最多为3645个（样本号12），最少为2546个（样本号2），中位数为3312个，符合正态分布。去除内含子以及突变位点样本数为1的位点后，剩余不同的突变位点共4 052个，共对应基因2784个。再与OncoKB、KEGG数据库联合对比分析，共发现217个基因与数据库中的肿瘤基因重合，其中有37个基因与2个数据库的肿瘤基因均有交集（图2），我们认为这37个交集基因是关键的肿瘤基因。
图2
与数据库联合对比分析
2784个对应基因与OncoKB、KEGG数据库联合对比分析共发现217个基因与数据库中的肿瘤基因重合，其中37个基因与2个数据库的肿瘤基因重合，蓝色为检测到的SNP基因，绿色为Oncobe数据库，红色为KEGG数据库
2.3 与肿瘤相关基因的SNP位点
将37个肿瘤基因的所有位点信息进一步筛选后（去除可能良性，单点的突变），发现在14例标本中突变发生次数≥2的位点有18个；见表2。其中AXIN1和GLI1的突变率最高，为35.7%。CREB蛋白的亚基突变频率为28.5%，其他基因位点的突变率在14.2%～21.4%。
表2
18个肿瘤基因SNP位点信息
2.4 肿瘤基因共现性和互斥性
37个肿瘤基因在14例心脏肿瘤样本中的共现性和互斥性关系如下，图3表示两肿瘤基因的共现性或互斥性具有显著意义的关系。表3是37个肿瘤基因具有显著性统计学意义的共现互斥基因。
图3
两肿瘤基因之间共现性或互斥性示意图
表3
37个肿瘤基因中具有统计学意义的共现互斥基因
2.5 肿瘤相关性的基因网络关系
肿瘤可能相关的37个基因中有36个基因具有相互作用，其蛋白质相互作用网络分析显示：TP53、EP300、CREBBP起着核心连结作用。3个基因的突变率分别为：TP53和EP300突变率14%，CREBBP突变率28%；见图4。
图4
肿瘤相关性基因交互作用图
TP53、EP300、CREBBP起着核心连结作用，TP53和EP300突变率为14%，CREBBP突变率为28%
2.6 GO富集及KEGG通路分析结果
对肿瘤相关的217个基因做了GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析结果显示，217个肿瘤相关的基因主要参与蛋白分泌的调控、肽链分泌调控、组氨酸修饰、共价染色质修饰等过程；见图5a。KEGG信号通路富集结果显示，217个肿瘤相关的基因主要参与了癌症通路、PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路等；见图5b。与蛋白互作网络分析结果符合，提示PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路在黏液瘤发生中起重要作用。
图5
GO和KEGG富集分析结果
a：217个肿瘤相关基因GO富集结果；b：217个肿瘤相关基因KEGG的信号通路分析结果；除综合的肿瘤信号通路存在显著性差异外，PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路也存在显著差异
2.7 新肿瘤相关基因的SNP位点
14个样本中筛选出新突变位点4120个，经查找筛选出肿瘤相关的基因145个。突变率较高的肿瘤相关基因的位点，也是新发现的突变位点，暂无无突变位点ID的RS号，在染色体上的具体位置见表4。
表4
突变率较高的新肿瘤相关基因的位点
2.8 样本CNV数据
在14个心脏肿瘤样本的CNV检测中共发现4498个CNV事件，其中拷贝丢失3260条，拷贝数增加1238条，共包含1070个基因。在所有CNV中检测到拷贝数丢失基因共786个，其中93个在OncoKB或KEGG肿瘤数据库中。CNV中检测到拷贝数增加基因共284个，其中27个在OncoKB或KEGG肿瘤数据库中。120个肿瘤基因的生物学功能信息如图6a所示。再与OncoKB，KEGG两个数据库联合对比分析，10个基因均与2个数据库的肿瘤基因有交集：AR、FGFR4、RXRA、NOTCH1、GLI1、PML、NOTCH3、IRS2、PIK3CD、RB1（图6b），我们认为这10个交集基因是关键的肿瘤基因。
图6
生物学功能分析及与数据库重合度分析
a：120个肿瘤基因的生物学功能分析结果；b：120个肿瘤基因与OncoKB数据库或KEGG数据库重合度，其中10个基因与两个数据库的肿瘤基因均有交集
2.9 GO和KEGG富集结果
对120个肿瘤相关的CNV基因做了富集分析，微管发生以及细胞增殖调控等细胞功能的富集结果存在显著差异；见图7a。KEGG的信号通路富集结果显示，除了综合的肿瘤信号通路存在显著差异外，人乳头瘤病毒感染信号通路和粘着斑信号通路也存在差异；见图7b。
图7
GO富集分析及KEGG富集分析
a：120个肿瘤相关CNV基因GO富集结果；b：120个肿瘤相关CNV基因的KEGG信号通路富集结果
2.10 不同肿瘤直径大小组基因SNP位点及CNV差异基因比较
将检测到SNP的肿瘤基因样本进行组间比较，两组间检测样本差异均无统计学意义（P>0.05），其中5个基因位点差异相对较大，分别为NIN、FN1、RELN、NFATC1、STK11；见表5。
表5
5个基因SNP位点组间比较结果
将检测到CNV的肿瘤基因检测样本进行组间比较，发现两组样本ERCC6L与INTS6L基因差异有统计学意义（P=0.030），其余8个基因CNV的检测样本差异无统计学意义（P>0.05）；见表6。
表6
肿瘤基因CNV的检测样本进行组间比较结果
3 讨论
针对心脏黏液瘤的治疗，目前国内外最主流的治疗方式仍然是外科手术切除。尤其对于已经发生严重并发症或有高危倾向的黏液瘤患者，应当积极选择手术治疗。主要的手术方式为胸骨正中切开后经股动静脉-上腔静脉插管、主动脉-上腔静脉插管或上下腔静脉直角管插管建立体外循环，于深低温停循环下心脏切开取瘤。心脏黏液瘤虽属良性肿瘤，但有一定的复发率。多中心远期随访数据中，散发性心脏黏液瘤切除后复发率约为1%～5%，而家族性CNC复发率占12%。阜外医院对1990年后224例患者进行长期有效随访，黏液瘤复发8例，复发率3.6%；他们认为复发可能与以下因素有关：肿瘤切除不完全、肿瘤呈多克隆起源、家族性肿瘤和转移性复发。由此可见，心脏黏液瘤生物学特性还有待进一步研究。
