本文简要归纳总结了侧流免疫层析技术在新型冠状病毒抗原检测中的应用研究。侧流免疫层析技术因其快捷、低成本、操作便携而广泛应用于临床和公共卫生领域。自新型冠状病毒肺炎疫情暴发以来，该技术已被用于新型冠状病毒抗原的快速检测，其中包括普遍采用的胶体金免疫层析法以及基于荧光微球或其他复合纳米材料的各类荧光免疫层析法。随着新型标志物的开发，该技术平台正由低灵敏度向高灵敏度、由定性检测向定量检测等方向发展。
引用本文： 程雨飞, 张龙浩. 侧流免疫层析技术在新型冠状病毒抗原检测中应用的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2023, 30(5): 779-783. doi: 10.7507/1007-4848.202304002 复制
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，新冠病毒）感染引发的急性呼吸道传染性疾病，过去3年在全球范围导致了大规模持续流行。截至2023年3月10日，疫情已导致7.5亿人感染、686万人死亡，疫情防控工作任重道远[1]。为此，全球已开发了各类诊断方法监测新冠病毒的流行。逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）因其极高的灵敏度，是当前诊断新冠病毒感染的金标准。但在实际实施中该方法需要定点排队等候采样，且从取样至结果分析全流程须由专业医疗团队借助贵重仪器来完成，耗时长、成本高。便携式侧流免疫层析法（lateral flow immunoassay，LFIA）兼具较高灵敏度、快速、简便的特点，虽然不及RT-PCR敏感，但凭借特有的现场即时检测（point-of-care testing，POCT）能力，具有较为突出的应用和研究价值，在疫情中得到广泛运用。本文将对LFIA技术在新冠病毒抗原检测中的应用研究进行综述。
1 新型冠状病毒抗原快速检测
新冠病毒属于RNA病毒，呈球形或椭球形，直径100 nm左右。该病毒粒子包含1个约30 kb的单链核糖核酸（RNA）基因组，共编码29种蛋白，包括9种附属蛋白，16种非结构蛋白和4种结构蛋白。其中4种结构蛋白为包膜（membrane，M）蛋白、囊膜（envelope，E）蛋白、刺突（spike，S）蛋白，以及核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白。其中前三者均位于病毒蛋白外壳上，N蛋白则包裹RNA基因组形成核衣壳，并协助其在宿主细胞内转录和复制。值得注意的是N蛋白在不同新冠病毒株系中高度保守，更利于抗体结合避免脱靶，且在病毒感染细胞后表达量高，是较为理想的抗原检测靶标[2-4]。大多数抗原检测试剂盒是以检测N蛋白来表征新冠病毒的存在，以保证较高的检测敏感性、特异性和对病毒变异株较高的兼容性[5-6]。这些抗原检测一般使用针对N蛋白的单克隆抗体[7]。相对于多克隆抗体，单克隆抗体虽然制备成本更高，但其在复杂混合物样本中的高特异性优势十分明显，可有效减少新冠病毒抗原检测中的假阳性和交叉反应等影响检测质量的不确定性因素[7-8]。新冠病毒抗原检测主要采用快速、低成本、操作便携的LFIA技术[6]。非专业人士亦可自行操作，通过目视或借助少量便携式设备即可判读结果。
2 胶体金免疫层析技术
2.1 胶体金免疫层析技术原理
