引用本文： 陈海宇, 郑富臻, 翁国星, 鲍家银, 黄杰, 严李程, 柯秋晴. 银杏内酯B对缺氧/复氧心肌细胞Caspase-3/PTEN/Akt通路及细胞增殖凋亡的影响. 中国胸心血管外科临床杂志, 2022, 29(12): 1647-1652. doi: 10.7507/1007-4848.202109047 复制
心肌梗死（myocardial infarction，MI）仍然是全球发病和死亡的主要原因，MI可因长期缺血缺氧而导致心肌损伤或死亡，尽管最近MI的治疗取得了进展，MI急性期的死亡率约为10%[1]。恢复血供（即再灌注）仍是目前MI的标准治疗方法，但越来越多的证据表明，再灌注后立即产生的自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）会诱导心肌细胞凋亡，加速心肌缺血-再灌注损伤的发生和发展[2]。因此，寻找有效的抗凋亡药物对心肌缺血-再灌注损伤的治疗是有益的。许多实验研究表明，多种天然产品对心血管疾病具有潜在的药理益处。银杏内酯B（ginkgolide B，GB）是银杏叶提取物，已被鉴定为一种多功能生物活性天然产物，可以抑制细胞凋亡、抗血小板聚集等多种作用，被广泛用于治疗心脑血管疾病，但其具体机制却不明确[3]。最近研究[4]表明，缺血-再灌注诱导心肌细胞凋亡，这是缺血性心脏病恶化的重要特征。因此，抑制心肌细胞凋亡可有效降低心肌缺血-再灌注损伤的程度。10号染色体缺失张力蛋白同源的磷酸酶基因（chromosome 10 deletion phosphatase-tension protein homologue，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路在各种生理过程中都起着至关重要的作用，通过调控氧化应激，对心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用[5]。Akt的激活导致下游效应分子糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化，这被认为是心脏保护的重要参与者[6]。因此，本研究探讨GB在心肌H9C2细胞抗缺氧/复氧诱导的细胞凋亡中的作用，并对GB发挥其功能的潜在分子机制进行了研究，为GB临床治疗缺血-再灌注提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
GB和卡维地洛（美国 Sigma 公司，纯度≥90%，批号：A606617、72965-09-3）；大鼠胚胎心肌H9C2细胞（中国科学院上海细胞库，批号：CM-1250）；DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基和胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：160044、160047、190045）；细胞计数试剂盒8 （cell count kit 8，CCK-8）（美国Amresco公司，规格：96T，批号：M8180-4）；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号：CA1020）； 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：E004-1-1、A020-2-2、A001-3-2）；2，7-二氯荧光黄双乙酸盐（2，7-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司，批号：175056）；PTEN、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和GADPH抗体（美国Santa Cruz公司，批号：SC-5182、SC-3967、SC-1818、SC-5497、SC-1573）；山羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：115-58-264）；HBS-1096B型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；BD垂直电泳仪和BD FACSCanto型流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像仪（美国UVP公司）。
1.2 细胞培养及实验分组
用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5% CO2条件下培养H9C2细胞，取对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、缺氧复氧组、GB低剂量组、GB高剂量组和卡维地洛组。对照组用无血清DMEM高糖培养基在37℃、5% CO2条件下培养28 h。其余各组用无血清DMEM无糖培养基在37℃、1% O2/5% CO2/94% N2的厌氧室中维持4 h，随后转移到无血清DMEM高糖培养基中，在37℃常氧条件下（5% CO2、95%空气）培养24 h[7]；在缺氧/复氧前1 h，GB低剂量组和GB高剂量组分别用终浓度为50 μmol/L和200 μmol/L的GB预处理，卡维地洛组用终浓度为10 μmol/L的卡维地洛预处理[8-9]。各组均重复6次。