本研究通过对14个心脏黏液瘤患者的肿瘤样本进行二代全外显子测序分析，共检测到突变位点43877个，去除内含子后存在4052个不同的突变位点。217个基因与OncoKB、KEGG数据库中的肿瘤基因重合。并且通过进一步筛选，发现37个重要的肿瘤基因突变位点；在14样本中突变位点发生个数≥2个的有18个。
在这些突变位点中，AXIN1和GLI1的突变率最高，为35.7%。AXIN1基因是抑癌基因AXIN家族一员，是一种多功能的构架蛋白，参与Wnt、JNK、TGF-beta等多种信号通路传导途径从而调控细胞增殖分化凋亡等调节过程。有研究[13]表明在恶性肿瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌等疾病中，AXIN1的表达存在异常，这与我们基因富集的信号通路结果一致，表明AXIN1与多种恶性肿瘤呈密切相关性，但是在良性肿瘤如黏液瘤中却没有任何相关研究报道，所以本研究中突变发生率35.7%的AXIN1基因与心脏黏液瘤的发生发展是否有相关性还有待进一步研究。此外在14个样本中，我们发现AXIN2和ARID1B基因存在的共现性。ARID1B是一种富含AT碱基且编码SWI/SNF复合体结构域蛋白的基因，其功能是通过水解ATP重塑染色质进而调控细胞增殖分化。有研究[14-16]在多类肿瘤组织中发现ARID1B的突变及蛋白表达水平异常，我们在14个样本中发现有3个样本包含了5个ARID1B基因突变位点，但是突变位点没有重复性，因此AXIN2和ARID1B的共现性是巧合还是必然，还有待加大数据量后进一步证明。AXIN2除了与ARID1B的具有共现性外，其与FGFR4也存在显著共现性（P=0.032），成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）又称为CD334，是人体中由FGFR4基因编码的蛋白质，蛋白质的细胞外部分与成纤维细胞生长因子相互作用，启动下游信号的级联反应，最终影响有丝分裂发生和分化。虽然其特异性功能未知，但该基因在妇科肿瘤样本中过表达，提示该基因在乳腺和卵巢肿瘤发生中发挥作用[17-19]。而值得关注的是，在本研究中，仅有的2例FGFR4的SNP突变患者性别是男性，提示FGFR4的表达改变不仅仅存在于在女性恶性肿瘤中。
GLI1编码是锌指蛋白Kruppel家族的成员，编码的转录因子经信号转导级联激活并调节干细胞增殖。这种蛋白的活性和核定位在抑制环中被TP53负调控。国内学者[20]发现在汉族人群中GLI1基因的位点突变在慢性淋巴性白血患者者中有多态性，本研究发现5例患者GIL1基因的rs3216740发生突变。故心脏黏液瘤患者GLI1基因的位点是否也具有多态性还有待进一步验证。在本研究中同样发现仅有的2例TP53基因突变患者其GLI1基因也发生了突变，此外这2例患者的CREB3L2、NFATC2基因的SP也发生了相同突变，突变率分别为28.5%和21.3%。TP53又称P53，该基因编码一种包含转录激活、DNA结合和寡聚结构域的肿瘤抑制蛋白。编码的蛋白响应不同的细胞压力，调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢变化[21]。该基因的突变与多种人类癌症有关[22-24]。CREB3L2基因编码oasis bZIP转录因子家族成员，这个家族的成员可以形成同二聚体，编码的蛋白质是一种转录激活物。在很多肿瘤中，7号染色体上的该基因和16号染色体上的肉瘤融合基因之间存在易位[25-26]。NFATC2基因是活化T细胞（NFAT）家族的核心因子之一，该基因的产物是一个具有rel同源区（rhr）和nfat同源区（nhr）的DNA结合蛋白。该蛋白存在于胞浆中，在T细胞受体（TCR）刺激下仅向细胞核转运，成为活化T细胞转录复合物的核因子之一。这种复合物在免疫应答过程中对诱导基因转录起中心作用，并已鉴定出编码不同亚型的交替转录剪接变体[27]。NFATC2中的rs12479626的T/C突变虽然在ClinVav中目前还有没有报道，但是在COSMIC肿瘤数据库的注释中已被认为是有致病可能性的。共现和互斥关联分析结果显示，NFATC2与TP53存在共现性（P=0.032）。有研究[28]显示，通过抑制NFAT1信号通路可调控TP53相关的肿瘤细胞活性，起到抑制肿瘤的作用。这与我们的SNP检测结果和共现性分析结果一致，提示NFATC2可能通过改变NFAT1结构或表达水平与TP53共同调控肿瘤细胞的发生。
在14个样本中我们发现2例患者的BCR的rs372013175位点发生了外显子移码突变。移码突变是是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变。移码突变所造成的DNA损伤一般远大于点突变。另外BCR是重要的肿瘤基因，在血样检测中，BCR-ABL融合基因是鉴定白血病的重要标志基因[29]，但是在其他肿瘤中并没有相关报道。而本研究中BCR基因发生的外显子移码突变究竟是否参与心脏肿瘤中发生亦或是偶然情况，这一点还无法通过测序或者已有的相关研究得出结论，因此在之后的研究中需要更深入关注。
此外，我们对本次研究中所有突变位点相关的肿瘤基因做了富集分析和蛋白互作网络分析。KEGG富集结果显示，诸多基因调控通路存在显著差异，其中包括蛋白分泌调控通路和多肽分泌调控通路，这表示所检测的肿瘤组织样本中存在肿瘤性的多肽和蛋白分泌物，提示分泌物调控基因的突变参与心脏黏液瘤发生过程，这与临床肿瘤组织检测结果一致。此外组蛋白和氨基酸修饰的异常也与我们SNP检测结果中讨论的关键组蛋白基因相符合。在KEGG信号通路富集中，除了肿瘤相关通路存有显著性差异外，PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路也存在显著性差异。由于这两条信号通路与细胞增殖调控相关，而肿瘤细胞最大的特性就是增殖调控异常，因此在多种恶性肿瘤疾病中也都开发了以AKT或JAK等为靶向的治疗药物。本研究也证实了在心脏黏液瘤中存在以PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路为核心的细胞调控异常现象，心脏黏液瘤可能也适用AKT或JAK类药物的治疗措施。此外该结果也与蛋白互作网络分析结果一致，蛋白互作网络分析结果显示了以TP53、EP300和CREB基因为核心所构成的关系网络，而这些基因都参与了PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路的调控。因此表明在心脏黏液瘤的发生过程中，PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路存在调控异常，从而引起组织细胞增殖代谢异常并影响其分泌产物。