以胶体金纳米颗粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）为标记的LFIA技术是传统经典方法，目前仍被普遍采用，该方法化学稳定性及抗光解离性强，且在自然光下辨识度高[8-9]，从采样至可视化结果判读可在30 min内完成[10]。LFIA试剂条是由样品垫、结合垫、层析膜、吸收垫叠加于聚氯乙烯支撑底板上所组成的便携式卡型装置。样品垫为经过处理的玻璃纤维膜，用于快速吸收提取液（待检液）使其经由毛细管表面扩散作用流至结合垫。结合垫吸附了交联了AuNPs的抗体（金标抗体），可特异性识别新冠病毒抗原。层析膜通常为硝酸纤维素膜，其上依次固定了一条有另一种特异性结合新冠病毒抗原的抗体位于检测（test，T）线处，同时还有一种特异性结合金标抗体的抗体（质控抗体）位于更下游的质控（control，C）线处。吸收垫用于吸收剩余溶液以平衡层析膜两边压差，促使提取液沿下游持续定向流动。一般情况下检测人员使用尼绒拭子拭鼻腔（一般深入鼻道1～2 cm即可）获取呼吸道样品，将其溶于提取缓冲液中，并滴上数滴至样品孔（样品垫）上，并将试剂条静置平放以待显色。流过结合垫的提取液会带动金标抗体沿下游移动。若样品中含有新冠病毒，其抗原会同金标抗体特异性结合形成抗原-抗体免疫复合物，当到达T线区，此处固定的另一新冠特异性抗体通过不同表位与新冠抗原结合，形成抗体-抗原-抗体的夹心结构。随着捕获量增多，该处胶体金颗粒聚集并逐渐显现出红色。下游C线的质控抗体会识别过量的金标抗体进而显色，该处显色用于验证检测的有效性，不受样品中是否含新冠病毒的影响。尽管检测试剂的标记物及检测设备在不断更新，但新冠抗原LFIA一般都采用基于该“夹心法”的检测框架及程序[11-12]。
2.2 胶体金免疫层析技术的应用研究
传统胶体金LFIA的缺点是检测灵敏度相对较低，主要推荐用于病毒载量较高的感染者，该领域的研究主要围绕设计改进型的探针。胶体金纳米颗粒的光学性质受其形态影响较大，在一定条件下扩大颗粒尺寸或使用特定形貌的非球状颗粒均有助于增加其辨识性从而提高测试的敏感性[13-15]。金属离子在还原剂存在的情况下容易以胶体金为核心，以纳米壳层的形式层层生长进而不断扩大整体尺寸，并随之放大探针的比色信号。Panferov等[16] 比较了胶体金表面金原位沉积工艺、胶体金表面银原位沉积工艺，以及新型电蚀辅助金原位沉积工艺对新冠S蛋白受体结合域的LFIA检测性能的影响。三类工艺均有效提升了检测灵敏度，并且尤以胶体金表面金原位沉积法最为突出，较相同条件下常规胶体金LFIA的检测限（limit of detection，LoD）低出500倍左右。研究者基于该工艺开发了一种操作相对简便的LFIA检测方法，并采用了稳定性较高的试剂，可在8 min内完成检测。此外，铜作为一种廉价金属也受到了广泛关注，一些研究[17-19]利用胶体金纳米颗粒引导的探针表面铜积沉效应提升了部分LFIA方法的灵敏度。Peng等[20] 将此方案用于新冠病毒抗原的胶体金LFIA，在免疫反应后，检测试剂条被浸泡于含有二价铜离子（Cu2+）及其还原剂抗坏血酸钠（sodium ascorbate）的增强液中，铜离子以胶体金为核心聚集并还原成铜单质，进而以纳米壳层的形式积沉于探针表面，使得探针信号显著增强。实验经优化后对新冠病毒抗原达到了0.01 μg/mL的检测限，并可在20 min内完成检测。但该信号增强方案在实践中的推广应用尚存局限。由于铜与金的晶格常数相差较大，铜纳米壳层在探针表面的生长合成过程很容易因晶格失配而不可控。此外，试剂条的浸泡处理工艺易于使额外的铜离子吸附于硝酸纤维素膜上进而导致高背景或假阳性[21]。