1.3 CCK-8 法检测细胞增殖率
按1.2中的方法培养及干预细胞，在实验结束前4 h向培养板中加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h，用酶标仪测定吸光度值，计算细胞增殖率（细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值×100%），OD为光吸收值。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率
按1.2中的方法培养及干预细胞，用AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。
1.5 LDH、MDA和ROS水平的测定
按1.2中的方法培养及干预细胞，加入2 mL磷酸盐缓冲液，用细胞超声破碎仪处理30 s，12 000 g离心10 min，收集上清液，按试剂盒说明书检测细胞中LDH和MDA水平；采用DCFH-DA探针联合酶标仪法检测细胞内ROS水平。
1.6 Western blotting法检测PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平
按1.2中的方法培养及干预细胞，弃培养基，根据细胞量加入RIPA裂解液，裂解2 h；4℃、10 000 rpm，离心15 min，取上清，加入1/5体积的5×Buffer，沸水变性，电泳（每孔上样量为30 μg），将膜与PTEN（1∶300）、Akt（1∶200）、p-Akt（1∶500）、Caspase-3（1∶400）和GADPH（1∶1000）抗体进行孵育，4℃过夜，将二抗（1∶5 000）在室温下孵育30 min。显色，采集图像进行分析，以GADPH作为内参。
1.7 统计学分析
正态分布的计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK-q检验，P≤0.05为差异有统计学意义，统计软件为SPSS 23.0。
2 结果
2.1 GB对H9C2细胞增殖和凋亡的影响
与对照组比较，其余各组H9C2细胞增殖率降低、细胞凋亡率增加（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，各GB剂量组和卡维地洛组H9C2细胞增殖率增加，细胞凋亡率降低，各GB剂量组呈剂量依赖性，但GB的作用强度不如卡维地洛（P<0.05）；见表1和图1。
表1
GB对H9C2细胞增殖和凋亡的影响（
）
图1
GB对H9C2细胞增殖和凋亡影响的流式细胞图
a：对照组；b：缺氧复氧组；C：GB 低剂量组；D：GB 高剂量组；E：卡维地洛组；GB：银杏内酯 B
2.2 GB对H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平的影响
与对照组比较，其余各组H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平升高（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，各GB剂量组和卡维地洛组H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平降低，各GB剂量组呈剂量依赖性，但GB的作用强度不如卡维地洛（P<0.05）；见表2和图2。
表2
GB对H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平的影响（
）
图2
GB对H9C2细胞中ROS水平的影响（DCFH-DA 染色，×400）
a：对照组；b：缺氧复氧组；c：GB低剂量组；d：GB高剂量组；e：卡维地洛组；GB：银杏内酯 B；ROS：活性氧
2.3 GB对H9C2细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影响
与对照组比较，其余各组H9C2细胞中PTEN、Akt和p-Akt水平降低，Caspase-3水平升高（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，各GB剂量组和卡维地洛组H9C2细胞中PTEN、Akt和p-Akt水平升高，Caspase-3水平降低，各GB剂量组呈剂量依赖性，但GB的作用强度不如卡维地洛（P<0.05）；见表3和图3。
表3
GB对H9C2细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影响（
，与GADPH的比值）
图3
GB对H9C2细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平影响的蛋白印迹图