本次研究的成果除了检测出18个肿瘤基因重要的突变位点外，我们还发现了4019个新位点，其中去除内含子后，筛选出肿瘤相关的基因共26个，囊括了160个新位点，其中17个位点的突变对基因结构具有较高的影响。这些突变位点主要是由移码突变或者SNP突变导致氨基酸变为两种终止密码子。
PRKAR1A基因是蛋白激酶cAMP依赖的Ⅰ型调节亚基。cAMP通过激活cAMP依赖性蛋白激酶发挥其作用，后者通过不同靶蛋白的磷酸化来传递信号。有研究[30-31]显示PRKAR1A蛋白可以下调肝癌成纤维细胞内癌基因的表达，其突变在肝癌中具有重要标志作用。并且根据目前仅有的心脏黏液瘤的基因检测研究[31-32]发现，在家族型心脏黏液瘤中存在PRKAR1A基因中有多个未知的新位点发生突变的现象。而本研究中，我们也在2个样本中检测到了PRKAR1A基因的新位点突变p.Leu30fs（chr17，66511624）和p.Ser299*（chr17，66526065），PRKAR1A基因的第30位氨基酸Leu发生移码突变，属于该段外显子区域的前端氨基酸，该位置的移码突变可导致该区段的整条氨基酸链编码错误，对整个蛋白质结构产生了非常大的影响。而Ser299的单个碱基C/G突变之间翻译成终止密码子，更直接导致299个氨基酸后残链全部失效，对蛋白质结构有非常大的影响。虽然我们检测到的新位点与文献[33-34]报道的新位点结果不一致，但是与PRKAR1A基因的突变参与心脏黏液瘤（遗传性）的结果相吻合，提示PRKAR1A可能是遗传性心脏黏液瘤的风险基因之一。
除了PRKAR1A基因之外，外显子前端移码突变或终止子突变的新位点还有SND（chr7，1273267001， C/T p.Gln38*）和HIST1H2BK（chr6，27114471，T/A p.Glu36fs），HIST1H2BK又名H2BC12基因，是组蛋白H2的编码基因，组蛋白是真核生物中负责染色体纤维核小体结构的基本核蛋白。关于该基因目前的研究报道甚少，是否对疾病有影响还有待进一步探究。SND1基因编码一种与eb病毒核抗原2（EBNA 2）酸性区域相互作用的转录共激活因子，后者是B淋巴细胞转化所必需的一种转录激活因子。其他与该蛋白相互作用的转录因子包括信号转导因子和转录激活因子STATs。目前已有越来越多的研究[35-36]发现SND1与各类肿瘤细胞相关。
我们发现14例患者中有3例患者出现TAP1的新突变位点（chr6、32824994、AA/GC）。TAP基因是抗原处理相关转运体基因，位于6号染色体上MHC-Ⅱ类基因区。编码的TAP1分子有748个氨基酸组成，在MHC-Ⅰ类分子介导的抗原递呈途径中起重要的作用[37]。异常的TAP基因严重影响抗原递呈的过程，是肿瘤细胞逃逸的重要机制之一。目前在结肠癌、卵巢癌及乳腺癌细胞中发现TAP1蛋白表达水平显著性下降[38-39]。在本研究中TAP1基因在32824994位置发生突变，虽然不处于编码区，但依旧在上游调控区范围之内，且有21.4%的突变概率。一般来说，上游区域的碱基突变可以调控整段编码氨基酸链的翻译表达水平。但是该位点的突变是否影响了TAP1的表达，需要进一步通过Western blotting验证。如果验证属实，那么TAP1基因的突变调控不仅在心脏黏液瘤中有重要意义，甚至在其他恶性肿瘤的研究中都有深远意义。
CNV是长度>1 kb的DNA片段缺失、重复，是最为常见的染色体结构变异之一。大多数CNV在人群中发生频率>1%，而且不编码发育相关重要基因，被认为是基因组拷贝数多态性。不过和SNP一样，CNV也分为良性、致病性或未知临床意义的改变。
本研究发现10个基因与OncoKB或KEGG 数据库的肿瘤基因重合：RB1、AR、FGFR4、RXRA、NOTCH1、GLI1、PML、NOTCH3、IRS2、PIK3CD，其中RB1为拷贝数增加，其余9个为拷贝数丢失。RB1是细胞周期的负调控因子，是第一个被发现的抑癌基因，主要与视网膜母细胞瘤的发生相关。RB1具有维持染色质结构稳定的作用，非活化态RB1可以与转录因子E2F1结合，使细胞周期停滞在G1期，最终促进肿瘤细胞凋亡[40]。FGFR属于受体酪氨酸激酶家族（RTKs），含有4种受体亚型（FGFR-1，2，3和4）。FGFRs包含了细胞外结合区域，跨膜区域和细胞内的酪氨酸激酶区域，FGFR信号失调导致癌症的发生发展、增殖、存活及转移。RXRA基因编码类视黄醇X受体 alpha（RXR-alpha），也称为NR2B1。类视黄醇X受体（RXR）和视黄酸受体（RAR）是核受体，其通过参与视黄酸介导的基因激活来介导类视黄醇的生物学效应。在没有配体的情况下，RXR-RAR异二聚体与含有转录抑制剂的多蛋白复合物结合，所述转录抑制剂诱导组蛋白脱乙酰化，染色质浓缩和转录抑制。在配体结合上，辅阻遏物与受体解离并与共激活因子结合，导致转录激活。RXRA/PPARA异二聚体是PPARA对脂肪酸氧化基因（如ACOX1和细胞色素P450系统基因）转录活性所必需的。GLI1是一种转录调节因子，参与不同类型癌症的发展[41]。GLI1的转录活性在Hedgehog途径中受到调控（典型活性），但也可以在其他信号通路中受到独立的控制（非典型活性）。目前研究发现GLI1主要参与了非小细胞肺癌、胰腺癌的发生和发展。抑制GLI1蛋白靶向治疗结合其他化疗药物，是一种很有前途的治疗恶性肿瘤的策略[42]。胰岛素受体底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）调节磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）3-激酶/Akt/Foxo1通路，控制糖异生基因的抑制[43]。