在一定条件下，胶体金探针的吸光度会随着颗粒团聚的增多而增强，但该过程对颗粒间距的控制要求很高，例如在颗粒间距小于10 nm时所引发的等离激元耦合会导致等离子共振光谱红移继而降低可见光范围内的吸光度[22]。Oh等[22] 以一个吸附有链霉亲和素（streptavidin）的金纳米颗粒为核心交联多个吸附有生物素化的抗体（biotinylated antibodies）的金纳米颗粒，进而开发了一种具有约15 nm的恒定颗粒间距的胶体金探针，有效地在稳定显色光谱的基础上提升了整体比色信号。使用该探针构建的LFIA对新冠病毒抗原的检测限达到了比使用同等粒径大小的常规胶体金LFIA低出数倍的检测限，在其他冠状病毒抗原或流感病毒抗原的存在下亦显示出较好的特异性。
新冠病毒可与其他流感等呼吸系统疾病病毒共同流行并共同感染患者，进而对准确诊疗产生影响。由于新冠病毒与SARS冠状病毒（SARS-CoV-1）的N蛋白序列相似，现有新冠抗原检测试剂较易于对冠状病毒产生交叉反应[6]。由于目前并非冠状病毒流行期，新冠抗原试剂整体而言仍具有较高的特异性。即便如此，将待测抗原与其他来源抗原进行有效区分仍然十分重要[23]。鉴于此，Hristov等[24]以新冠病毒、SARS冠状病毒，以及能引发细支气管炎的人类冠状病毒HKU1的S蛋白为抗原检测靶标，结合相应抗体进行优化并基于在层析膜上设计多条相应检测线的LFIA试剂条，首次开发了一种能在30 min内在多组分抗原中同时测定新冠病毒、SARS冠状病毒和人类冠状病毒HKU1的LFIA。这类基于低成本即时检测平台的抗原鉴别技术的进展有助于对具备相似临床症状的呼吸道疾病进行加速诊断并且更好地评估患者风险。
3 基于其他标记物的侧流免疫层析技术
3.1 荧光微球标记免疫层析
荧光乳胶粒子受激发光源激发而发出荧光，粒度均一且稳定性高[25]。相较于胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法灵敏度高，探针稳定性好，且不易受自然光的干扰，但需要借助荧光免疫分析仪判读结果。荧光免疫层析已发展成常用的新冠病毒抗原快速检测手段之一[6]。在疫情暴发初期，Diao等[26]基于羧基化聚苯乙烯荧光探针构建了检测新冠病毒N蛋白的LFIA试剂条，使用荧光免疫分析仪读取结果，并通过检测100份健康鼻拭样本所获得的平均荧光信号强度（正负5个标准方差）来确立其阴性阈值（cut-off value）。研究者将其用于一批各医疗中心的239份疑似新冠感染样本并通过RT-PCR验证以评估性能。检测流程亦基于常规LFIA，通过鼻咽拭获得的样品经由缓冲液稀释后滴加100 μL于样品垫上，然后将试剂条静置平放，待10 min免疫反应后，将试剂条插入相应的荧光免疫分析仪的读取接口，分析仪即会自动检测信号强度并通过对比其芯片内置的截断值判读出阳性或阴性。该方法展示出较高的精确性并能较早地筛选出阳性，可用于更大范围的新冠抗原筛查。在另一项研究中，Zhang等[27] 基于荧光微球标记技术研制了一种抗原快速检测试剂条，对活化的新冠病毒滴度达到1 000 TCID50/mL，在健康对照和其他呼吸系统疾病患者中的特异性分别为100%和97%。此外，张赛等[28] 基于羧基荧光纳米粒子研制了一种LFIA，对热灭活新冠培养物的检测达1 600 TCID50/mL，对16类常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应，并且与临床诊断符合率较高。Mao等[29] 基于LFIA开发了一种通过p-甲苯磺酰（p-toluenesulfonyl）活化稀土荧光微球蛋白的方法，对抗体与荧光探针的交联效率进行了优化从而提升了对抗原的识别效率。免疫荧光层析试剂卡经优化后对新冠病毒抗原能达到0.01 ng/mL的检测限，具备高灵敏度、较好的便携性及相对快的反应速度。