a：对照组；b：缺氧复氧组；c：GB低剂量组；d：GB高剂量组；e：卡维地洛组；GB：银杏内酯 B；PTEN：10号染色体缺失张力蛋白同源的磷酸酶基因；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化 Akt；Caspase-3：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3
3 讨论
缺血性心脏病是一种死亡率较高的疾病，严重危害人类的健康，给患者以及家庭、社会带来沉重的经济负担，通常采用溶栓等手段，迅速恢复患者冠状动脉血液的循环流动是临床治疗缺血性心脏病的关键[10]。研究[11]发现，血流重新灌注缺血心肌组织后会使心脏产生新的损伤—缺血-再灌注损伤。心肌缺血-再灌注损伤与细胞增殖、凋亡以及氧化损伤、心肌线粒体能量代谢等有关[12]。因此，寻找抗缺氧/复氧心肌细胞凋亡及氧化损伤的药物对改善患者预后至关重要。
近年来，GB对器官缺血-再灌注损伤的治疗作用引起了研究者的关注。GB通过抗炎、抗氧化应激和抗凋亡途径发挥治疗作用。有研究[13]已证明，GB可减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤，但其作用机制尚不清楚。心肌缺血-再灌注损伤的病理生理机制与许多因素有关，例如大量的自由基产生、细胞内钙超载、氧化应激增加和细胞凋亡等。目前，更多研究[14]显示，缺血-再灌注诱导的细胞损伤的关键事件是细胞凋亡。因此，寻找可以抑制心肌细胞凋亡的药物对于预防缺血-再灌注诱导的细胞损伤很重要。卡维地洛是第三代β受体阻滞剂，能显著改善MI、心力衰竭患者的预后，但其减轻心肌细胞缺血-再灌注损伤的分子机制尚不清楚[15]。本研究结果显示，GB改善了心肌缺氧/复氧损伤后的细胞活力，并抑制了心肌缺血-再灌注损伤后H9C2细胞凋亡。虽然其作用强度不如卡维他洛，但作为一种新药开发有积极的意义。
心肌缺氧涉及氧化应激，抗氧化剂有助于限制缺血-再灌注期间的心脏损伤。MDA和LDH是过氧化的多不饱和脂肪酸的分解产物，主要被视为脂质过氧化的指标。MDA和LDH水平已用于评估缺血-再灌注心肌的氧损伤[16]。此外，ROS被称为细胞内信号分子，在引起凋亡性细胞死亡中起着重要作用。研究[17]表明，缺血-再灌注可以诱导ROS的产生和氧化应激。然后，ROS与细胞膜脂质相互作用并产生MDA，从而损害心脏功能并诱发心肌细胞损伤。因此，抑制ROS形成的药物对再灌注损伤具有心脏保护作用。本研究结果显示，GB预处理可显著降低心肌缺氧/复氧损伤后H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平。这些数据表明，GB的心肌保护作用部分归因于其抗氧化作用。
凋亡是心肌细胞缺血-再灌注损伤的标志。氧化应激的特征在于过量的ROS产生。如果持续存在氧化损伤，则可能会对细胞造成不可逆转的损害，最终导致细胞凋亡[18]。B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族参与了缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。Bcl-2是一种有效的凋亡抑制剂，可抑制线粒体的降解以及随后的细胞色素C（Cytochrome C，CytC）释放，促进Caspase-3活化，最终导致凋亡性细胞死亡[19]。本研究结果显示，GB预处理可显著降低缺氧/复氧诱导的H9C2细胞中Caspase-3表达。因此，GB的抗凋亡特性可能有助于对抗心肌缺血-再灌注损伤。
PTEN/Akt通路的激活在减轻心肌缺血-再灌注损伤中起关键作用。研究[20]发现，PTEN在心肌重塑、心肌纤维化、心肌肥大和心肌缺血-再灌注损伤中起重要作用。PTEN通过磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）来调控Akt活性，从而通过PI3K/Akt途径调控生存信号[21]。PTEN过表达抑制细胞G1期停滞，促进细胞增殖[22]。此外，PTEN诱导凋亡的另一潜在机制是PTEN介导的凋亡伴随Caspase-3活化[23]。Akt的激活导致下游效应分子GSK-3β在Ser 9上的磷酸化，这被认为是心脏保护的重要参与者。Akt的激活可能通过激活下游底物（Bcl-2）来产生抗凋亡功能[24]。研究[25]发现，紫草素对肝脏缺血-再灌注损伤的有益作用是通过激活PTEN/Akt通路传导来实现的。本研究结果显示，GB预处理可激活缺氧/复氧诱导H9C2细胞的Caspase-3/PTEN/Akt通路。
综上所述，GB通过激活Caspase-3/PTEN/Akt通路，降低氧化应激和细胞凋亡，促进细胞增殖来减轻心肌缺血-再灌注损伤，为GB治疗心肌缺血-再灌注损伤提供理论依据。但由于缺血-再灌注损伤的调控机制是一个网络系统，Caspase-3/PTEN/Akt通路可能只是其中一条，可能还存在其它信号通路进行调控，本结论还需进一步研究。
利益冲突：无。
作者贡献：陈海宇、郑富臻负责研究设计，获取、分析或解释研究数据；翁国星、鲍家银负责研究设计；黄杰、严李程获取、分析或解释研究数据；柯秋晴负责研究设计，获取、分析或解释研究数据，全面负责本文，在投稿、同行评议及出版过程中主要负责与期刊联系；陈海宇、郑富臻、翁国星、鲍家银、黄杰、严李程、柯秋晴负责起草研究论文及对重要的知识内容进行关键性修改；所有作者对文章进行最终定稿，同意对研究工作全面负责，确保与论文任何部分的准确性或诚信有关的质疑得到恰当的调查和解决。