对120个肿瘤相关的CNV基因做了富集分析，其GO富集的主要结果显示：微管发生以及细胞增殖调控等富集结果均存在显著性差异微管发生通路可降低胚胎的氧化应激反应，可刺激Pax3基因的表达，Pax3基因编码关闭神经管的转录因子，促进神经管发育。细胞增殖通路与免疫功能密切相关，包括细胞内信号级联、细胞死亡、T细胞活化、细胞凋亡、细胞程序性死亡、免疫反应、淋巴细胞活化和细胞因子介导的信号通路[44]。细胞调控通路表达水平与免疫过程有关，如免疫反应、防御反应、免疫系统过程的积极调节、先天性免疫反应、适应性免疫反应、免疫球蛋白介导的免疫反应、白细胞分化、白细胞介导的免疫、细胞防御反应、凋亡调节和炎症反应等[44]。KEGG的信号通路富集结果显示，除了综合的肿瘤信号通路存在显著性差异外，人乳头瘤病毒感染信号通路和粘着斑信号通路也存在差异。人乳头瘤病毒感染信号通路中tat蛋白将导致HPV E1/L1基因扩增，引起HPV复制增加和HPV病毒体释放。释放后会继续感染相同或相邻的宫颈上皮细胞。在上皮细胞内，HPV E6癌蛋白结合其靶向P53蛋白进行泛素依赖性降解，而E7结合Rb蛋白，从而破坏Rb和E2F复合物，并增加一氧化氮的产生，导致DNA损伤和激活COX-2/PG/PG受体的炎症通路导致炎症反应和肿瘤发生。然后，炎症细胞和肿瘤细胞可以释放在自分泌/旁分泌中起作用的细胞因子，趋化因子和PG，以调节内皮、基质、肿瘤上皮和浸润性免疫细胞的功能，从而导致肿瘤血管生成增加，增加了肿瘤的生长，减少了细胞凋亡，还降低了局部免疫监测。这些条件有利于肿瘤微环境中的肿瘤发生和病毒存活。用非甾体抗炎药（NSAIDs）如阿司匹林抑制COX-PG级联反应可通过下游途径来抑制PG活性，减少炎症反应和肿瘤进展[45]。粘着斑信号通路是指ADAM12基因缺失的心脏中存在一条与局灶性黏附及纤维化相关的信号通路。ADAM12的缺失增加了心肌整合素β1亚单位和转化生长因子-β受体Ⅰ、Ⅲ型的丰度，进而导致心肌粘着斑激酶、AKT、雷帕霉素靶标ERK和Smad2/3的磷酸化，从而导致心功能不全。结果表明，ADAM12的缺失可能通过调节整合素TGF-β1和β-β受体的丰度来增强灶性黏附和规范的转化生长因子-mRNA信号转导。与长期以来认为去整合素和金属蛋白酶（ADAM）12对心脏的损害作用相反，ADAM12的丢失增强了心脏局部黏附和纤维化相关的信号通路，这可能会损害心脏功能[46]。整合素α3招募c-Src/细胞外信号调节的蛋白激酶级联反应，导致粘着斑激酶的磷酸化。此外，它还能调节病灶粘附，增强宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力，并通过基质金属蛋白酶-9促进血管生成[47]。
综上所述，心脏黏液瘤为多细胞克隆起源肿瘤，该肿瘤复发可能与其呈多克隆起源有关；心脏黏液瘤发生过程中存在多个肿瘤基因位点突变，其中TP53、EP300、CREB等多个核心的肿瘤基因间存在相互作用关系，并通过PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路调控肿瘤细胞，在肿瘤发生中起重要作用。同时在肿瘤发生过程中，亦存在多个肿瘤基因的拷贝数异常，其中ERCC6L和INTS6L基因拷贝数异常在以肿瘤直径大小分组的样本中存在显著差异，提示这两个基因拷贝数异常可能与肿瘤生长状态相关。
利益冲突：无。
作者贡献：樊纪丹参与选题及论文设计，数据分析及论文撰写；谢于峰、颜大亮参与样本收集、实验数据整理；王凯航参与临床信息收集及整理；朱鹏程参与数据整理分析，论文修改及投稿。
心脏黏液瘤是心脏最常见的原发性肿瘤。心脏黏液瘤分为散发性黏液瘤（sporadic cardiac myxoma，SM）和以心脏黏液瘤为局部表现的卡尼复合征（Carney complex，CNC）两种类型。该病以左心房多见（74.2%），其次为右心房（15%～28%）、右心室（8%）、左心室（3%～4%）[1]。而累及瓣膜的黏液瘤极其罕见（＜1%），其中二尖瓣最常受累[2]。根据文献[3]报道，已经发现了34个参与心脏黏液瘤发生、发展的蛋白标志物。这些标志物在多种功能上相互重叠（如心脏、肌肉、上皮、外胚层、表皮、骨骼肌、骨化、骨骼化的生发，细胞增殖、粘附、迁移，内皮向间充质细胞转化，以及血管生成和向间充质细胞、神经细胞和肌肉细胞分化过程等），并通过信号通路（如G蛋白偶联受体、TGF受体、VEGF受体、MAP激酶、生长受体信号通路、细胞因子受体和细胞因子信号通路）发挥作用。
该病虽属良性肿瘤，但有一定的复发率，复发原因可能与以下4方面因素有关：肿瘤切除不完全、肿瘤呈多克隆起源、家族性肿瘤和转移性复发[4]。同时，心脏黏液瘤具有一定的恶性转化倾向[5]，多表现为蛋白MI表达升高和S100蛋白表达的改变，这两个蛋白的表达变化都是黑色素瘤预后不良的标志，也与心脏黏液瘤的恶性转化相关[3]。总之，心脏黏液瘤的生物学特性还不清楚，有待进一步研究。本研究将通过对心脏黏液瘤组织进行全基因组测序，对心脏黏液瘤基因行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）及拷贝数异常（copy number variation，CNV）检测，找到参与肿瘤发生中可能存在重要作用的SNP位点及CNV事件。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
随机选取2015—2019年泰州人民医院收治的心脏黏液瘤患者。患者纳入标准：（1）签署知情同意书；（2）术后所有肿瘤标本同时经两名以上病理医师作出病理诊断，均明确诊断为心脏黏液瘤；（3）年龄≥18岁。排除标准：（1）术前诊断其他肿瘤；（2）器官移植术后或造血干细胞移植术后患者；（3）有家族遗传病；（4）染色体病患者。纳入样本肿瘤最大直径3～12 cm，平均5.7 cm。本研究按照平均肿瘤最大直径将纳入样本分为2组，即直径≤5.7 cm组（A组）和直径>5.7 cm组（B组）。
1.2 方法
1.2.1 心脏肿瘤组织DNA提取
术中直接提取黏液瘤组织，液氮保存待检。取60 mg心脏黏液瘤和正常对照的组织打碎处理为组织悬液，将组织裂解后，使用DNA提取试剂盒（离心吸附柱法）提取心脏肿瘤组织DNA。