3.2 量子点标记免疫层析
量子点作为一种新型荧光纳米材料已被用于LFIA系统中，其具有光稳定性好、激发光谱宽且分布连续、发射光谱窄以及可对信号强度进行量化等优势。但另一方面，其较小的颗粒直径尺寸（5～20 nm）及较差的生物相容性相当程度限制了大规模LFIA应用[30-31]。Han等[30] 通过将胶体金与量子点颗粒同时以单层纳米壳层的形式吸附于200 nm二氧化硅微球表面组装了一种既能进行常规可视化胶体金比色检测又可实施量子点荧光检测的双功能探针。单分散二氧化硅微球作为中心载体能有效维持探针在复合溶液中的稳定性，使样品无需前期处理即可被用于LFIA检测。使用者依据自身所处条件选择检测模式。吸附于二氧化硅表面的20 nm胶体金探针负责发出比色信号，适用于在资源匮乏的情形下对可疑样本进行快速可视化检测，而在有外接荧光分析仪等辅助设备的条件下，密集分布于胶体金颗粒间隙中的量子点被激发光源激发后发出荧光发射信号，从而可以实施更精确、灵敏度更高的抗原定量测定。该方法经优化后对新冠抗原比色检测的检测限达到了低于同时期常用的胶体金LFIA的10倍左右（量子点荧光检测为300倍左右）。随后的大规模临床测试进一步验证了其优异的特异性、精确性以及重复性。
3.3 有机分子标记免疫层析
基于荧光乳胶粒子、量子点荧光微球以及铕螯合物等无机颗粒的LFIA荧光探针虽然有其特定优势，但合成难度大、溶胶稳定性差且毒性强。相较而言，有机小分子荧光探针结构简单、易于合成且荧光发射信号强、动态范围宽，但普遍存在斯托克斯位移小、耐光漂白性差以及标记效率较低的劣势[32]。鉴于此，Seo等[32] 制备了一种具备大斯托克斯位移的单苯荧光分子，经由特制的流程将其以高度浓缩的状态包覆于聚苯乙烯微珠中，由此开发的LFIA同时弥补了上述两类探针的劣势。相较于普通荧光LFIA，采用该探针的LFIA平台可更有效地屏蔽临床样品中生物分子的非特异性杂光，同时其对新冠病毒S蛋白的检测也展现出了优良的性能，获得的检测限趋近于同时期性能相对最优的胶体金LFIA法[24,33-34]。
3.4 基于表面增强拉曼散射的侧流免疫层析
基于表面增强拉曼散射（SERS）的LFIA（SERS-LFIA）结合了SERS检测灵敏度高、特异性强和LFIA便携、快速、易操作的优势，已得到越来越广泛的应用，具有很大的发展前景[35]。Liu等[36] 将约3 nm的金纳米颗粒通过种子生长法包覆在四氧化三铁（Fe3O4）微球表面合成单分散的Fe3O4核-金壳磁性纳米颗粒（Fe3O4@Au MNPs）并使用拉曼报告分子二硝基苯甲酸［5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB］进行二次修饰以制备SERS探针，基于此开发了一种能在30 min内同时测定甲型H1N1流感病毒、新冠病毒，以及呼吸道合胞病毒的LFIA。该磁性SERS探针具备无需样品前处理即可直接捕获目标病毒的特质，可有效规避样品中杂质的干扰并提升敏感性。经过优化后，该SERS-LFIA对甲型H1N1流感病毒、新冠病毒以及呼吸道合胞病毒的检测限分别为85份/mL、8 pg/mL以及8 pg/mL，具有比常规胶体金LFIA高出约100倍的灵敏度。临床检验亦展现出良好的特异性、重复性。
4 总结与展望