心肌梗死（myocardial infarction，MI）仍然是全球发病和死亡的主要原因，MI可因长期缺血缺氧而导致心肌损伤或死亡，尽管最近MI的治疗取得了进展，MI急性期的死亡率约为10%[1]。恢复血供（即再灌注）仍是目前MI的标准治疗方法，但越来越多的证据表明，再灌注后立即产生的自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）会诱导心肌细胞凋亡，加速心肌缺血-再灌注损伤的发生和发展[2]。因此，寻找有效的抗凋亡药物对心肌缺血-再灌注损伤的治疗是有益的。许多实验研究表明，多种天然产品对心血管疾病具有潜在的药理益处。银杏内酯B（ginkgolide B，GB）是银杏叶提取物，已被鉴定为一种多功能生物活性天然产物，可以抑制细胞凋亡、抗血小板聚集等多种作用，被广泛用于治疗心脑血管疾病，但其具体机制却不明确[3]。最近研究[4]表明，缺血-再灌注诱导心肌细胞凋亡，这是缺血性心脏病恶化的重要特征。因此，抑制心肌细胞凋亡可有效降低心肌缺血-再灌注损伤的程度。10号染色体缺失张力蛋白同源的磷酸酶基因（chromosome 10 deletion phosphatase-tension protein homologue，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路在各种生理过程中都起着至关重要的作用，通过调控氧化应激，对心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用[5]。Akt的激活导致下游效应分子糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化，这被认为是心脏保护的重要参与者[6]。因此，本研究探讨GB在心肌H9C2细胞抗缺氧/复氧诱导的细胞凋亡中的作用，并对GB发挥其功能的潜在分子机制进行了研究，为GB临床治疗缺血-再灌注提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
GB和卡维地洛（美国 Sigma 公司，纯度≥90%，批号：A606617、72965-09-3）；大鼠胚胎心肌H9C2细胞（中国科学院上海细胞库，批号：CM-1250）；DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基和胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：160044、160047、190045）；细胞计数试剂盒8 （cell count kit 8，CCK-8）（美国Amresco公司，规格：96T，批号：M8180-4）；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号：CA1020）； 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：E004-1-1、A020-2-2、A001-3-2）；2，7-二氯荧光黄双乙酸盐（2，7-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司，批号：175056）；PTEN、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和GADPH抗体（美国Santa Cruz公司，批号：SC-5182、SC-3967、SC-1818、SC-5497、SC-1573）；山羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：115-58-264）；HBS-1096B型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；BD垂直电泳仪和BD FACSCanto型流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像仪（美国UVP公司）。
1.2 细胞培养及实验分组
用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5% CO2条件下培养H9C2细胞，取对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、缺氧复氧组、GB低剂量组、GB高剂量组和卡维地洛组。对照组用无血清DMEM高糖培养基在37℃、5% CO2条件下培养28 h。其余各组用无血清DMEM无糖培养基在37℃、1% O2/5% CO2/94% N2的厌氧室中维持4 h，随后转移到无血清DMEM高糖培养基中，在37℃常氧条件下（5% CO2、95%空气）培养24 h[7]；在缺氧/复氧前1 h，GB低剂量组和GB高剂量组分别用终浓度为50 μmol/L和200 μmol/L的GB预处理，卡维地洛组用终浓度为10 μmol/L的卡维地洛预处理[8-9]。各组均重复6次。