1.2.2 DNA文库构建
使用 Covaris™ 系列 DNA 超声破碎仪将样本片段化至150～350 bp，利于杂交捕获。将这些DNA片段进行末端修复，并向3’端加上腺嘌呤（A）后进行接头连接反应，然后筛选片段，并用PCR仪对片段进行扩增。检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit进行建库。用Qubit对文库进行定量，用Bioanalyzer（Agilent）、Qsep100（Bioptic）等相关片段分析仪器进行文库片段分布检测。构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。文库构建原理见图1。
图1
cDNA文库纯化、定量和质量检测流程图
1.2.3 测序
文库检质量检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。
1.2.4 生物信息学分析流程及筛选条件
我们采用GATK，SnpEff进行个体SNP的检测与注释。通过cnvkit等进行检测，即通过基因组上不同的阅读覆盖深度，判断潜在的变异和丢失。筛选条件为：测序深度Depth>10，等位基因的频率>0.01，覆盖该位点variant基因型的reads数之和>4，外显子组整合数据库（the Exome Aggregation Consortium）中该位点的等位基因的频率<0.01，千人基因组数据库中该位点的等位基因的频率<0.01，Filter：PASS或germline_risk。
1.2.5 软件列表
分析涉及到的软件见表1。
表1
生物信息学分析软件表
1.2.6 统计学分析
采用 IBM SPSS Statistics 25 软件处理数据。基因互斥性分析采用费舍尔精确检验，组间比较采用配对ｔ检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
1.2.7 伦理审查
本研究经我院医学伦理委员会审批，批准号：2019KY-079，同时取得患者书面知情同意。
2 结果
2.1 患者一般资料
共纳入14例心脏黏液瘤患者，其中女8例、男6例，年龄41～79岁，平均61.4岁。男性平均身高168.3 cm，平均体重71.5 kg；女性平均身高158.8 cm，平均体重57.6 kg。12例患者粘液瘤发生于左心房，其中11例肿瘤瘤蒂位于房间隔，1例瘤蒂位于左房壁；另外2例患者发生于右心房，瘤蒂均位于房间隔。
2.2 心脏肿瘤样本SNP检测
14个样本中共检测到43877个突变位点，其中单样本突变位点最多为3645个（样本号12），最少为2546个（样本号2），中位数为3312个，符合正态分布。去除内含子以及突变位点样本数为1的位点后，剩余不同的突变位点共4 052个，共对应基因2784个。再与OncoKB、KEGG数据库联合对比分析，共发现217个基因与数据库中的肿瘤基因重合，其中有37个基因与2个数据库的肿瘤基因均有交集（图2），我们认为这37个交集基因是关键的肿瘤基因。
图2
与数据库联合对比分析
2784个对应基因与OncoKB、KEGG数据库联合对比分析共发现217个基因与数据库中的肿瘤基因重合，其中37个基因与2个数据库的肿瘤基因重合，蓝色为检测到的SNP基因，绿色为Oncobe数据库，红色为KEGG数据库
2.3 与肿瘤相关基因的SNP位点
将37个肿瘤基因的所有位点信息进一步筛选后（去除可能良性，单点的突变），发现在14例标本中突变发生次数≥2的位点有18个；见表2。其中AXIN1和GLI1的突变率最高，为35.7%。CREB蛋白的亚基突变频率为28.5%，其他基因位点的突变率在14.2%～21.4%。
表2
18个肿瘤基因SNP位点信息
2.4 肿瘤基因共现性和互斥性
37个肿瘤基因在14例心脏肿瘤样本中的共现性和互斥性关系如下，图3表示两肿瘤基因的共现性或互斥性具有显著意义的关系。表3是37个肿瘤基因具有显著性统计学意义的共现互斥基因。
图3
两肿瘤基因之间共现性或互斥性示意图
表3
37个肿瘤基因中具有统计学意义的共现互斥基因
2.5 肿瘤相关性的基因网络关系
肿瘤可能相关的37个基因中有36个基因具有相互作用，其蛋白质相互作用网络分析显示：TP53、EP300、CREBBP起着核心连结作用。3个基因的突变率分别为：TP53和EP300突变率14%，CREBBP突变率28%；见图4。
图4
肿瘤相关性基因交互作用图
TP53、EP300、CREBBP起着核心连结作用，TP53和EP300突变率为14%，CREBBP突变率为28%
2.6 GO富集及KEGG通路分析结果
对肿瘤相关的217个基因做了GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析结果显示，217个肿瘤相关的基因主要参与蛋白分泌的调控、肽链分泌调控、组氨酸修饰、共价染色质修饰等过程；见图5a。KEGG信号通路富集结果显示，217个肿瘤相关的基因主要参与了癌症通路、PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路等；见图5b。与蛋白互作网络分析结果符合，提示PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路在黏液瘤发生中起重要作用。
图5
GO和KEGG富集分析结果
a：217个肿瘤相关基因GO富集结果；b：217个肿瘤相关基因KEGG的信号通路分析结果；除综合的肿瘤信号通路存在显著性差异外，PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路也存在显著差异
2.7 新肿瘤相关基因的SNP位点
14个样本中筛选出新突变位点4120个，经查找筛选出肿瘤相关的基因145个。突变率较高的肿瘤相关基因的位点，也是新发现的突变位点，暂无无突变位点ID的RS号，在染色体上的具体位置见表4。
表4
突变率较高的新肿瘤相关基因的位点
2.8 样本CNV数据