基于LFIA的新冠病毒抗原快速检测技术具有较为突出的应用和研究价值，其中以传统经典的胶体金LFIA的使用最为广泛并且发展最为成熟。荧光免疫层析等基于其他标记物的LFIA也具备了一定程度的应用和研究进展并且有其性能方面的优势，但相关标记物的生产成本及难度普遍偏高，并且需要操作者通过一定的外接设备辅助判读结果，对于受限于供电或检测技能等资源匮乏区域的推广尤其尚存局限。值得注意的是基于量子点及SERS等新兴材料的LFIA展现了突出的性能并可能具备相当大的发展潜力。
利益冲突：无。
作者贡献：程雨飞提出研究设计，收集资料、撰写初稿、修改文章；张龙浩修改文章。
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，新冠病毒）感染引发的急性呼吸道传染性疾病，过去3年在全球范围导致了大规模持续流行。截至2023年3月10日，疫情已导致7.5亿人感染、686万人死亡，疫情防控工作任重道远[1]。为此，全球已开发了各类诊断方法监测新冠病毒的流行。逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）因其极高的灵敏度，是当前诊断新冠病毒感染的金标准。但在实际实施中该方法需要定点排队等候采样，且从取样至结果分析全流程须由专业医疗团队借助贵重仪器来完成，耗时长、成本高。便携式侧流免疫层析法（lateral flow immunoassay，LFIA）兼具较高灵敏度、快速、简便的特点，虽然不及RT-PCR敏感，但凭借特有的现场即时检测（point-of-care testing，POCT）能力，具有较为突出的应用和研究价值，在疫情中得到广泛运用。本文将对LFIA技术在新冠病毒抗原检测中的应用研究进行综述。
1 新型冠状病毒抗原快速检测
新冠病毒属于RNA病毒，呈球形或椭球形，直径100 nm左右。该病毒粒子包含1个约30 kb的单链核糖核酸（RNA）基因组，共编码29种蛋白，包括9种附属蛋白，16种非结构蛋白和4种结构蛋白。其中4种结构蛋白为包膜（membrane，M）蛋白、囊膜（envelope，E）蛋白、刺突（spike，S）蛋白，以及核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白。其中前三者均位于病毒蛋白外壳上，N蛋白则包裹RNA基因组形成核衣壳，并协助其在宿主细胞内转录和复制。值得注意的是N蛋白在不同新冠病毒株系中高度保守，更利于抗体结合避免脱靶，且在病毒感染细胞后表达量高，是较为理想的抗原检测靶标[2-4]。大多数抗原检测试剂盒是以检测N蛋白来表征新冠病毒的存在，以保证较高的检测敏感性、特异性和对病毒变异株较高的兼容性[5-6]。这些抗原检测一般使用针对N蛋白的单克隆抗体[7]。相对于多克隆抗体，单克隆抗体虽然制备成本更高，但其在复杂混合物样本中的高特异性优势十分明显，可有效减少新冠病毒抗原检测中的假阳性和交叉反应等影响检测质量的不确定性因素[7-8]。新冠病毒抗原检测主要采用快速、低成本、操作便携的LFIA技术[6]。非专业人士亦可自行操作，通过目视或借助少量便携式设备即可判读结果。
2 胶体金免疫层析技术
2.1 胶体金免疫层析技术原理
以胶体金纳米颗粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）为标记的LFIA技术是传统经典方法，目前仍被普遍采用，该方法化学稳定性及抗光解离性强，且在自然光下辨识度高[8-9]，从采样至可视化结果判读可在30 min内完成[10]。LFIA试剂条是由样品垫、结合垫、层析膜、吸收垫叠加于聚氯乙烯支撑底板上所组成的便携式卡型装置。样品垫为经过处理的玻璃纤维膜，用于快速吸收提取液（待检液）使其经由毛细管表面扩散作用流至结合垫。结合垫吸附了交联了AuNPs的抗体（金标抗体），可特异性识别新冠病毒抗原。