1.3 CCK-8 法检测细胞增殖率
按1.2中的方法培养及干预细胞，在实验结束前4 h向培养板中加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h，用酶标仪测定吸光度值，计算细胞增殖率（细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值×100%），OD为光吸收值。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率
按1.2中的方法培养及干预细胞，用AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。
1.5 LDH、MDA和ROS水平的测定
按1.2中的方法培养及干预细胞，加入2 mL磷酸盐缓冲液，用细胞超声破碎仪处理30 s，12 000 g离心10 min，收集上清液，按试剂盒说明书检测细胞中LDH和MDA水平；采用DCFH-DA探针联合酶标仪法检测细胞内ROS水平。
1.6 Western blotting法检测PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平
按1.2中的方法培养及干预细胞，弃培养基，根据细胞量加入RIPA裂解液，裂解2 h；4℃、10 000 rpm，离心15 min，取上清，加入1/5体积的5×Buffer，沸水变性，电泳（每孔上样量为30 μg），将膜与PTEN（1∶300）、Akt（1∶200）、p-Akt（1∶500）、Caspase-3（1∶400）和GADPH（1∶1000）抗体进行孵育，4℃过夜，将二抗（1∶5 000）在室温下孵育30 min。显色，采集图像进行分析，以GADPH作为内参。
1.7 统计学分析
正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK-q检验，P≤0.05为差异有统计学意义，统计软件为SPSS 23.0。
2 结果
2.1 GB对H9C2细胞增殖和凋亡的影响
与对照组比较，其余各组H9C2细胞增殖率降低、细胞凋亡率增加（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，各GB剂量组和卡维地洛组H9C2细胞增殖率增加，细胞凋亡率降低，各GB剂量组呈剂量依赖性，但GB的作用强度不如卡维地洛（P<0.05）；见表1和图1。
表1
GB对H9C2细胞增殖和凋亡的影响（）
图1
GB对H9C2细胞增殖和凋亡影响的流式细胞图
a：对照组；b：缺氧复氧组；C：GB 低剂量组；D：GB 高剂量组；E：卡维地洛组；GB：银杏内酯 B
2.2 GB对H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平的影响
与对照组比较，其余各组H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平升高（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，各GB剂量组和卡维地洛组H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平降低，各GB剂量组呈剂量依赖性，但GB的作用强度不如卡维地洛（P<0.05）；见表2和图2。
表2
GB对H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平的影响（）
图2
GB对H9C2细胞中ROS水平的影响（DCFH-DA 染色，×400）
a：对照组；b：缺氧复氧组；c：GB低剂量组；d：GB高剂量组；e：卡维地洛组；GB：银杏内酯 B；ROS：活性氧
2.3 GB对H9C2细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影响
与对照组比较，其余各组H9C2细胞中PTEN、Akt和p-Akt水平降低，Caspase-3水平升高（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，各GB剂量组和卡维地洛组H9C2细胞中PTEN、Akt和p-Akt水平升高，Caspase-3水平降低，各GB剂量组呈剂量依赖性，但GB的作用强度不如卡维地洛（P<0.05）；见表3和图3。
表3
GB对H9C2细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影响（，与GADPH的比值）
图3
GB对H9C2细胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平影响的蛋白印迹图
a：对照组；b：缺氧复氧组；c：GB低剂量组；d：GB高剂量组；e：卡维地洛组；GB：银杏内酯 B；PTEN：10号染色体缺失张力蛋白同源的磷酸酶基因；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化 Akt；Caspase-3：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3