在14个心脏肿瘤样本的CNV检测中共发现4498个CNV事件，其中拷贝丢失3260条，拷贝数增加1238条，共包含1070个基因。在所有CNV中检测到拷贝数丢失基因共786个，其中93个在OncoKB或KEGG肿瘤数据库中。CNV中检测到拷贝数增加基因共284个，其中27个在OncoKB或KEGG肿瘤数据库中。120个肿瘤基因的生物学功能信息如图6a所示。再与OncoKB，KEGG两个数据库联合对比分析，10个基因均与2个数据库的肿瘤基因有交集：AR、FGFR4、RXRA、NOTCH1、GLI1、PML、NOTCH3、IRS2、PIK3CD、RB1（图6b），我们认为这10个交集基因是关键的肿瘤基因。
图6
生物学功能分析及与数据库重合度分析
a：120个肿瘤基因的生物学功能分析结果；b：120个肿瘤基因与OncoKB数据库或KEGG数据库重合度，其中10个基因与两个数据库的肿瘤基因均有交集
2.9 GO和KEGG富集结果
对120个肿瘤相关的CNV基因做了富集分析，微管发生以及细胞增殖调控等细胞功能的富集结果存在显著差异；见图7a。KEGG的信号通路富集结果显示，除了综合的肿瘤信号通路存在显著差异外，人乳头瘤病毒感染信号通路和粘着斑信号通路也存在差异；见图7b。
图7
GO富集分析及KEGG富集分析
a：120个肿瘤相关CNV基因GO富集结果；b：120个肿瘤相关CNV基因的KEGG信号通路富集结果
2.10 不同肿瘤直径大小组基因SNP位点及CNV差异基因比较
将检测到SNP的肿瘤基因样本进行组间比较，两组间检测样本差异均无统计学意义（P>0.05），其中5个基因位点差异相对较大，分别为NIN、FN1、RELN、NFATC1、STK11；见表5。
表5
5个基因SNP位点组间比较结果
将检测到CNV的肿瘤基因检测样本进行组间比较，发现两组样本ERCC6L与INTS6L基因差异有统计学意义（P=0.030），其余8个基因CNV的检测样本差异无统计学意义（P>0.05）；见表6。
表6
肿瘤基因CNV的检测样本进行组间比较结果
3 讨论
针对心脏黏液瘤的治疗，目前国内外最主流的治疗方式仍然是外科手术切除。尤其对于已经发生严重并发症或有高危倾向的黏液瘤患者，应当积极选择手术治疗。主要的手术方式为胸骨正中切开后经股动静脉-上腔静脉插管、主动脉-上腔静脉插管或上下腔静脉直角管插管建立体外循环，于深低温停循环下心脏切开取瘤。心脏黏液瘤虽属良性肿瘤，但有一定的复发率。多中心远期随访数据中，散发性心脏黏液瘤切除后复发率约为1%～5%，而家族性CNC复发率占12%。阜外医院对1990年后224例患者进行长期有效随访，黏液瘤复发8例，复发率3.6%；他们认为复发可能与以下因素有关：肿瘤切除不完全、肿瘤呈多克隆起源、家族性肿瘤和转移性复发。由此可见，心脏黏液瘤生物学特性还有待进一步研究。
本研究通过对14个心脏黏液瘤患者的肿瘤样本进行二代全外显子测序分析，共检测到突变位点43877个，去除内含子后存在4052个不同的突变位点。217个基因与OncoKB、KEGG数据库中的肿瘤基因重合。并且通过进一步筛选，发现37个重要的肿瘤基因突变位点；在14样本中突变位点发生个数≥2个的有18个。
在这些突变位点中，AXIN1和GLI1的突变率最高，为35.7%。AXIN1基因是抑癌基因AXIN家族一员，是一种多功能的构架蛋白，参与Wnt、JNK、TGF-beta等多种信号通路传导途径从而调控细胞增殖分化凋亡等调节过程。有研究[13]表明在恶性肿瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌等疾病中，AXIN1的表达存在异常，这与我们基因富集的信号通路结果一致，表明AXIN1与多种恶性肿瘤呈密切相关性，但是在良性肿瘤如黏液瘤中却没有任何相关研究报道，所以本研究中突变发生率35.7%的AXIN1基因与心脏黏液瘤的发生发展是否有相关性还有待进一步研究。此外在14个样本中，我们发现AXIN2和ARID1B基因存在的共现性。ARID1B是一种富含AT碱基且编码SWI/SNF复合体结构域蛋白的基因，其功能是通过水解ATP重塑染色质进而调控细胞增殖分化。有研究[14-16]在多类肿瘤组织中发现ARID1B的突变及蛋白表达水平异常，我们在14个样本中发现有3个样本包含了5个ARID1B基因突变位点，但是突变位点没有重复性，因此AXIN2和ARID1B的共现性是巧合还是必然，还有待加大数据量后进一步证明。AXIN2除了与ARID1B的具有共现性外，其与FGFR4也存在显著共现性（P=0.032），成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）又称为CD334，是人体中由FGFR4基因编码的蛋白质，蛋白质的细胞外部分与成纤维细胞生长因子相互作用，启动下游信号的级联反应，最终影响有丝分裂发生和分化。虽然其特异性功能未知，但该基因在妇科肿瘤样本中过表达，提示该基因在乳腺和卵巢肿瘤发生中发挥作用[17-19]。而值得关注的是，在本研究中，仅有的2例FGFR4的SNP突变患者性别是男性，提示FGFR4的表达改变不仅仅存在于在女性恶性肿瘤中。
GLI1编码是锌指蛋白Kruppel家族的成员，编码的转录因子经信号转导级联激活并调节干细胞增殖。这种蛋白的活性和核定位在抑制环中被TP53负调控。国内学者[20]发现在汉族人群中GLI1基因的位点突变在慢性淋巴性白血患者者中有多态性，本研究发现5例患者GIL1基因的rs3216740发生突变。故心脏黏液瘤患者GLI1基因的位点是否也具有多态性还有待进一步验证。在本研究中同样发现仅有的2例TP53基因突变患者其GLI1基因也发生了突变，此外这2例患者的CREB3L2、NFATC2基因的SP也发生了相同突变，突变率分别为28.5%和21.3%。TP53又称P53，该基因编码一种包含转录激活、DNA结合和寡聚结构域的肿瘤抑制蛋白。编码的蛋白响应不同的细胞压力，调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢变化[21]。该基因的突变与多种人类癌症有关[22-24]。CREB3L2基因编码oasis bZIP转录因子家族成员，这个家族的成员可以形成同二聚体，编码的蛋白质是一种转录激活物。在很多肿瘤中，7号染色体上的该基因和16号染色体上的肉瘤融合基因之间存在易位[25-26]。