层析膜通常为硝酸纤维素膜，其上依次固定了一条有另一种特异性结合新冠病毒抗原的抗体位于检测（test，T）线处，同时还有一种特异性结合金标抗体的抗体（质控抗体）位于更下游的质控（control，C）线处。吸收垫用于吸收剩余溶液以平衡层析膜两边压差，促使提取液沿下游持续定向流动。一般情况下检测人员使用尼绒拭子拭鼻腔（一般深入鼻道1～2 cm即可）获取呼吸道样品，将其溶于提取缓冲液中，并滴上数滴至样品孔（样品垫）上，并将试剂条静置平放以待显色。流过结合垫的提取液会带动金标抗体沿下游移动。若样品中含有新冠病毒，其抗原会同金标抗体特异性结合形成抗原-抗体免疫复合物，当到达T线区，此处固定的另一新冠特异性抗体通过不同表位与新冠抗原结合，形成抗体-抗原-抗体的夹心结构。随着捕获量增多，该处胶体金颗粒聚集并逐渐显现出红色。下游C线的质控抗体会识别过量的金标抗体进而显色，该处显色用于验证检测的有效性，不受样品中是否含新冠病毒的影响。尽管检测试剂的标记物及检测设备在不断更新，但新冠抗原LFIA一般都采用基于该“夹心法”的检测框架及程序[11-12]。
2.2 胶体金免疫层析技术的应用研究
传统胶体金LFIA的缺点是检测灵敏度相对较低，主要推荐用于病毒载量较高的感染者，该领域的研究主要围绕设计改进型的探针。胶体金纳米颗粒的光学性质受其形态影响较大，在一定条件下扩大颗粒尺寸或使用特定形貌的非球状颗粒均有助于增加其辨识性从而提高测试的敏感性[13-15]。金属离子在还原剂存在的情况下容易以胶体金为核心，以纳米壳层的形式层层生长进而不断扩大整体尺寸，并随之放大探针的比色信号。Panferov等[16] 比较了胶体金表面金原位沉积工艺、胶体金表面银原位沉积工艺，以及新型电蚀辅助金原位沉积工艺对新冠S蛋白受体结合域的LFIA检测性能的影响。三类工艺均有效提升了检测灵敏度，并且尤以胶体金表面金原位沉积法最为突出，较相同条件下常规胶体金LFIA的检测限（limit of detection，LoD）低出500倍左右。研究者基于该工艺开发了一种操作相对简便的LFIA检测方法，并采用了稳定性较高的试剂，可在8 min内完成检测。此外，铜作为一种廉价金属也受到了广泛关注，一些研究[17-19]利用胶体金纳米颗粒引导的探针表面铜积沉效应提升了部分LFIA方法的灵敏度。Peng等[20] 将此方案用于新冠病毒抗原的胶体金LFIA，在免疫反应后，检测试剂条被浸泡于含有二价铜离子（Cu2+）及其还原剂抗坏血酸钠（sodium ascorbate）的增强液中，铜离子以胶体金为核心聚集并还原成铜单质，进而以纳米壳层的形式积沉于探针表面，使得探针信号显著增强。实验经优化后对新冠病毒抗原达到了0.01 μg/mL的检测限，并可在20 min内完成检测。但该信号增强方案在实践中的推广应用尚存局限。由于铜与金的晶格常数相差较大，铜纳米壳层在探针表面的生长合成过程很容易因晶格失配而不可控。此外，试剂条的浸泡处理工艺易于使额外的铜离子吸附于硝酸纤维素膜上进而导致高背景或假阳性[21]。
在一定条件下，胶体金探针的吸光度会随着颗粒团聚的增多而增强，但该过程对颗粒间距的控制要求很高，例如在颗粒间距小于10 nm时所引发的等离激元耦合会导致等离子共振光谱红移继而降低可见光范围内的吸光度[22]。Oh等[22] 以一个吸附有链霉亲和素（streptavidin）的金纳米颗粒为核心交联多个吸附有生物素化的抗体（biotinylated antibodies）的金纳米颗粒，进而开发了一种具有约15 nm的恒定颗粒间距的胶体金探针，有效地在稳定显色光谱的基础上提升了整体比色信号。使用该探针构建的LFIA对新冠病毒抗原的检测限达到了比使用同等粒径大小的常规胶体金LFIA低出数倍的检测限，在其他冠状病毒抗原或流感病毒抗原的存在下亦显示出较好的特异性。