3 讨论
缺血性心脏病是一种死亡率较高的疾病，严重危害人类的健康，给患者以及家庭、社会带来沉重的经济负担，通常采用溶栓等手段，迅速恢复患者冠状动脉血液的循环流动是临床治疗缺血性心脏病的关键[10]。研究[11]发现，血流重新灌注缺血心肌组织后会使心脏产生新的损伤—缺血-再灌注损伤。心肌缺血-再灌注损伤与细胞增殖、凋亡以及氧化损伤、心肌线粒体能量代谢等有关[12]。因此，寻找抗缺氧/复氧心肌细胞凋亡及氧化损伤的药物对改善患者预后至关重要。
近年来，GB对器官缺血-再灌注损伤的治疗作用引起了研究者的关注。GB通过抗炎、抗氧化应激和抗凋亡途径发挥治疗作用。有研究[13]已证明，GB可减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤，但其作用机制尚不清楚。心肌缺血-再灌注损伤的病理生理机制与许多因素有关，例如大量的自由基产生、细胞内钙超载、氧化应激增加和细胞凋亡等。目前，更多研究[14]显示，缺血-再灌注诱导的细胞损伤的关键事件是细胞凋亡。因此，寻找可以抑制心肌细胞凋亡的药物对于预防缺血-再灌注诱导的细胞损伤很重要。卡维地洛是第三代β受体阻滞剂，能显著改善MI、心力衰竭患者的预后，但其减轻心肌细胞缺血-再灌注损伤的分子机制尚不清楚[15]。本研究结果显示，GB改善了心肌缺氧/复氧损伤后的细胞活力，并抑制了心肌缺血-再灌注损伤后H9C2细胞凋亡。虽然其作用强度不如卡维他洛，但作为一种新药开发有积极的意义。
心肌缺氧涉及氧化应激，抗氧化剂有助于限制缺血-再灌注期间的心脏损伤。MDA和LDH是过氧化的多不饱和脂肪酸的分解产物，主要被视为脂质过氧化的指标。MDA和LDH水平已用于评估缺血-再灌注心肌的氧损伤[16]。此外，ROS被称为细胞内信号分子，在引起凋亡性细胞死亡中起着重要作用。研究[17]表明，缺血-再灌注可以诱导ROS的产生和氧化应激。然后，ROS与细胞膜脂质相互作用并产生MDA，从而损害心脏功能并诱发心肌细胞损伤。因此，抑制ROS形成的药物对再灌注损伤具有心脏保护作用。本研究结果显示，GB预处理可显著降低心肌缺氧/复氧损伤后H9C2细胞中LDH、MDA和ROS水平。这些数据表明，GB的心肌保护作用部分归因于其抗氧化作用。
凋亡是心肌细胞缺血-再灌注损伤的标志。氧化应激的特征在于过量的ROS产生。如果持续存在氧化损伤，则可能会对细胞造成不可逆转的损害，最终导致细胞凋亡[18]。B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族参与了缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。Bcl-2是一种有效的凋亡抑制剂，可抑制线粒体的降解以及随后的细胞色素C（Cytochrome C，CytC）释放，促进Caspase-3活化，最终导致凋亡性细胞死亡[19]。本研究结果显示，GB预处理可显著降低缺氧/复氧诱导的H9C2细胞中Caspase-3表达。因此，GB的抗凋亡特性可能有助于对抗心肌缺血-再灌注损伤。
PTEN/Akt通路的激活在减轻心肌缺血-再灌注损伤中起关键作用。研究[20]发现，PTEN在心肌重塑、心肌纤维化、心肌肥大和心肌缺血-再灌注损伤中起重要作用。PTEN通过磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）来调控Akt活性，从而通过PI3K/Akt途径调控生存信号[21]。PTEN过表达抑制细胞G1期停滞，促进细胞增殖[22]。此外，PTEN诱导凋亡的另一潜在机制是PTEN介导的凋亡伴随Caspase-3活化[23]。Akt的激活导致下游效应分子GSK-3β在Ser 9上的磷酸化，这被认为是心脏保护的重要参与者。Akt的激活可能通过激活下游底物（Bcl-2）来产生抗凋亡功能[24]。研究[25]发现，紫草素对肝脏缺血-再灌注损伤的有益作用是通过激活PTEN/Akt通路传导来实现的。本研究结果显示，GB预处理可激活缺氧/复氧诱导H9C2细胞的Caspase-3/PTEN/Akt通路。
综上所述，GB通过激活Caspase-3/PTEN/Akt通路，降低氧化应激和细胞凋亡，促进细胞增殖来减轻心肌缺血-再灌注损伤，为GB治疗心肌缺血-再灌注损伤提供理论依据。但由于缺血-再灌注损伤的调控机制是一个网络系统，Caspase-3/PTEN/Akt通路可能只是其中一条，可能还存在其它信号通路进行调控，本结论还需进一步研究。
利益冲突：无。
作者贡献：陈海宇、郑富臻负责研究设计，获取、分析或解释研究数据；翁国星、鲍家银负责研究设计；黄杰、严李程获取、分析或解释研究数据；柯秋晴负责研究设计，获取、分析或解释研究数据，全面负责本文，在投稿、同行评议及出版过程中主要负责与期刊联系；陈海宇、郑富臻、翁国星、鲍家银、黄杰、严李程、柯秋晴负责起草研究论文及对重要的知识内容进行关键性修改；所有作者对文章进行最终定稿，同意对研究工作全面负责，确保与论文任何部分的准确性或诚信有关的质疑得到恰当的调查和解决。