NFATC2基因是活化T细胞（NFAT）家族的核心因子之一，该基因的产物是一个具有rel同源区（rhr）和nfat同源区（nhr）的DNA结合蛋白。该蛋白存在于胞浆中，在T细胞受体（TCR）刺激下仅向细胞核转运，成为活化T细胞转录复合物的核因子之一。这种复合物在免疫应答过程中对诱导基因转录起中心作用，并已鉴定出编码不同亚型的交替转录剪接变体[27]。NFATC2中的rs12479626的T/C突变虽然在ClinVav中目前还有没有报道，但是在COSMIC肿瘤数据库的注释中已被认为是有致病可能性的。共现和互斥关联分析结果显示，NFATC2与TP53存在共现性（P=0.032）。有研究[28]显示，通过抑制NFAT1信号通路可调控TP53相关的肿瘤细胞活性，起到抑制肿瘤的作用。这与我们的SNP检测结果和共现性分析结果一致，提示NFATC2可能通过改变NFAT1结构或表达水平与TP53共同调控肿瘤细胞的发生。
在14个样本中我们发现2例患者的BCR的rs372013175位点发生了外显子移码突变。移码突变是是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变。移码突变所造成的DNA损伤一般远大于点突变。另外BCR是重要的肿瘤基因，在血样检测中，BCR-ABL融合基因是鉴定白血病的重要标志基因[29]，但是在其他肿瘤中并没有相关报道。而本研究中BCR基因发生的外显子移码突变究竟是否参与心脏肿瘤中发生亦或是偶然情况，这一点还无法通过测序或者已有的相关研究得出结论，因此在之后的研究中需要更深入关注。
此外，我们对本次研究中所有突变位点相关的肿瘤基因做了富集分析和蛋白互作网络分析。KEGG富集结果显示，诸多基因调控通路存在显著差异，其中包括蛋白分泌调控通路和多肽分泌调控通路，这表示所检测的肿瘤组织样本中存在肿瘤性的多肽和蛋白分泌物，提示分泌物调控基因的突变参与心脏黏液瘤发生过程，这与临床肿瘤组织检测结果一致。此外组蛋白和氨基酸修饰的异常也与我们SNP检测结果中讨论的关键组蛋白基因相符合。在KEGG信号通路富集中，除了肿瘤相关通路存有显著性差异外，PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路也存在显著性差异。由于这两条信号通路与细胞增殖调控相关，而肿瘤细胞最大的特性就是增殖调控异常，因此在多种恶性肿瘤疾病中也都开发了以AKT或JAK等为靶向的治疗药物。本研究也证实了在心脏黏液瘤中存在以PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路为核心的细胞调控异常现象，心脏黏液瘤可能也适用AKT或JAK类药物的治疗措施。此外该结果也与蛋白互作网络分析结果一致，蛋白互作网络分析结果显示了以TP53、EP300和CREB基因为核心所构成的关系网络，而这些基因都参与了PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路的调控。因此表明在心脏黏液瘤的发生过程中，PI3K-AKT和JAK-STAT的信号通路存在调控异常，从而引起组织细胞增殖代谢异常并影响其分泌产物。
本次研究的成果除了检测出18个肿瘤基因重要的突变位点外，我们还发现了4019个新位点，其中去除内含子后，筛选出肿瘤相关的基因共26个，囊括了160个新位点，其中17个位点的突变对基因结构具有较高的影响。这些突变位点主要是由移码突变或者SNP突变导致氨基酸变为两种终止密码子。
PRKAR1A基因是蛋白激酶cAMP依赖的Ⅰ型调节亚基。cAMP通过激活cAMP依赖性蛋白激酶发挥其作用，后者通过不同靶蛋白的磷酸化来传递信号。有研究[30-31]显示PRKAR1A蛋白可以下调肝癌成纤维细胞内癌基因的表达，其突变在肝癌中具有重要标志作用。并且根据目前仅有的心脏黏液瘤的基因检测研究[31-32]发现，在家族型心脏黏液瘤中存在PRKAR1A基因中有多个未知的新位点发生突变的现象。而本研究中，我们也在2个样本中检测到了PRKAR1A基因的新位点突变p.Leu30fs（chr17，66511624）和p.Ser299*（chr17，66526065），PRKAR1A基因的第30位氨基酸Leu发生移码突变，属于该段外显子区域的前端氨基酸，该位置的移码突变可导致该区段的整条氨基酸链编码错误，对整个蛋白质结构产生了非常大的影响。而Ser299的单个碱基C/G突变之间翻译成终止密码子，更直接导致299个氨基酸后残链全部失效，对蛋白质结构有非常大的影响。虽然我们检测到的新位点与文献[33-34]报道的新位点结果不一致，但是与PRKAR1A基因的突变参与心脏黏液瘤（遗传性）的结果相吻合，提示PRKAR1A可能是遗传性心脏黏液瘤的风险基因之一。
除了PRKAR1A基因之外，外显子前端移码突变或终止子突变的新位点还有SND（chr7，1273267001， C/T p.Gln38*）和HIST1H2BK（chr6，27114471，T/A p.Glu36fs），HIST1H2BK又名H2BC12基因，是组蛋白H2的编码基因，组蛋白是真核生物中负责染色体纤维核小体结构的基本核蛋白。关于该基因目前的研究报道甚少，是否对疾病有影响还有待进一步探究。SND1基因编码一种与eb病毒核抗原2（EBNA 2）酸性区域相互作用的转录共激活因子，后者是B淋巴细胞转化所必需的一种转录激活因子。其他与该蛋白相互作用的转录因子包括信号转导因子和转录激活因子STATs。目前已有越来越多的研究[35-36]发现SND1与各类肿瘤细胞相关。
我们发现14例患者中有3例患者出现TAP1的新突变位点（chr6、32824994、AA/GC）。TAP基因是抗原处理相关转运体基因，位于6号染色体上MHC-Ⅱ类基因区。编码的TAP1分子有748个氨基酸组成，在MHC-Ⅰ类分子介导的抗原递呈途径中起重要的作用[37]。异常的TAP基因严重影响抗原递呈的过程，是肿瘤细胞逃逸的重要机制之一。目前在结肠癌、卵巢癌及乳腺癌细胞中发现TAP1蛋白表达水平显著性下降[38-39]。在本研究中TAP1基因在32824994位置发生突变，虽然不处于编码区，但依旧在上游调控区范围之内，且有21.4%的突变概率。一般来说，上游区域的碱基突变可以调控整段编码氨基酸链的翻译表达水平。但是该位点的突变是否影响了TAP1的表达，需要进一步通过Western blotting验证。如果验证属实，那么TAP1基因的突变调控不仅在心脏黏液瘤中有重要意义，甚至在其他恶性肿瘤的研究中都有深远意义。