新冠病毒可与其他流感等呼吸系统疾病病毒共同流行并共同感染患者，进而对准确诊疗产生影响。由于新冠病毒与SARS冠状病毒（SARS-CoV-1）的N蛋白序列相似，现有新冠抗原检测试剂较易于对冠状病毒产生交叉反应[6]。由于目前并非冠状病毒流行期，新冠抗原试剂整体而言仍具有较高的特异性。即便如此，将待测抗原与其他来源抗原进行有效区分仍然十分重要[23]。鉴于此，Hristov等[24]以新冠病毒、SARS冠状病毒，以及能引发细支气管炎的人类冠状病毒HKU1的S蛋白为抗原检测靶标，结合相应抗体进行优化并基于在层析膜上设计多条相应检测线的LFIA试剂条，首次开发了一种能在30 min内在多组分抗原中同时测定新冠病毒、SARS冠状病毒和人类冠状病毒HKU1的LFIA。这类基于低成本即时检测平台的抗原鉴别技术的进展有助于对具备相似临床症状的呼吸道疾病进行加速诊断并且更好地评估患者风险。
3 基于其他标记物的侧流免疫层析技术
3.1 荧光微球标记免疫层析
荧光乳胶粒子受激发光源激发而发出荧光，粒度均一且稳定性高[25]。相较于胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法灵敏度高，探针稳定性好，且不易受自然光的干扰，但需要借助荧光免疫分析仪判读结果。荧光免疫层析已发展成常用的新冠病毒抗原快速检测手段之一[6]。在疫情暴发初期，Diao等[26]基于羧基化聚苯乙烯荧光探针构建了检测新冠病毒N蛋白的LFIA试剂条，使用荧光免疫分析仪读取结果，并通过检测100份健康鼻拭样本所获得的平均荧光信号强度（正负5个标准方差）来确立其阴性阈值（cut-off value）。研究者将其用于一批各医疗中心的239份疑似新冠感染样本并通过RT-PCR验证以评估性能。检测流程亦基于常规LFIA，通过鼻咽拭获得的样品经由缓冲液稀释后滴加100 μL于样品垫上，然后将试剂条静置平放，待10 min免疫反应后，将试剂条插入相应的荧光免疫分析仪的读取接口，分析仪即会自动检测信号强度并通过对比其芯片内置的截断值判读出阳性或阴性。该方法展示出较高的精确性并能较早地筛选出阳性，可用于更大范围的新冠抗原筛查。在另一项研究中，Zhang等[27] 基于荧光微球标记技术研制了一种抗原快速检测试剂条，对活化的新冠病毒滴度达到1 000 TCID50/mL，在健康对照和其他呼吸系统疾病患者中的特异性分别为100%和97%。此外，张赛等[28] 基于羧基荧光纳米粒子研制了一种LFIA，对热灭活新冠培养物的检测达1 600 TCID50/mL，对16类常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应，并且与临床诊断符合率较高。Mao等[29] 基于LFIA开发了一种通过p-甲苯磺酰（p-toluenesulfonyl）活化稀土荧光微球蛋白的方法，对抗体与荧光探针的交联效率进行了优化从而提升了对抗原的识别效率。免疫荧光层析试剂卡经优化后对新冠病毒抗原能达到0.01 ng/mL的检测限，具备高灵敏度、较好的便携性及相对快的反应速度。
3.2 量子点标记免疫层析
量子点作为一种新型荧光纳米材料已被用于LFIA系统中，其具有光稳定性好、激发光谱宽且分布连续、发射光谱窄以及可对信号强度进行量化等优势。但另一方面，其较小的颗粒直径尺寸（5～20 nm）及较差的生物相容性相当程度限制了大规模LFIA应用[30-31]。Han等[30] 通过将胶体金与量子点颗粒同时以单层纳米壳层的形式吸附于200 nm二氧化硅微球表面组装了一种既能进行常规可视化胶体金比色检测又可实施量子点荧光检测的双功能探针。单分散二氧化硅微球作为中心载体能有效维持探针在复合溶液中的稳定性，使样品无需前期处理即可被用于LFIA检测。使用者依据自身所处条件选择检测模式。吸附于二氧化硅表面的20 nm胶体金探针负责发出比色信号，适用于在资源匮乏的情形下对可疑样本进行快速可视化检测，而在有外接荧光分析仪等辅助设备的条件下，密集分布于胶体金颗粒间隙中的量子点被激发光源激发后发出荧光发射信号，从而可以实施更精确、灵敏度更高的抗原定量测定。该方法经优化后对新冠抗原比色检测的检测限达到了低于同时期常用的胶体金LFIA的10倍左右（量子点荧光检测为300倍左右）。随后的大规模临床测试进一步验证了其优异的特异性、精确性以及重复性。
3.3 有机分子标记免疫层析
基于荧光乳胶粒子、量子点荧光微球以及铕螯合物等无机颗粒的LFIA荧光探针虽然有其特定优势，但合成难度大、溶胶稳定性差且毒性强。相较而言，有机小分子荧光探针结构简单、易于合成且荧光发射信号强、动态范围宽，但普遍存在斯托克斯位移小、耐光漂白性差以及标记效率较低的劣势[32]。鉴于此，Seo等[32] 制备了一种具备大斯托克斯位移的单苯荧光分子，经由特制的流程将其以高度浓缩的状态包覆于聚苯乙烯微珠中，由此开发的LFIA同时弥补了上述两类探针的劣势。相较于普通荧光LFIA，采用该探针的LFIA平台可更有效地屏蔽临床样品中生物分子的非特异性杂光，同时其对新冠病毒S蛋白的检测也展现出了优良的性能，获得的检测限趋近于同时期性能相对最优的胶体金LFIA法[24,33-34]。
3.4 基于表面增强拉曼散射的侧流免疫层析
基于表面增强拉曼散射（SERS）的LFIA（SERS-LFIA）结合了SERS检测灵敏度高、特异性强和LFIA便携、快速、易操作的优势，已得到越来越广泛的应用，具有很大的发展前景[35]。Liu等[36] 将约3 nm的金纳米颗粒通过种子生长法包覆在四氧化三铁（Fe3O4）微球表面合成单分散的Fe3O4核-金壳磁性纳米颗粒（Fe3O4@Au MNPs）并使用拉曼报告分子二硝基苯甲酸［5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB］进行二次修饰以制备SERS探针，基于此开发了一种能在30 min内同时测定甲型H1N1流感病毒、新冠病毒，以及呼吸道合胞病毒的LFIA。该磁性SERS探针具备无需样品前处理即可直接捕获目标病毒的特质，可有效规避样品中杂质的干扰并提升敏感性。经过优化后，该SERS-LFIA对甲型H1N1流感病毒、新冠病毒以及呼吸道合胞病毒的检测限分别为85份/mL、8 pg/mL以及8 pg/mL，具有比常规胶体金LFIA高出约100倍的灵敏度。临床检验亦展现出良好的特异性、重复性。
4 总结与展望
基于LFIA的新冠病毒抗原快速检测技术具有较为突出的应用和研究价值，其中以传统经典的胶体金LFIA的使用最为广泛并且发展最为成熟。荧光免疫层析等基于其他标记物的LFIA也具备了一定程度的应用和研究进展并且有其性能方面的优势，但相关标记物的生产成本及难度普遍偏高，并且需要操作者通过一定的外接设备辅助判读结果，对于受限于供电或检测技能等资源匮乏区域的推广尤其尚存局限。值得注意的是基于量子点及SERS等新兴材料的LFIA展现了突出的性能并可能具备相当大的发展潜力。
利益冲突：无。
作者贡献：程雨飞提出研究设计，收集资料、撰写初稿、修改文章；张龙浩修改文章。