CNV是长度>1 kb的DNA片段缺失、重复，是最为常见的染色体结构变异之一。大多数CNV在人群中发生频率>1%，而且不编码发育相关重要基因，被认为是基因组拷贝数多态性。不过和SNP一样，CNV也分为良性、致病性或未知临床意义的改变。
本研究发现10个基因与OncoKB或KEGG 数据库的肿瘤基因重合：RB1、AR、FGFR4、RXRA、NOTCH1、GLI1、PML、NOTCH3、IRS2、PIK3CD，其中RB1为拷贝数增加，其余9个为拷贝数丢失。RB1是细胞周期的负调控因子，是第一个被发现的抑癌基因，主要与视网膜母细胞瘤的发生相关。RB1具有维持染色质结构稳定的作用，非活化态RB1可以与转录因子E2F1结合，使细胞周期停滞在G1期，最终促进肿瘤细胞凋亡[40]。FGFR属于受体酪氨酸激酶家族（RTKs），含有4种受体亚型（FGFR-1，2，3和4）。FGFRs包含了细胞外结合区域，跨膜区域和细胞内的酪氨酸激酶区域，FGFR信号失调导致癌症的发生发展、增殖、存活及转移。RXRA基因编码类视黄醇X受体 alpha（RXR-alpha），也称为NR2B1。类视黄醇X受体（RXR）和视黄酸受体（RAR）是核受体，其通过参与视黄酸介导的基因激活来介导类视黄醇的生物学效应。在没有配体的情况下，RXR-RAR异二聚体与含有转录抑制剂的多蛋白复合物结合，所述转录抑制剂诱导组蛋白脱乙酰化，染色质浓缩和转录抑制。在配体结合上，辅阻遏物与受体解离并与共激活因子结合，导致转录激活。RXRA/PPARA异二聚体是PPARA对脂肪酸氧化基因（如ACOX1和细胞色素P450系统基因）转录活性所必需的。GLI1是一种转录调节因子，参与不同类型癌症的发展[41]。GLI1的转录活性在Hedgehog途径中受到调控（典型活性），但也可以在其他信号通路中受到独立的控制（非典型活性）。目前研究发现GLI1主要参与了非小细胞肺癌、胰腺癌的发生和发展。抑制GLI1蛋白靶向治疗结合其他化疗药物，是一种很有前途的治疗恶性肿瘤的策略[42]。胰岛素受体底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）调节磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）3-激酶/Akt/Foxo1通路，控制糖异生基因的抑制[43]。
对120个肿瘤相关的CNV基因做了富集分析，其GO富集的主要结果显示：微管发生以及细胞增殖调控等富集结果均存在显著性差异微管发生通路可降低胚胎的氧化应激反应，可刺激Pax3基因的表达，Pax3基因编码关闭神经管的转录因子，促进神经管发育。细胞增殖通路与免疫功能密切相关，包括细胞内信号级联、细胞死亡、T细胞活化、细胞凋亡、细胞程序性死亡、免疫反应、淋巴细胞活化和细胞因子介导的信号通路[44]。细胞调控通路表达水平与免疫过程有关，如免疫反应、防御反应、免疫系统过程的积极调节、先天性免疫反应、适应性免疫反应、免疫球蛋白介导的免疫反应、白细胞分化、白细胞介导的免疫、细胞防御反应、凋亡调节和炎症反应等[44]。KEGG的信号通路富集结果显示，除了综合的肿瘤信号通路存在显著性差异外，人乳头瘤病毒感染信号通路和粘着斑信号通路也存在差异。人乳头瘤病毒感染信号通路中tat蛋白将导致HPV E1/L1基因扩增，引起HPV复制增加和HPV病毒体释放。释放后会继续感染相同或相邻的宫颈上皮细胞。在上皮细胞内，HPV E6癌蛋白结合其靶向P53蛋白进行泛素依赖性降解，而E7结合Rb蛋白，从而破坏Rb和E2F复合物，并增加一氧化氮的产生，导致DNA损伤和激活COX-2/PG/PG受体的炎症通路导致炎症反应和肿瘤发生。然后，炎症细胞和肿瘤细胞可以释放在自分泌/旁分泌中起作用的细胞因子，趋化因子和PG，以调节内皮、基质、肿瘤上皮和浸润性免疫细胞的功能，从而导致肿瘤血管生成增加，增加了肿瘤的生长，减少了细胞凋亡，还降低了局部免疫监测。这些条件有利于肿瘤微环境中的肿瘤发生和病毒存活。用非甾体抗炎药（NSAIDs）如阿司匹林抑制COX-PG级联反应可通过下游途径来抑制PG活性，减少炎症反应和肿瘤进展[45]。粘着斑信号通路是指ADAM12基因缺失的心脏中存在一条与局灶性黏附及纤维化相关的信号通路。ADAM12的缺失增加了心肌整合素β1亚单位和转化生长因子-β受体Ⅰ、Ⅲ型的丰度，进而导致心肌粘着斑激酶、AKT、雷帕霉素靶标ERK和Smad2/3的磷酸化，从而导致心功能不全。结果表明，ADAM12的缺失可能通过调节整合素TGF-β1和β-β受体的丰度来增强灶性黏附和规范的转化生长因子-mRNA信号转导。与长期以来认为去整合素和金属蛋白酶（ADAM）12对心脏的损害作用相反，ADAM12的丢失增强了心脏局部黏附和纤维化相关的信号通路，这可能会损害心脏功能[46]。整合素α3招募c-Src/细胞外信号调节的蛋白激酶级联反应，导致粘着斑激酶的磷酸化。此外，它还能调节病灶粘附，增强宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力，并通过基质金属蛋白酶-9促进血管生成[47]。
综上所述，心脏黏液瘤为多细胞克隆起源肿瘤，该肿瘤复发可能与其呈多克隆起源有关；心脏黏液瘤发生过程中存在多个肿瘤基因位点突变，其中TP53、EP300、CREB等多个核心的肿瘤基因间存在相互作用关系，并通过PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路调控肿瘤细胞，在肿瘤发生中起重要作用。同时在肿瘤发生过程中，亦存在多个肿瘤基因的拷贝数异常，其中ERCC6L和INTS6L基因拷贝数异常在以肿瘤直径大小分组的样本中存在显著差异，提示这两个基因拷贝数异常可能与肿瘤生长状态相关。
利益冲突：无。
作者贡献：樊纪丹参与选题及论文设计，数据分析及论文撰写；谢于峰、颜大亮参与样本收集、实验数据整理；王凯航参与临床信息收集及整理；朱鹏程参与数据整理分析，论文修改及投稿。
